高效液相法測定大黃結(jié)康片中大黃素和大黃酚的含量

李娜+++王天婧

摘 要：目的：建立高效液相色譜法測定大黃結(jié)康片中大黃素和大黃酚的含量。方法：采用高效液相色譜法；色譜柱為ODS-C18柱（4.6mm×150mm）流速1.0ml/min，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15），檢測波長在254nm。結(jié)果：此方法線性關(guān)系良好，大黃素的線性范圍為0.192～0.960ug （r=0.9997）、大黃酚的線性范圍為0.416～2.080ug（r=0.9998），大黃素和大黃酚與其制劑的其它組分可完全分離其平均回收率為98.92%，RSD為1.97%，（n=5）。結(jié)論：本法簡單、準確，重現(xiàn)性良好，可用于大黃結(jié)康片中大黃素和大黃酚的總量測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；大黃結(jié)康片；大黃素；大黃酚

大黃結(jié)康片是由大黃、莪術(shù)等七味中藥組成的復(fù)方制劑。具有活血祛瘀，通絡(luò)散結(jié)之功效，其中大黃的藥理作用研究主要集中在蒽醌類化合物，有效成分為恩醌類衍生物，如大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等[1]。經(jīng)多年臨床應(yīng)用，對手術(shù)后血瘀癥有較好療效[2]。為有效控制其質(zhì)量，我們選擇大黃中大黃素和大黃酚總量作為指標，建立了HPLC測定法[3-5]，其實驗結(jié)果準確，重現(xiàn)好。

1 儀器、試劑及樣品

日本島津LC-10AT高效液相色譜儀，SPD-10A紫外可見檢測器，WDL-95工作站；CSF-1A超聲波發(fā)生器（上海超聲波儀器廠生產(chǎn)）；MA260S型電子分析天平（上海第二天平儀器廠）；索氏提取器。甲醇為色譜純；磷酸、氯仿、硫酸均為分析純。大黃素、大黃酚對照品，由中國藥品生物制品檢定所提供。陰性樣品均按樣品方法制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6]

色譜柱ODS-C18柱4.6mm×150mm，流速1ml/min，柱溫30℃，檢測波長254nm，流動相甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）。

2.2 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物約0.4001g，精密稱定，置50ml錐形瓶中，精密加甲醇25ml稱定重量，回流提取30分鐘，在稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)慮液5ml，置50ml圓底燒瓶中，揮去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10ml，超聲處理5min，再加氯仿10ml，加熱回流1小時，冷卻，移至分液漏斗中，用少量氯仿，洗滌容器，并入分液漏斗中，分取氯仿層，酸液用氯仿提取三次，每次約10ml，合并氯仿液，揮去氯仿，殘渣加甲醇使溶解，移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45um）慮過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系的確定

精密稱取大黃素對照品4.8mg，大黃酚對照品5.2mg，分別置于50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取大黃素溶液1.0ml、大黃酚溶液2.0ml，置同一25ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1ml含大黃素38.4ug，含大黃酚83.2ug的溶液，精密吸取此溶液5、10、15、20、25ul，分別注入高效液相色譜儀，測定，以進樣量對峰面積作圖。大黃素回歸方程為Y=4018266.46X-5028.7，r=0.9997；大黃酚回歸方程為y=5653247.6x-12000.3，r=0.9998。表明大黃素在0.192ug-0.960ug范圍內(nèi)，大黃酚在0.416ug-2.080ug范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 樣品含量測定

取不同批號供試品3批，按上述方法制備、測定、計算，結(jié)果見表1，HPLC圖見圖1。

2.5 空白實驗

按處方比例及工藝自制不含大黃的空白樣品，按供試品溶液的制備方法制備、上述條件測定。結(jié)果表明處方中其它藥材不干擾大黃素、大黃酚總量的測定。

2.6 精密度試驗

取供試品溶液相同量，重復(fù)進樣5次，測得大黃素和大黃酚總量的相對標準偏差RSD=0.597%，測定結(jié)果見表2。

RSD=0.597%

2.7 重現(xiàn)性試驗

取批號為20090602的大黃結(jié)康片樣品5份，按前述方法制備供試品溶液，并測定大黃素和大黃酚的總量，測定結(jié)果見表3。

RSD=1.79%

2.8 回收率試驗

精密稱取大黃素和大黃酚對照品適量，加入到已測知大黃素和大黃酚總量的樣品中，按前述方法操作，制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定，計算回收率，測定結(jié)果見表4。

RSD=1.49%

3 討論

3.1 分別取大黃素和大黃酚對照品溶液在200-600nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果大黃素在254nm、287nm、429nm波長處均有最大吸收，兩者均在254nm、289nm、438nm，大黃酚在254nm、287nm、429nm波長處均有最大吸收，兩者均在254nm波長處吸收最大，靈敏度高，可同時測定大黃素和大黃酚的含量，故選擇測定波長為254nm，基線穩(wěn)定，分離效果好。

3.2 按處方和工藝制備不含大黃的陰性對照樣品，但供試液方法配制并按上述色譜條件測定，表明陰性對照液不干擾大黃素和大黃酚總量的測定。

3.3 本實驗建立的方法，參考中國藥典（2000年版一部），實驗證明，本法靈敏度高，重現(xiàn)性好，其平均回收率為98.92%，可為大黃結(jié)康片質(zhì)量控制提供一個有效質(zhì)控指標。

參考文獻

[1]江蘇新醫(yī)學院編.中藥大詞典.上?？茖W技術(shù)出版社[M].1986年.

[2]薛漓.HPLC法測定痔瘡片中大黃素和大黃酚的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學，2003，20（5）：404.

[3]陳勇，李耀華，陳新.HPLC法測定益肝口服液中大黃素和大黃酚含量的研究[J].中醫(yī)藥學刊，2003，21（8）：1334.

[4]趙莉，晁若冰.HPLC法測定大黃通便膠囊中大黃素和大黃酚[J].華西藥學雜志，2003，18（4）：283.

[5]許乾麗，茅向軍.HPLC法測定座瘡愈中大黃素、大黃酚的含量測定[J].中國中藥雜志，2003.28（1）：85.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].2000年版一部18頁.

摘 要：目的：建立高效液相色譜法測定大黃結(jié)康片中大黃素和大黃酚的含量。方法：采用高效液相色譜法；色譜柱為ODS-C18柱（4.6mm×150mm）流速1.0ml/min，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15），檢測波長在254nm。結(jié)果：此方法線性關(guān)系良好，大黃素的線性范圍為0.192～0.960ug （r=0.9997）、大黃酚的線性范圍為0.416～2.080ug（r=0.9998），大黃素和大黃酚與其制劑的其它組分可完全分離其平均回收率為98.92%，RSD為1.97%，（n=5）。結(jié)論：本法簡單、準確，重現(xiàn)性良好，可用于大黃結(jié)康片中大黃素和大黃酚的總量測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；大黃結(jié)康片；大黃素；大黃酚

大黃結(jié)康片是由大黃、莪術(shù)等七味中藥組成的復(fù)方制劑。具有活血祛瘀，通絡(luò)散結(jié)之功效，其中大黃的藥理作用研究主要集中在蒽醌類化合物，有效成分為恩醌類衍生物，如大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等[1]。經(jīng)多年臨床應(yīng)用，對手術(shù)后血瘀癥有較好療效[2]。為有效控制其質(zhì)量，我們選擇大黃中大黃素和大黃酚總量作為指標，建立了HPLC測定法[3-5]，其實驗結(jié)果準確，重現(xiàn)好。

1 儀器、試劑及樣品

日本島津LC-10AT高效液相色譜儀，SPD-10A紫外可見檢測器，WDL-95工作站；CSF-1A超聲波發(fā)生器（上海超聲波儀器廠生產(chǎn)）；MA260S型電子分析天平（上海第二天平儀器廠）；索氏提取器。甲醇為色譜純；磷酸、氯仿、硫酸均為分析純。大黃素、大黃酚對照品，由中國藥品生物制品檢定所提供。陰性樣品均按樣品方法制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6]

色譜柱ODS-C18柱4.6mm×150mm，流速1ml/min，柱溫30℃，檢測波長254nm，流動相甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）。

2.2 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物約0.4001g，精密稱定，置50ml錐形瓶中，精密加甲醇25ml稱定重量，回流提取30分鐘，在稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)慮液5ml，置50ml圓底燒瓶中，揮去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10ml，超聲處理5min，再加氯仿10ml，加熱回流1小時，冷卻，移至分液漏斗中，用少量氯仿，洗滌容器，并入分液漏斗中，分取氯仿層，酸液用氯仿提取三次，每次約10ml，合并氯仿液，揮去氯仿，殘渣加甲醇使溶解，移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45um）慮過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系的確定

精密稱取大黃素對照品4.8mg，大黃酚對照品5.2mg，分別置于50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取大黃素溶液1.0ml、大黃酚溶液2.0ml，置同一25ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1ml含大黃素38.4ug，含大黃酚83.2ug的溶液，精密吸取此溶液5、10、15、20、25ul，分別注入高效液相色譜儀，測定，以進樣量對峰面積作圖。大黃素回歸方程為Y=4018266.46X-5028.7，r=0.9997；大黃酚回歸方程為y=5653247.6x-12000.3，r=0.9998。表明大黃素在0.192ug-0.960ug范圍內(nèi)，大黃酚在0.416ug-2.080ug范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 樣品含量測定

取不同批號供試品3批，按上述方法制備、測定、計算，結(jié)果見表1，HPLC圖見圖1。

2.5 空白實驗

按處方比例及工藝自制不含大黃的空白樣品，按供試品溶液的制備方法制備、上述條件測定。結(jié)果表明處方中其它藥材不干擾大黃素、大黃酚總量的測定。

2.6 精密度試驗

取供試品溶液相同量，重復(fù)進樣5次，測得大黃素和大黃酚總量的相對標準偏差RSD=0.597%，測定結(jié)果見表2。

RSD=0.597%

2.7 重現(xiàn)性試驗

取批號為20090602的大黃結(jié)康片樣品5份，按前述方法制備供試品溶液，并測定大黃素和大黃酚的總量，測定結(jié)果見表3。

RSD=1.79%

2.8 回收率試驗

精密稱取大黃素和大黃酚對照品適量，加入到已測知大黃素和大黃酚總量的樣品中，按前述方法操作，制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定，計算回收率，測定結(jié)果見表4。

RSD=1.49%

3 討論

3.1 分別取大黃素和大黃酚對照品溶液在200-600nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果大黃素在254nm、287nm、429nm波長處均有最大吸收，兩者均在254nm、289nm、438nm，大黃酚在254nm、287nm、429nm波長處均有最大吸收，兩者均在254nm波長處吸收最大，靈敏度高，可同時測定大黃素和大黃酚的含量，故選擇測定波長為254nm，基線穩(wěn)定，分離效果好。

3.2 按處方和工藝制備不含大黃的陰性對照樣品，但供試液方法配制并按上述色譜條件測定，表明陰性對照液不干擾大黃素和大黃酚總量的測定。

3.3 本實驗建立的方法，參考中國藥典（2000年版一部），實驗證明，本法靈敏度高，重現(xiàn)性好，其平均回收率為98.92%，可為大黃結(jié)康片質(zhì)量控制提供一個有效質(zhì)控指標。

參考文獻

[1]江蘇新醫(yī)學院編.中藥大詞典.上海科學技術(shù)出版社[M].1986年.

[2]薛漓.HPLC法測定痔瘡片中大黃素和大黃酚的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學，2003，20（5）：404.

[3]陳勇，李耀華，陳新.HPLC法測定益肝口服液中大黃素和大黃酚含量的研究[J].中醫(yī)藥學刊，2003，21（8）：1334.

[4]趙莉，晁若冰.HPLC法測定大黃通便膠囊中大黃素和大黃酚[J].華西藥學雜志，2003，18（4）：283.

[5]許乾麗，茅向軍.HPLC法測定座瘡愈中大黃素、大黃酚的含量測定[J].中國中藥雜志，2003.28（1）：85.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].2000年版一部18頁.

摘 要：目的：建立高效液相色譜法測定大黃結(jié)康片中大黃素和大黃酚的含量。方法：采用高效液相色譜法；色譜柱為ODS-C18柱（4.6mm×150mm）流速1.0ml/min，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15），檢測波長在254nm。結(jié)果：此方法線性關(guān)系良好，大黃素的線性范圍為0.192～0.960ug （r=0.9997）、大黃酚的線性范圍為0.416～2.080ug（r=0.9998），大黃素和大黃酚與其制劑的其它組分可完全分離其平均回收率為98.92%，RSD為1.97%，（n=5）。結(jié)論：本法簡單、準確，重現(xiàn)性良好，可用于大黃結(jié)康片中大黃素和大黃酚的總量測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；大黃結(jié)康片；大黃素；大黃酚

大黃結(jié)康片是由大黃、莪術(shù)等七味中藥組成的復(fù)方制劑。具有活血祛瘀，通絡(luò)散結(jié)之功效，其中大黃的藥理作用研究主要集中在蒽醌類化合物，有效成分為恩醌類衍生物，如大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等[1]。經(jīng)多年臨床應(yīng)用，對手術(shù)后血瘀癥有較好療效[2]。為有效控制其質(zhì)量，我們選擇大黃中大黃素和大黃酚總量作為指標，建立了HPLC測定法[3-5]，其實驗結(jié)果準確，重現(xiàn)好。

1 儀器、試劑及樣品

日本島津LC-10AT高效液相色譜儀，SPD-10A紫外可見檢測器，WDL-95工作站；CSF-1A超聲波發(fā)生器（上海超聲波儀器廠生產(chǎn)）；MA260S型電子分析天平（上海第二天平儀器廠）；索氏提取器。甲醇為色譜純；磷酸、氯仿、硫酸均為分析純。大黃素、大黃酚對照品，由中國藥品生物制品檢定所提供。陰性樣品均按樣品方法制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[6]

色譜柱ODS-C18柱4.6mm×150mm，流速1ml/min，柱溫30℃，檢測波長254nm，流動相甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）。

2.2 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物約0.4001g，精密稱定，置50ml錐形瓶中，精密加甲醇25ml稱定重量，回流提取30分鐘，在稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)慮液5ml，置50ml圓底燒瓶中，揮去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10ml，超聲處理5min，再加氯仿10ml，加熱回流1小時，冷卻，移至分液漏斗中，用少量氯仿，洗滌容器，并入分液漏斗中，分取氯仿層，酸液用氯仿提取三次，每次約10ml，合并氯仿液，揮去氯仿，殘渣加甲醇使溶解，移至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45um）慮過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系的確定

精密稱取大黃素對照品4.8mg，大黃酚對照品5.2mg，分別置于50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取大黃素溶液1.0ml、大黃酚溶液2.0ml，置同一25ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成每1ml含大黃素38.4ug，含大黃酚83.2ug的溶液，精密吸取此溶液5、10、15、20、25ul，分別注入高效液相色譜儀，測定，以進樣量對峰面積作圖。大黃素回歸方程為Y=4018266.46X-5028.7，r=0.9997；大黃酚回歸方程為y=5653247.6x-12000.3，r=0.9998。表明大黃素在0.192ug-0.960ug范圍內(nèi)，大黃酚在0.416ug-2.080ug范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 樣品含量測定

取不同批號供試品3批，按上述方法制備、測定、計算，結(jié)果見表1，HPLC圖見圖1。

2.5 空白實驗

按處方比例及工藝自制不含大黃的空白樣品，按供試品溶液的制備方法制備、上述條件測定。結(jié)果表明處方中其它藥材不干擾大黃素、大黃酚總量的測定。

2.6 精密度試驗

取供試品溶液相同量，重復(fù)進樣5次，測得大黃素和大黃酚總量的相對標準偏差RSD=0.597%，測定結(jié)果見表2。

RSD=0.597%

2.7 重現(xiàn)性試驗

取批號為20090602的大黃結(jié)康片樣品5份，按前述方法制備供試品溶液，并測定大黃素和大黃酚的總量，測定結(jié)果見表3。

RSD=1.79%

2.8 回收率試驗

精密稱取大黃素和大黃酚對照品適量，加入到已測知大黃素和大黃酚總量的樣品中，按前述方法操作，制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測定，計算回收率，測定結(jié)果見表4。

RSD=1.49%

3 討論

3.1 分別取大黃素和大黃酚對照品溶液在200-600nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果大黃素在254nm、287nm、429nm波長處均有最大吸收，兩者均在254nm、289nm、438nm，大黃酚在254nm、287nm、429nm波長處均有最大吸收，兩者均在254nm波長處吸收最大，靈敏度高，可同時測定大黃素和大黃酚的含量，故選擇測定波長為254nm，基線穩(wěn)定，分離效果好。

3.2 按處方和工藝制備不含大黃的陰性對照樣品，但供試液方法配制并按上述色譜條件測定，表明陰性對照液不干擾大黃素和大黃酚總量的測定。

3.3 本實驗建立的方法，參考中國藥典（2000年版一部），實驗證明，本法靈敏度高，重現(xiàn)性好，其平均回收率為98.92%，可為大黃結(jié)康片質(zhì)量控制提供一個有效質(zhì)控指標。

參考文獻

[1]江蘇新醫(yī)學院編.中藥大詞典.上?？茖W技術(shù)出版社[M].1986年.

[2]薛漓.HPLC法測定痔瘡片中大黃素和大黃酚的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學，2003，20（5）：404.

[3]陳勇，李耀華，陳新.HPLC法測定益肝口服液中大黃素和大黃酚含量的研究[J].中醫(yī)藥學刊，2003，21（8）：1334.

[4]趙莉，晁若冰.HPLC法測定大黃通便膠囊中大黃素和大黃酚[J].華西藥學雜志，2003，18（4）：283.

[5]許乾麗，茅向軍.HPLC法測定座瘡愈中大黃素、大黃酚的含量測定[J].中國中藥雜志，2003.28（1）：85.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].2000年版一部18頁.