河豚毒素的新國標與檢測

□ 梁文文 本刊記者

河豚毒素的新國標與檢測

□ 梁文文 本刊記者

講座導師簡介：

倫麗麗，江蘇美正生物科技有限公司（以下簡稱“美正生物”）運營總監(jiān),全面負責采購、生產(chǎn)、質(zhì)量控制、產(chǎn)品評價、技術支持、倉管物流等部門的工作。曾參與多項新產(chǎn)品研發(fā)及評價，申報多項國家專利，發(fā)表論文1篇。組建了膠體金產(chǎn)品/ELISA試劑盒/化學方法試劑/儀器設備生產(chǎn)團隊、質(zhì)量控制團隊以及特色技術服務團隊，為美正生物產(chǎn)品的銷售提供全方位技術保障，形成了美正生物的特色技術服務模式，在美正生物的快速發(fā)展及品牌形象的樹立中起到了關鍵作用。

在中國古代人們便對河豚毒素的毒性有了深刻認識。晉人左思《三都賦·吳都賦》便有“王鮪鯸鮐”之句，其注曰：“鯸鮐魚狀，如蝌蚪，大者尺余，腹下白，背上青黑，有黃紋，性有毒?！鄙蚶ㄔ凇秹粝P談》中說：“吳人嗜河豚魚，有遇毒者，往往殺人，可為深戒?！奔幢闳绱?，河豚的鮮美仍使人趨之若鶩，所以長久以來就有“拼死吃河豚”的說法。隨著科學技術的進步，人類可以運用檢測手段來避免河豚毒素造成的傷害，而如何檢測河豚毒素是防止人們中毒的重中之重。檢測技術的改進，使得檢測標準也有了變化。在由《食品安全導刊》、食安中國網(wǎng)共同舉辦的線上專題研討會“食安大講堂”中，美正生物運營總監(jiān)倫麗麗圍繞“河豚毒素檢測技術”進行了詳細的闡述。

什么是河豚毒素？

河豚毒素是一種通俗的說法，其學名為河鲀毒素（TTX），是鲀魚類（俗稱河豚魚）及其它生物體內(nèi)含有的一種生物堿，也是自然界中所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的神經(jīng)毒素之一，曾一度被認為是自然界中毒性最強的非蛋白類毒素。TTX的毒性比氰化物高1250多倍，0.5mg即可致人喪命。TTX對腸道有局部刺激作用，吸收后會迅速作用于人的神經(jīng)末梢及神經(jīng)中樞，并可高選擇性和高親和性地阻斷神經(jīng)興奮膜上的鈉離子通道，阻礙神經(jīng)傳導，從而引起神經(jīng)麻痹甚至死亡。

TTX是起源于生物體本身還是其寄生物尚有爭議，因為河鲀毒素及類似物不僅存在于各種鲀科魚類中，還廣泛分布于各種高等、低等生物中。其他含有河鲀毒素的生物有一個共同點，即其體內(nèi)含有多種能分泌毒素及其類似物的細菌，這些生物體內(nèi)毒素的積累和分布因季節(jié)和部位不同而存在差異。

解讀新國標

GB 5009.206-2016《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中河豚毒素的測定》于2016年12月23日發(fā)布，2017年6月23日實施，新標準規(guī)定了水產(chǎn)品中河豚毒素的4種測定方法。第一法為小鼠生物法，適用于河豚魚肌肉、肝臟、皮膚和性腺組織中河豚毒素的測定。與舊有國標SNT 1569.2-2013《出口河豚魚中河豚毒素檢測方法 第2部分：小鼠生物法》相比，新國標樣本的適用性更強，可用于檢測河豚魚的性腺組織。第二法為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，適用于河豚魚肌肉、肝臟、皮膚和性腺組織中河豚毒素的測定。原標準中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是一種確認方法，而新國標中將此單獨作為檢測方法。第三法是液相熒光法，適用于河豚魚、織紋螺、蝦、牡蠣、花蛤和魷魚中河豚毒素的測定。以免疫親和層析柱代替C18固相萃取柱進行提取凈化，這兩種方法代替了原有國標GB/T 23217-2008《水產(chǎn)品中河豚毒素的測定 液相色譜-熒光檢測法》。第四法是酶聯(lián)免疫吸附法，適用于河豚魚肝臟、皮膚和性腺組織中河豚毒素的測定，本法代替了GB/T 5009.206-2007《鮮河豚魚中河豚毒素的測定》，原有國標采用直接酶聯(lián)免疫吸附法，而新版國標采用的是間接酶聯(lián)免疫吸附法。

河豚毒素的檢測技術

雖然新國標中規(guī)定了4種方法，但在實驗室檢測或市場監(jiān)督檢測時適用程度仍有不同，倫麗麗向聽眾介紹了3種適用性較強的方法—液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫試劑盒法及膠體金快速檢測法。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法：此方法的關鍵是前處理，首先稱取2g樣品，加入10mL 1%乙酸-甲醇溶液，渦旋振蕩3min，然后放入40℃水浴中超聲提取15min，待冷卻至室溫后，于6000r/min的離心機中離心5min，從離心管中取7mL上清液加入28mL PBS溶液進行稀釋，用適量的1N氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至7左右。然后用玻璃微纖維濾紙過濾，除去雜質(zhì)后移取其中10mL濾液，采用親和免疫層析柱經(jīng)過梯度洗脫的方式對濾液進行凈化，使用免疫親和層析柱時應注意上樣液為中性環(huán)境（pH值7～8），上樣時液滴流速控制在1～2滴/秒，洗脫液流速控制在1滴/秒。洗脫時建議加入2mL洗脫液，靜置浸泡2min后再開始洗脫；當洗脫液超過柱容量時，因檢測數(shù)據(jù)偏低待測物質(zhì)將不能被有效捕獲，可加大稀釋倍數(shù)后再通過免疫親和柱進行富集。進行色譜分析時，色譜柱一般采用規(guī)格為2.1×50mm，1.7μm的Amide柱，其流動相A為含0.1%（體積分數(shù)）甲酸的乙酸銨（5moL/L）溶液，流動相B為乙腈，流速控制在0.3mL/min，進樣體積為10μL。以上為色譜分析流程，色譜分析過后再進行質(zhì)譜分析，即完成此方法的全部流程。

酶聯(lián)免疫試劑盒法：酶聯(lián)免疫競爭法包括直接競爭法和間接競爭法。競爭法的原理為樣本中的抗原和一定量的固相抗原競爭結(jié)合一定量的抗體，而后與酶標二抗反應，待測樣本中抗原越多，與固相抗原結(jié)合的抗體及酶標二抗越少，顯色越淺；反之，待測樣本中抗原越少，顯色越深。酶聯(lián)試劑盒測定河豚毒素的含量分為兩個部分，一是樣品的測定，二是標準曲線的制作，兩部分檢測步驟相同。取2g樣本，加入4mL提取液，提取5min，在4000rpm下離心10min。取上清液進行檢測。檢測步驟為加入標準品/樣本50μL/孔到對應的微孔中，再加入酶標物50μL/孔，然后再加入抗試劑50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于25℃避光環(huán)境中反應30min。揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用新槍頭戳破）。加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應15min使之顯色。最后加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。

使用美正生物的酶聯(lián)免疫試劑盒制作的標準曲線線性相關系數(shù)可達0.99以上，最低檢出限可達4μg/kg，檢測范圍為4～324ppb。

免疫親和柱

膠體金快速檢測法：此法與酶聯(lián)免疫試劑盒法均為實驗室快速檢測方法。具體操作步驟為取3g樣本，加入2mL試劑A，劇烈震蕩5min，在4000rpm下離心5min，取1mL上清液加入10μL試劑B，混勻。取100μL混合液進行點卡檢測，5min后即可對結(jié)果進行判讀。消線法的檢出限200μg/kg，比色法的檢出限35μg/kg，此方法具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點。

美正生物

美正生物坐落于江蘇省無錫市高新開發(fā)區(qū)，是一家專注于食品安全快速檢測產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)、銷售和服務的高科技創(chuàng)新企業(yè)。同時，美正生物為食藥監(jiān)系統(tǒng)、農(nóng)業(yè)系統(tǒng)、畜牧系統(tǒng)、漁業(yè)系統(tǒng)、食品企業(yè)等提供專業(yè)的檢測產(chǎn)品、先進的技術支持和高效的整體解決方案。美正生物始終堅持用最專業(yè)的產(chǎn)品、最優(yōu)秀的團隊和最完善的服務，服務于用戶；始終堅持“試劑領先”的核心戰(zhàn)略，堅持設備為實際檢測服務的理念，為政府和企業(yè)提供全方位的食品安全檢測技術和整體解決方案。