人參-附子藥對不同配比對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

曹麗梅，趙萱，李杰，何瑤，傅超美

·藥理毒理·

人參-附子藥對不同配比對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

曹麗梅，趙萱，李杰，何瑤，傅超美

目的：研究人參附子藥對不同配比對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，優(yōu)選參附注射液中人參-附子藥對改善慢性心力衰竭的最佳比例，闡明參附藥對配伍與療效的關(guān)系。方法：采用腹腔注射鹽酸阿霉素(ADR)法建立大鼠慢性心力衰竭(CHF)模型，測定大鼠體重及心臟重量指數(shù)(HWI)的變化，HE染色后觀察大鼠心肌組織切片病理損傷情況，通過實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測其對抗凋亡基因（Bcl-2）、促凋亡基因（Bax）、細(xì)胞色素C( Cytc)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 9（Caspase-9）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）基因mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果：參附注射液組與其藥對不同配比組均能不同程度降低慢性心衰大鼠心臟重量指數(shù)，解緩心肌沖血程度，上調(diào)抗凋亡基因（Bcl-2）表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因（Bax）、細(xì)胞色素C( Cytc)、Caspase-9和Caspase-3的表達(dá),抑制線粒體途徑心肌細(xì)胞的凋亡，其中，以人參-附子1:2配比組作用最強(qiáng)。結(jié)論：人參與附子配伍比例為1:2時，抗慢性心力衰竭線粒體途徑心肌細(xì)胞凋亡的效果最佳，其可能是通過抑制Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax基因表達(dá)，來抑制細(xì)胞色素C (Cytc)釋放，從而降低Caspase-9和Caspase-3的水平，最終抑制慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)心肌，改善心功能。

人參；附子；藥對；慢性心力衰竭；心肌細(xì)胞凋亡

參附注射液具有回陽救逆，益氣固脫功能，臨床上被廣泛用于肺源性心力衰竭、冠心病慢性心力衰竭、充血性心力衰竭、急性心力衰竭、休克、缺血再灌注損傷等。心肌缺血、再灌注損傷、心力衰竭病理變化中伴隨心肌細(xì)胞的凋亡，并受到多種基因的調(diào)控。線粒體結(jié)構(gòu)與功能異常，是影響心肌細(xì)胞凋亡主要因素[1]。參附注射液對心肌細(xì)胞膜系統(tǒng),特別是線粒體膜具有明顯保護(hù)作用，這與參附注射液可保護(hù)心肌肥大過程中線粒體內(nèi)、外膜損傷相一致[2]。本論文以參附注射液為載體，以人參-附子藥對配伍比例為切入點(diǎn)，研究人參、附子兩藥味不同配比對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的療效與劑量的關(guān)系，優(yōu)選人參-附子配伍改善慢性心力衰竭的最優(yōu)配比。

1 材料

1.1 試驗動物

SD大鼠（SPF級），雄性，體重180±20g，動物合格證號：SCXK（川）2015-030，由成都達(dá)碩實(shí)驗動物有限公司提供。

1.2 試驗儀器與試劑

CFX96熒光定量PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad熒光定量PCR儀公司）、光學(xué)顯微鏡（日本OLMPUS有限公司）、RM22石蠟切片機(jī)（德國Leica儀器有限公司）；BS200S電子天平 (德國賽多利斯儀器有限公司)、55i熒光顯微成像系統(tǒng)（日本Nikon有限公司）、Thermo Micro 21R低溫離心機(jī)（美國Thermo儀器有限公司）、902-ULTS超低溫離心機(jī)（美國Thermo儀器有限公司）。

鹽酸阿霉素夠自成都曼思特生物科技有限公司（規(guī)格：100mg，批號：PS160614-01）；紅參提取物、附子提取物、參附注射液均由四川雅安三九藥業(yè)有限公司提供（批號分別為：F160511、F160511、15110701004、）；TriPure Isolation Reagent試劑盒 (批號：11667165001)、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒(批號：04897030001)、FS Universal SYBR Green Master試劑盒（批號：4913914001）均購自德國Roche Applied Science公司。

1.3 人參-附子配伍不同配比樣品的制備

分別取適量的紅參提取物、黑順片提取物（濃度為0.1mg．kg-1），配置附子-人參1:1、2:1、1:2樣品溶液，取適量過0.22μm微孔濾膜，既得。

2 試驗方法

2.1 造模及給藥

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將60只SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別設(shè)為空白組、模型組、陽性對照組（參附注射液組）、人參-附子1:1組、人參-附子1:2組、人參-附子2:1組。參照文獻(xiàn)[3]用腹腔注射鹽酸阿霉素（ADR）建立慢性心力衰竭大鼠模型。模型組和各給藥組大鼠從實(shí)驗開始后的第2、4天腹腔注射ADR 1 mg?kg-1，第6、8天腹腔注射ADR 2 mg．kg-1，10、12天腹腔注射ADR 3 mg．kg-1，14、16天腹腔注射ADR4mg．kg-1，第16天ADR累計用藥劑量達(dá)20 mg．kg-1?？瞻捉M腹腔注射等量的生理鹽水，造模期間大鼠自由進(jìn)食、飲水。造模一周后，分別腹腔注射液參附注射液（4 mL．kg-1）、人參-附子1:1（相當(dāng)于生藥10 mg．kg-1）、人參-附子1:2（相當(dāng)于生藥15 mg．kg-1）、人參-附子2:1（相當(dāng)于生藥15 mg．kg-1）配伍不同配比組于開始腹腔注射給藥4 mL．kg-1，每日一次，連續(xù)給藥10天?？瞻捉M給予等量生理鹽水，模型組不做任何處理。

2.2 取材及心臟重量指數(shù)（HWI）測定

末次給藥后，大鼠禁食不禁水，12小時后，稱量大鼠體重（BW），腹腔注射20%烏拉坦（5 mL．kg-1）麻醉大鼠后，解剖大鼠，延主動脈根部游離心臟，去除周圍筋膜及脂肪組織，用生理鹽水洗凈，最后用濾紙吸干表面水分，稱量心臟的重量（HW），計算心臟重量指數(shù)（HWI,HWI=HW/BW）。隨后將心臟分為兩部分，分別用于組織病理學(xué)損傷評估、心肌組織凋亡調(diào)控基因mRNA水平的分析。

2.3 心肌組織切片HE染色

將取下的大鼠心肌組織固定于4%多聚甲醛中（PH:7.2～7.6），經(jīng)組織修塊、蒸餾水沖洗、梯度酒精脫水、石蠟包埋，LEICA切片機(jī)切片（5um），HE染色后用中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察并記錄心臟組織病理學(xué)損傷情況。采用顯微照相系統(tǒng)進(jìn)行拍照記錄。

2.4 熒光實(shí)時定量qRT-PCR法測定心肌組織基因mRNA表達(dá)水平

心肌組織經(jīng)在液氮中碾磨成粉末后，取約100 mg組織粉末約1 ml進(jìn)行總RNA提取，操作步驟嚴(yán)格按照TriPureIsolation Reagent 試劑盒說明書進(jìn)行；提取的總RNA采用核酸定量儀對RNA進(jìn)行定量，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptorfirst strand cDNA synthesis反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，具體操作步驟按照試劑盒進(jìn)行，相關(guān)調(diào)控基因引物序列見表1-1；取樣本cDNA1μL上下游引物各0.5μL，并按照FS Universal SYBR Green Master試劑盒操作要求加入其他成分。樣品Bax，Bcl-2，Cytc，Caspase-9，Caspase-3和β-actin循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性2 min，接著進(jìn)行40循環(huán)數(shù)，95℃變性10 s，退火（Bax：62.2℃；Bcl-2：62.7℃；Cyt c：63℃；Caspase-9：58.5℃；Caspase-3：61.2℃；β-actin：63℃）30 s；最后95℃延伸15 s。以β-actin作為內(nèi)參基因，分析上述基因mRNA的相對表達(dá)水平?；驍U(kuò)增的Ct值采用2-△△T法分析。

表1 心肌細(xì)胞凋亡線粒體調(diào)控基因引物序列

R:ACAGAGCTGGACTGCGGTAT Bcl-2 NM_016993.1F: ACAGCCAGGAGAAATCAAACA R:GGTGGACAACATCGCTCTG Bax NM_017059.2 F: GTCCAGTTCATCGCCAATTC R:CAGGATCGAGCAGAGAGGAT C（Cytc） NM_012839.2 F: TCAATGATGCTGCCTTTCAC R: ACTCCCAATCAGGCATGAAC Caspase-9 NM_031632.1 F:CCACGGACACATGAGGTTGT R:CAGGGCACACATGACAATGC

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS20.0 統(tǒng)計分析軟件對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），多組間均數(shù)兩兩比較，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

3 試驗結(jié)果

3.1 動物行為學(xué)觀察

空白組大鼠體格矯健,神思敏捷，毛發(fā)柔順而有光澤，模型組和其余各藥組大鼠在第3次腹腔注射ADR后開始出現(xiàn)病理癥狀，表現(xiàn)為毛色雜亂無光澤,進(jìn)食量減少,腹瀉，活動量減少,腹部出現(xiàn)硬塊,反應(yīng)遲鈍，精神萎靡等。經(jīng)參附注射液及人參-附子藥對配伍不同配比治療后上述癥狀較模型組均出現(xiàn)不同程度好轉(zhuǎn)。

3.2 大鼠心臟重量指數(shù)（HWI）變化

數(shù)據(jù)處理結(jié)果表明，與空白組大鼠相比，模型組大鼠HWI顯著升高（P＜0.01）；參附注射液組、人參-附子1:2組大鼠HWI明顯低于模型組（P＜0.01）；人參-附子1:1組、人參-附子2:1組大鼠HWI低于模型組（P＜0.05），詳見表3-1。

表2 人參-附子配伍不同配比對大鼠體重及心臟重量指數(shù)（HWI）的影響（x±s，n=6）

3.3 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果

各組試驗大鼠心肌組織HE染色結(jié)果見圖3-1，由圖可知，空白組大鼠未見明顯的病理損傷，肌間小動脈、小靜脈和毛細(xì)血管均未見明顯擴(kuò)張，管腔中無紅細(xì)胞。模型組大鼠心肌組織肌間明顯增寬，間質(zhì)小靜脈和毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張充有數(shù)量不等的紅細(xì)胞，毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多；心肌空泡變性，肌漿內(nèi)有大小不等的不規(guī)則或近圓形空泡。參附注射液組較為接近空白組，有少量心肌細(xì)胞出現(xiàn)充血現(xiàn)象。人參-附子1:2組與模型組相比，肌間隙明顯變窄，變性心肌細(xì)胞及空泡數(shù)量顯著減少，毛細(xì)血管充血程度有一定改善。人參-附子1:1組肌間小動脈、小靜脈和毛細(xì)血管擴(kuò)張程度得到很大程度的改善，但是心肌組織充血嚴(yán)重，紅細(xì)胞及毛細(xì)血管數(shù)量較多。人參-附子2:1組與模型組相比，肌間小動脈、小靜脈和毛細(xì)血管均未見明顯擴(kuò)張，變性心肌細(xì)胞及空泡數(shù)量，炎性細(xì)胞浸潤程度均未觀察到明顯變化。

圖3-1 心肌組織HE染色結(jié)果HE 400×

3.4 對Bcl-2、Bax基因mRNA表達(dá)的影響

由表3可知，模型組大鼠心肌組織Bcl-2的表達(dá)顯著低于空白組（P＜0.01），Bax表達(dá)顯著高于空白組（P＜0.01）。參附注射液組、人參-附子1:2組Bcl-2表達(dá)顯著高于模型組（P＜0.01），Bax基因表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.01）；人參-附子1:1組、人參-附子2:1組大鼠心肌組織中Bcl-2表達(dá)高于模型組和空白（P＜0.05或P＜0.01）；人參-附子1:1組Bax水平低于模型組（P＜0.05），詳見表3。

表3 人參-附子配伍不同配比對大鼠心肌組織Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響（x±s，n=6）

3.5 對細(xì)胞色素C(Cytc)的影響

分析表3-3數(shù)據(jù)可知，模型組大鼠心肌組織細(xì)胞色素C(Cytc)水平顯著高于空白組（P＜0.01）；人參-附子1:1組C(Cytc)水平高于空白組（P＜0.05）；參附注射液組、人參-附子1:2組C(Cytc)水平顯著低于模型組（P＜0.01）；人參-附子1:1組、人參-附子2:1組C( Cytc)水平低于模型組（P＜0.05），詳見表3-3。

表4 人參-附子配伍不同配比對大鼠心肌組織C(Cytc)水平的影響（x±s，n=6）

3.6 對Caspase-9和Caspase-3基因表達(dá)的影響

分析數(shù)據(jù)可知，模型組Caspase-9和Caspase-3基因表達(dá)水平顯著高于空白組（P＜0.01）；與模型組相比較，參附注射液組Caspase-9和Caspase-3的水平降低（P＜0.05或P＜0.01）；人參-附子1:1組、人參-附子2:1組Caspase-9表達(dá)高于空白組，低于模型組（P＜0.01）；人參-附子1:1組Caspase-3表達(dá)顯著高于空白組（P＜0.01）；人參-附子1:2組Caspase-9和Caspase-9水平與模型組相比，差異顯著（P＜0.01），詳見表3-4。

表5 人參-附子不同配比對大鼠心肌組織Caspase-9和Caspase-3水平的影響（x±s，n=6）

注：與模型組比較△P＜0.05, △△P＜0.01；與空白組比較*P＜0.05,** P ＜0.01

4 結(jié)論與討論

人參與附子配伍比例為1:2時，抗慢性心力衰竭線粒體途徑心肌細(xì)胞凋亡的效果最佳，通過抑制慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)心肌，改善心功能。

心肌細(xì)胞的凋亡是受基因控制的細(xì)胞主動而有序的死亡過程，本論文采用腹腔注射ADR建立經(jīng)典大鼠慢性心力衰竭，參附注射液組、人參-附子1:2組與模型組相比，Bcl-2表達(dá)明顯升高（P＜0.01），Bax水平顯著降低（P＜0.01）；人參-附子1:1組、人參-附子2:1組大鼠心肌組織中Bcl-2（P＜0.05）高于模型組和空白組（P＜0.05或P＜0.01），人參-附子1:1組Bax水平低于模型組（P＜0.05），說明人參-附子藥對配伍不同配比均會影響B(tài)cl-2、Bax基因的表達(dá)，人參-附子1:2組與陽性對照組參附注射液作用效果較為接近。

論文中模型組大鼠心肌組織中C( cytc)、caspase-9 和caspase-3的含量顯著高于空白組（P＜0.01），推測是由于Bcl-2/Bax比值升高，促使心肌線粒體釋放大量C( CytC)，導(dǎo)致caspase基因的激活。推測參附注射液及人參-附子藥對不同配比組是通過降低抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)、提升促凋亡基因Bax表達(dá)，從而降低Bcl-2/Bax的比值，最終降低C( CytC)的釋放，達(dá)到降低caspase-9含量，最終抑制Caspase-3的激活，從而抑制細(xì)胞線粒體途徑心肌細(xì)胞凋亡(Mitochondrial pathway of apoptosis)，保護(hù)心肌，延緩心衰的發(fā)展，以人參-附子1:2配伍抗心肌細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)，提示增加附子得用量可以增強(qiáng)參附藥對抗慢性心肌衰竭的功能，這可能與附子補(bǔ)火助陽，溫陽強(qiáng)心作用有關(guān)。

[1] 唐昱.線粒體介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué).心血管疾病分冊,2009,32(5): 259.

[2] 于妍,王碩仁.參附注射液對肥大心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)外膜損傷的影響[J].中藥藥理與臨床，2013,29(4): 19.

[3] 蘇丹,李鵬飛,張柳,等.阿霉素心肌損傷大鼠模型的制備與評價[J].中國實(shí)驗動物學(xué)報，2009,17(6): 442.

（責(zé)任編輯：陳思敏）

Effect of different ration of Renshen-Fuzi on myocardial apoptosis in rats caused by chronic heart failure

Xuan, LI Jie, HE Yao, FU Chao-mei//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To study the effect of different dosage ration of Renshen and Fuzi on myocardial apoptosis in rat with chronic heart failure (CHF), explore the best dosage ration of Renshen and Fuzi in Shenfu Injection and clarify the relationship between compatibility and ef fi ciency.Method:CHF model was established by intraperitoneal injection of doxorubicin hydrochloride (ADR). Weight and heart weight index (WHI) were measured. Cardiac muscle tissue slice pathological injury were observed after HE. The indexes including Bcl-2, Bax, CytC, Caspase-9 and Caspase-3 were measures by qRT-PCR .Result:Shenfu Injection and different dosage ration of Renshen –Fuzi can decrease WHI of CHF rats, relieve myocardial ischemia in different level. They can also increase the expression of antiapoptotic genes (Bcl-2), decline the express of apoptosis gene (Bax),Cytc, Caspase 9, and Caspase 3 to inhibit mitochondrial pathway of myocardial cell apoptosis. Among them, Renshen-Fuzi1:2 group showed the strongest effect.Conclusion:The effect of Renshen –Fuzi 1:2 group on resistance to chronic heart failure mitochondrial pathway of myocardial cell apoptosis is the best. It is probably by inhibiting the expression of Bcl-2, raising Bax gene expression, to suppress the cytochrome C (Cytc) release, thus reduce Caspase - 9 and Caspase - 3 levels, eventually inhibit myocardial apoptosis in chronic heart failure rats and protect cardiac muscle and improve heart function.

Renshen; Fuzi; compatibility; chronic heart failure; apoptosis

/CAO Li-mei, ZHAO

] A

] 1674-926X(2017)02-013-04

國家自然科學(xué)基金委青年基金項目編號(81503266)

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137

曹麗梅（1991-），在讀碩士研究生，主要從事中藥新制劑、新技術(shù)與新工藝研究Tel:15208307202 Email:410501297@qq.com

趙萱，碩士，講師，主要從事中藥新制劑、新技術(shù)與新工藝研究Tel:13982277300 Email:626098860@qq.com

2016-09-15