四種食源性肽改善光老化大鼠皮膚皺紋及屏障功能的實(shí)驗(yàn)研究

徐德峰++馬忠華++趙謀明++張婷++蘇國萬++段軍毅

[摘要]目的：評價四種食源性肽口服暴露對SD大鼠光老化皮膚皺紋及屏障功能的改善效果。方法：將112只健康成年雌性SD大鼠隨機(jī)平均分為空白對照組、模型組、肽樣品組，每種肽分別設(shè)定低、中、高劑量組，配制濃度為0.3、0.9、1.5g/L的含肽水溶液進(jìn)行口服，每日自由飲用；空白組不施行紫外輻照，模型組及肽樣品組均行UVA+UVB聯(lián)合輻照，連續(xù)輻照18周后進(jìn)行皮膚表觀皺紋評分，檢測皮膚表皮水分含量和油脂含量，評價4種食源性肽對光老化大鼠皮膚皺紋和屏障功能的改善效應(yīng)。結(jié)果：與正常對照組相比，模型組大鼠皮膚皺紋感官質(zhì)量顯著降低，肽口服干預(yù)后可不同程度改善皮膚皺紋狀況，且總體呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，不同活性肽之間改善效果差異較大，以樣品2高劑量組效果最好；從屏障功能來看，模型組大鼠皮膚水分和油脂含量顯著低于空白組（P<0.05）；4種活性肽口服干預(yù)后光老化皮膚水油屏障功能恢復(fù)良好，樣品2和核桃肽中、高劑量時可顯著提升表皮水分和油脂含量（P<0.05）。結(jié)論：樣品2能顯著減少光老化大鼠皮膚深大皺紋量，改善受損皮膚屏障功能，是口服抗皺活性肽產(chǎn)品開發(fā)的首選基料。

[關(guān)鍵詞]活性肽；口服；SD大鼠；光老化；屏障功能

[中圖分類號]R758.14 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）09-0049-05

Comparative Analysis of Four Kinds of Food-derived Peptides with Oral Supplementation on the Wrinkling and Barrier Function Status in Photoaging

Skin of SD Rat

XU De-feng1，2，MA Zhong-hua1，ZHAO Mou-ming2，ZHANG Ting1，SU Guo-wan2，DUAN Jun-yi3

[1.Technique Center of Infinitus （China） Co. Ltd.，Guangzhou 510665，Guangdong，China； 2.College of Light Industry And Food Science Technology，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China； 3.College of Agriculture and Animal Husbandry，Tibet University， Linzhi 86000， Tibet，China]

Abstract： Objective To evaluate the improvement of four kinds of food-derived peptides with oral supplementation on wrinkling and barrier function status of SD rat photoaging. Methods 112 of healthy adult female SD rats were randomly divided into normal control group， ultraviolet exposed group and peptides administration groups. Except the normal group， all animals in model and peptides administration groups were exposed to radiation of UVA in companying with UVB. The low， middle and high-dose bioactive peptides administration were obtained by preparing the water solution of peptides with concentration of 0.3， 0.9 and 1.5g/L respectively. And then the obtained peptides solution was orally administrated to the SD rats in peptides treating groups as the sole drinking source. The model and peptides groups were exposed to UV irradiation thrice weekly for 18 weeks until the photoaging model was established and then the improvement of four kinds of food-derived peptides on wrinkling and barrier function was evaluated by sensory scoring and operatically detection. Results In comparison with the rats in normal control group， the animals in model groups had remarkable wrinkling formation and this degradation in wrinkling status was improved by oral supplementation of peptides and the effectiveness was in a dose-effect manner and dependent on the kind and concentration of， of which the sample of peptides 2 exhibited most distinguished wrinkling elimination. Furtherly， judging from the water and oil barrier function of skin， the moisture and lipid concentration of skin in model group were significantly lower than those in normal group and the barrier function was desirable improved by oral supplementation of peptides （P<0.05）. At middle and high dose， the sample 2 and peptides significantly enhanced the moisture and lipid concentration of skin （P<0.05）. Conclusion Sample 2 can remarkably eliminate the deep and huge wrinkles and restore the barrier function in photoaging skin of SD rats， and thus to be the element ingredient for developing an anti-wrinkling product with peptides.endprint

Key words： peptides； oral supplementation； SD rats； photoaging； barrier function

皮膚老化與抗衰老是當(dāng)今皮膚科學(xué)的研究熱點(diǎn)，紫外線輻射引起的皮膚光老化是皮膚外源性衰老的主要原因[1]。光老化導(dǎo)致皮膚過早出現(xiàn)粗糙、皺紋、色素異常、脆性增加、毛細(xì)血管擴(kuò)張及皮革樣外觀等癥狀，嚴(yán)重影響皮膚外觀，導(dǎo)致皮膚屏障功能受損[2-4]。隨著審美標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，人們對皮膚光老化的防治越來越重視，鑒于皮膚組織的天然“磚墻結(jié)構(gòu)”的致密屏障，只有分子量小于3 000Da以下的分子才能透皮吸收，而且功效成分大多化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，長時間暴露于紫外線等環(huán)境中極易分解，失去本身應(yīng)有的抗衰功能甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)[5]。因此，通過飲食等內(nèi)在途徑改善皮膚屏障功能，減少皮膚皺紋量，從而改善光老化皮膚表觀形態(tài)已是新一代抗衰功能食品開發(fā)的必然趨勢。本研究對四種食源性肽進(jìn)行口服實(shí)驗(yàn)，根據(jù)光老化皮膚皺紋改善及屏障功能恢復(fù)情況，篩選最佳食源性肽，為抗衰產(chǎn)品開發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑：健康雌性SPF級SD大鼠168只購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，周齡10周，體質(zhì)量180～200g，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2011-0029，質(zhì)量合格證號：No.44008500003344。

食源性肽樣品1、2、3由無限極（中國）有限公司技術(shù)中心提供（樣品1為狹鱈皮膚膠原蛋白肽，購自廣州維晟生物科技有限公司；樣品2為牛源彈性蛋白肽，由無限極（中國）有限公司技術(shù)中心自制；樣品3為鰹魚動脈球彈性蛋白肽，購自 Hayashikane Sangyo Co，.Ltd），核桃肽由華南理工大學(xué)趙謀明教授惠贈。新鮮基礎(chǔ)鼠糧及清潔刨花墊料購自廣州市花都區(qū)實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場。

1.2 主要設(shè)備：紫外光輻照箱為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)安裝[6]，已獲專利授權(quán)（專利號：ZL201520152906.5）。紫外線燈管：UVA Philips 340-40WT12-G13，波長范圍320～400nm，波峰340nm；UVB Philips 313-40WT12-G13，波長范圍300～320nm，波峰313nm。UV-A型、UVB297型紫外輻照計(jì)購自北京師范大學(xué)光電儀器廠。大鼠實(shí)驗(yàn)籠購自蘇州市蘇杭科技器材有限公司。FC1502菲斯·凱爾皮膚分析儀來自深圳凱爾電子廠。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與模型建立：SD大鼠飼養(yǎng)在專用鼠籠中，環(huán)境設(shè)施符合試驗(yàn)動物SPF級等級要求，室溫20℃～25℃，濕度40%～70%，自然晝夜交替。動物實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，最終選取112只健康SD大鼠隨機(jī)分為14組，正常對照組、模型組和肽樣品組（4種肽樣品分為設(shè)置低、中、高劑量組），每組8只，各組大鼠分2籠飼養(yǎng)，每籠4只。正常對照組與模型組以清潔自來水為唯一飲用水，肽樣品低、中、高劑量組分別在清潔自來水中分別加入終濃度0.3、0.9、1.5g/L的樣品1、2、3及核桃肽，飼料均為基礎(chǔ)飼料，自由攝食。

正常對照組不進(jìn)行輻照，其余各組進(jìn)行等量紫外輻照。參照文獻(xiàn)[6-9]，用記號筆畫出背部脊柱兩側(cè)約5.0cm×5.0cm區(qū)域并用電推剪剃除毛發(fā)，每次輻照前剃毛并進(jìn)行Na2S化學(xué)脫毛，將脫毛大鼠放入自制固定器中暴露背部剃毛皮膚，連同固定器和大鼠置于紫外線光源（UVA+UVB）正下方40cm處進(jìn)行紫外輻照，紫外輻照計(jì)測得該處UVA強(qiáng)度為177.9mW/cm2，UVB強(qiáng)度為59.6mW/cm2。輻照頻率為隔天輻照1次，時間為第1周10min/d，第2周20min/d，第3周30min/d，之后維持在30min/d，第18周皮膚外觀呈典型老化狀態(tài)表示造模結(jié)束，累計(jì)照射劑量為UVA 150.88J/cm2，UVA 78.67J/cm2，紫外輻照結(jié)束后對各組大鼠進(jìn)行觀察拍照。

1.3.2 皮膚表觀皺紋測定評分：參照文獻(xiàn)資料[10]，根據(jù)皮膚橫向皺紋的情況對光老化程度和改善效果進(jìn)行評分，評分依據(jù)見表1。

1.3.3 皮膚屏障功能測定：皮膚屏障功能評價采用皮膚表皮水分含量和油脂含量進(jìn)行量化，F(xiàn)C1502菲斯·凱爾皮膚分析儀進(jìn)行測定，具體按照儀器說明書進(jìn)行操作，采用點(diǎn)觸式測量，測3次取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗(yàn)法，方差不齊時采用Dunnetts T3 進(jìn)行比較，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠皮膚光老化動物模型建立結(jié)果：光照前大鼠皮膚光滑，色澤正常，有彈性，無明顯皺紋。連續(xù)輻照，從第4周開始出現(xiàn)少許紅斑、脫屑，并可見少量橫向較淺皺紋，隨造模時間延長，皺紋逐漸加深，紅斑炎癥反應(yīng)在第10周左右達(dá)到高峰，之后炎癥反應(yīng)有所減輕，而皺紋、干燥、松弛持續(xù)加重，18周時可見明顯而持久的橫向皺紋，皮膚松弛、缺乏彈性、干燥粗糙，伴有脫屑、角化過度，色澤黯淡、部分存在色素異常，嚴(yán)重者呈皮革樣外觀，表明成功構(gòu)建了SD大鼠皮膚光老化動物模型。見圖1。

2.2 各組SD大鼠皮膚外觀觀察及評分結(jié)果：由圖2A可以看出，與正常對照組相比，模型組SD大鼠皮膚表皮粗糙、皺紋明顯，呈典型皮革樣外觀，表明造模成功。與模型組相比，4種食源性肽對皮膚光老化均呈現(xiàn)出一定的修復(fù)效果，整體呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，但不同樣品的效果存在明顯差異：①低劑量時各肽樣品效果均不明顯；②中劑量時各樣品修復(fù)效果差異明顯，樣3組外觀無明顯改變，樣1有輕微改善；③高劑量時樣1和樣3皮膚橫向粗大皺紋雖有輕微改善，但不如樣2和核桃肽改善明顯。

由圖2B可知，模型組感官分值低于2.0，顯著低于空白對照組（P<0.05），而肽干預(yù)后光老化皮膚皺紋分值基本呈量-效關(guān)系提高，但不同樣品其提升效果差異較大，尤其在中、高劑量時其差異可達(dá)到顯著性水平。在中劑量時，樣2感官分值可達(dá)到4.1，顯著高于其他三種活性肽（P<0.05），在高劑量時樣2分值基本不再增加，而核桃肽此時達(dá)到3.8，接近樣2效果。綜合表觀形態(tài)及皺紋等級量化評分結(jié)果可知，樣品2和核桃肽在改善光老化皮膚皺紋方面效果最為顯著。endprint

2.3 各組SD大鼠皮膚屏障功能測定結(jié)果：由圖3A可以看出，與正常對照組相比，模型組SD大鼠皮膚在光老化造模過程中表層水分含量顯著降低（P<0.05），表明皮膚水屏障功能嚴(yán)重受損，與模型組相比，不同食源性活性肽口服干預(yù)后水屏障功能有不同程度恢復(fù)，且水分含量總體呈量-效關(guān)系上升，但不同肽其改善效果差異明顯。樣品2在低劑量時就可明顯提高皮膚角質(zhì)層含水量，在中、高劑量時達(dá)到顯著性水平（P<0.05），核桃肽效果次之，但樣1和樣3雖然也呈量-效關(guān)系改善皮膚水分含量，但效果顯著低于樣2和核桃肽。與水分含量提升類似，活性肽口服干預(yù)后對光老化皮膚表層油脂含量也呈一定的量-效性提高。在低劑量時基本對油脂含量沒有影響，中、高劑量時樣2和核桃肽可顯著提升油脂含量（P<0.05），且樣2顯著優(yōu)于其他樣品（圖3B）。

3 討論

目前皮膚光老化機(jī)制尚不明確，建立光老化動物模型對研究光老化機(jī)制和治療光老化疾病有著重要意義。鑒于SD大鼠具有價格低廉、適用性廣、取材面積大等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，本研究以SD大鼠進(jìn)行光老化造模，結(jié)果表明經(jīng)連續(xù)18周低劑量UVA+UVB聯(lián)合輻照成功復(fù)制了光老化動物模型，與文獻(xiàn)報(bào)道的動物模型表觀形態(tài)基本相同[8，11]，為功效評價和機(jī)制解析奠定了基礎(chǔ)。

相關(guān)研究表明[12-14]，口服VC、VE、多酚類等具有抗氧化活性的物質(zhì)可增強(qiáng)抗皮膚組織氧化酶活性，調(diào)整免疫水平，減輕或修復(fù)光老化皮膚氧化損傷。自Mellander 1950年首次揭示食源性生物活性肽具有生物活性以來，食源性生物肽的生物功能就一直引起科學(xué)家的興趣和關(guān)注，生物肽的多種生物功能已被報(bào)道，其中改善人和動物皮膚老化功能也逐漸被報(bào)道[4，15-17]。Proksch[15]對114名年齡45～65歲女性隨機(jī)接受2.5g膠原蛋白肽或相應(yīng)安慰劑連續(xù)8周口服暴露，通過雙盲實(shí)驗(yàn)研究評價了膠原蛋白特定生物肽VERISOL（R）在控制眼瞼部位皮膚皺紋形成，刺激前膠原蛋白I、彈性蛋白、原纖蛋白生物合成方面的作用，證實(shí)口服特定生物肽BCP可減少皮膚皺紋，并對真皮基質(zhì)合成有良好促進(jìn)效果?；谑吃葱噪脑诟纳破つw光老化方面的良好應(yīng)用前景，本次研究對四種典型食源性肽進(jìn)行口服實(shí)驗(yàn)，評價其對于光老化皮膚的改善效果。

皺紋及屏障功能是皮膚老化的主要指標(biāo)之一，本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)[10，18]，將形態(tài)學(xué)定性描述與感官評分相結(jié)合，使皺紋評價在缺乏專門儀器的情況下能夠進(jìn)行量化評價，定量評價皮膚皺紋形態(tài)學(xué)的改變。等級量表可將單純?nèi)庋塾^察的現(xiàn)象量化，便于分析處理因素對研究對象的作用，亦可用于評判藥物療效，國外常用此類量表對皮膚的皺紋、松弛等狀態(tài)進(jìn)行評估。采用光老化皮膚水分和油脂含量評價其屏障功能的恢復(fù)情況。結(jié)果表明，4種食源性肽均可在一定程度上改善皮膚光老化皺紋，修復(fù)皮膚光損傷，且存在種類和劑量差異，其中以樣品2高濃度效果最為明顯，其次是核桃肽和樣品1，樣品3表現(xiàn)最差，本研究結(jié)果為產(chǎn)品開發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

另，皮膚表觀狀態(tài)與皮膚水油屏障功能密切相關(guān)，良好的皮膚外觀取決于皮膚水分和油分屏障功能平衡。皮膚角質(zhì)層細(xì)胞是抵御外界損傷的第一道防線，在光老化進(jìn)程中，紫外線可通過紅斑形成、表皮增殖、色素沉著等方式對皮膚屏障功能產(chǎn)生影響，使角質(zhì)層細(xì)胞間粘附能力降低，引起皮膚“磚墻結(jié)構(gòu)”破壞，皮膚屏障功能受損，水分和油脂丟失率增加，從而引發(fā)和加劇表觀形態(tài)劣化[2-4，8]。本研究證明，與空白組相比，模型組大鼠皮膚水分和皮脂流失率顯著高于空白組，表明模型組大鼠皮膚的水和油脂屏障功能嚴(yán)重受損，活性肽口服干預(yù)后皮膚水分和油脂含量總體呈量-效關(guān)系上升，表明活性肽在不同程度上恢復(fù)了皮膚屏障功能?；诮Y(jié)構(gòu)與功能的密切相關(guān)性，關(guān)于活性肽對皮膚結(jié)構(gòu)的影響有待進(jìn)一步深入研究。

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[收稿日期]2017-03-10 [修回日期]2017-06-27

編輯/張惠娟endprint