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    醋制香附不同提取部位對(duì)肝郁血瘀模型大鼠的的影響

    2017-10-19 05:26:54季寧平周莉江嚴(yán)鑫盧君蓉王世宇傅超美
    中藥與臨床 2017年2期
    關(guān)鍵詞:血瘀模型

    季寧平,周莉江,嚴(yán)鑫,盧君蓉,王世宇,傅超美

    ·藥理毒理·

    醋制香附不同提取部位對(duì)肝郁血瘀模型大鼠的的影響

    季寧平,周莉江,嚴(yán)鑫,盧君蓉,王世宇*,傅超美

    目的:建立具有中醫(yī)證候特點(diǎn)的肝郁血瘀大鼠模型,探究醋香附治療肝郁血瘀的有效物質(zhì)基礎(chǔ),篩選其疏肝散瘀有效部位。方法:采用外界隨機(jī)刺激造模法及鹽酸腎上腺素所致的肝郁血瘀造模法,從體征變化、血液流變學(xué)兩方面指標(biāo)評(píng)價(jià)醋香附不同提取部位疏肝解郁化瘀的藥效學(xué)差異性,篩選出最佳活性部位。結(jié)果:給藥后,醋香附不同提取部位組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)均有所改善。體表瘀斑消散、乙酸乙酯組、乙醚組、正丁醇組能顯著性降低全血切變率1的水平,乙酸乙酯組亦能顯著性減低全血切變率5的水平(與模型組比較,P<0.05);石油醚組、乙醚組、正丁醇組可顯著性降低血漿粘度及紅細(xì)胞壓積水平(與模型組比較,P<0.05);乙酸乙酯組、水提組只能降低紅細(xì)胞壓積水平(與模型組比較,P<0.05);正丁醇組、水提組可顯著性降低血沉方程K值和紅細(xì)胞聚集指數(shù)(與模型組比較,P<0.05);石油醚組能顯著性升高全血高切還原粘度(與模型組比較,P<0.05);石油醚組、乙醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、水提組可顯著性減低血漿纖維蛋白原水平(與模型組比較,P<0.05))。結(jié)論:乙酸乙酯部位及石油醚部位為醋香附疏肝散瘀的主要有效提取部位,初步認(rèn)為醋香附是通過降低血液中的血漿纖維蛋白原、降低血液黏度以達(dá)到活血化瘀的功效。

    醋香附;提取部位;有效部位;活血化瘀

    香附來源于莎草科植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根莖,其性平,味辛, 微苦、微甘,主要具有疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛的功效[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為“七情變化,疏泄失職,氣機(jī)郁結(jié)不暢,多責(zé)之于肝”, 肝氣郁滯會(huì)導(dǎo)致氣機(jī)失調(diào),血液運(yùn)行不暢,從而出現(xiàn)血瘀證、郁證等?!侗静菝审堋分杏涊d香附:“若理氣疼,醋炒尤妙”。香附經(jīng)醋制后,可增強(qiáng)其疏肝解郁、活血散瘀之功效。目前以醋香附為焦點(diǎn),從化學(xué)成分變化、藥理藥效作用機(jī)理,胃腸吸收等差異,以及譜效結(jié)合等,正向多元化評(píng)價(jià)進(jìn)行,旨在揭示醋香附的藥理藥效,及醋制增效機(jī)理,但由于其物質(zhì)基礎(chǔ)研究不完善,阻礙了相關(guān)研究的深度進(jìn)行,這也是當(dāng)下醋香附研究的熱點(diǎn)之一[2]。因此本文憑借“肝郁氣滯”、“大怒致瘀”及“寒凝氣滯血瘀”等中醫(yī)理論,采用外界隨機(jī)刺激造模法及鹽酸腎上腺素復(fù)制肝郁血瘀大鼠模型[3-4],并觀察醋香附不同提取部位對(duì)血瘀證的影響,比較醋香附不同提取部位疏肝解郁化瘀的藥效學(xué)差異性,篩選出最佳活性部位。

    1 儀器與材料

    1.1 動(dòng)物

    清潔級(jí)SD大鼠70只,雌雄各半,體重250~270 g,四川省醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究中心提供(SPF級(jí)),合格證號(hào):SCXK(川)2013-15。

    1.2 儀器

    全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(上海東湖儀器試劑科技有限責(zé)任公司,MEK-6318K)、血液流變分析儀(天津市唐宇醫(yī)療器械科技發(fā)展有限公司,KIV型),雪花制冰機(jī)(美國Sciencetool圣斯特,ST200),電子稱(購于常熟市雙杰測(cè)試儀器廠,JJ600Y型,編號(hào):220611040170)。

    1.3 試藥

    醋香附飲片(四川省新荷花中藥飲片股份有限公司,批號(hào):D1207095),鹽酸腎上腺素注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司,批號(hào):140531),柴胡舒肝丸(天津天士力(遼寧)制藥有限責(zé)任公司,批號(hào):140408),烏拉坦、吐溫-80、95%乙醇、石油醚(60~90 ℃)、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純,均購于成都市科龍化工試劑廠。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 醋制香附不同提取部位藥液的制備

    將醋香附飲片粉碎過三號(hào)篩(目),100 g,用10倍量70%乙醇回流提取3次,每次1小時(shí),合并濾過,回收乙醇,得浸膏,備用。

    石油醚提取部位的制備:取適量70%乙醇提取浸膏混懸于水溶液中,使其濃度相當(dāng)于原生藥1 g.mL-1,取1/3水溶液體積的石油醚重復(fù)多次萃取,至石油醚層無色,收集石油醚萃取液,濃縮得到石油醚提取浸膏。

    乙醚提取部位的制備:將石油醚萃取后的水層,揮去石油醚至無石油醚味后,取適量乙醚重復(fù)多次萃取,至乙醚層無色,收集乙醚萃取液,濃縮得到乙醚提取浸膏。

    乙酸乙酯提取部位的制備:將乙醚萃取后的水層,揮去乙醚至無味后,取適量乙酸乙酯重復(fù)多次萃取,至乙酸乙酯層無色,收集乙酸乙酯層萃取液,濃縮得到乙酸乙酯提取浸膏。

    正丁醇提取部位的制備:將乙酸乙酯萃取后的水層,揮去乙酸乙酯至無味后,取適量正丁醇進(jìn)行多次重復(fù)萃取,至正丁醇層無色,收集正丁醇層萃取液,濃縮得到正丁醇提取浸膏。

    水提部位的制備:正丁醇萃取后的水層,揮去正丁醇至無味后,備用。將70%乙醇提取后的藥渣,用10倍量的水進(jìn)行煎煮提取3次,將3次水煎液合并濾過,合并萃取后剩余的水層,濃縮獲得水提浸膏。

    石油醚部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提部位:取適量的相應(yīng)提取浸膏,用3%吐溫-80溶液溶解,得到相當(dāng)于原生藥1.74 g.mL-1濃度的溶液,備用,灌胃前恢復(fù)溫度至37℃。

    柴胡舒肝丸的制備:取柴胡舒肝丸6 g,用研缽磨成細(xì)粉后,取適量加入3%的吐溫-80溶液20 mL研磨溶解成濃度為0.25 g.mL-1的均勻混懸液,置冰箱中備用,灌胃前恢復(fù)溫度至37 ℃。

    2.2 動(dòng)物分組及模型建立[5-7]

    2.2.1 動(dòng)物分組 取SD大鼠(雌雄各半)80只,按體重隨機(jī)分配為石油醚組、乙醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、水提組、陽性給藥組(柴胡舒肝丸)、空白對(duì)照組、模型組共8組,每組10只。

    2.2.2 造模與給藥 進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)2日后,除空白對(duì)照組外,采用外界刺激結(jié)合藥物刺激多種方法進(jìn)行輪流交替刺激法進(jìn)行造模,包括夾尾激怒、懸尾、晝夜顛倒、皮下注射鹽酸腎上腺素、鼠籠傾斜刺激、禁食禁水、冰水游泳、超聲刺激等多種刺激連續(xù)進(jìn)行15日。第16日起,陽性給藥組灌胃劑量為用臨床等效劑量的 10 倍量,即 1 g.kg-1;醋香附的不同提取部位組分別按照2010 年版《中國藥典》規(guī)定劑量的20 倍量,即按3.56 g.kg-1灌胃給藥??瞻捉M和模型組大鼠給予等體積的生理鹽水,連續(xù)7日。

    夾尾激怒:采用2種夾尾激怒方式,一種為將帶棉布的夾子對(duì)每只大鼠分別進(jìn)行夾尾5 min,讓各大鼠之間因疼痛而相互打架;另一種為各組中隨機(jī)抽取2只大鼠進(jìn)行夾尾刺激,通過這兩只大鼠而激怒其余同組的大鼠進(jìn)行刺激。

    懸尾刺激:大鼠頭部向下懸掛離地面30 cm,使其掙扎保持試圖逃跑卻無法逃跑的狀態(tài)保持15 min,保持懸掛狀態(tài)。

    晝夜顛倒:使大鼠生活環(huán)境呈晝夜顛倒?fàn)顟B(tài)24 h。

    皮下注射鹽酸腎上腺素:對(duì)大鼠進(jìn)行皮下注射鹽酸腎上腺素,給藥劑量為0.1 mL.(200)g-1。

    鼠籠傾斜刺激:將鼠籠傾斜放置,保持與地面呈30°的傾斜角度,使籠中大鼠處于隨時(shí)因籠體斜置而四肢抓籠的狀態(tài),保持24 h。

    冰水游泳:將制冰機(jī)制備成的碎冰放入水桶中,加水至水深50 cm,將大鼠放入水中,使其掙扎游泳。

    超聲波刺激:將大鼠置于超聲波清洗儀旁邊,將頻率調(diào)為60 Hz,使大鼠處于煩躁?duì)顟B(tài),15 min后,停止刺激。

    2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)的采集與檢測(cè)

    2.3.1 體征變化 每日稱量時(shí)注意觀察各大鼠耳朵和四肢顏色變化,及其起斑情況。

    2.3.2 血液流變學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 將所采集的血液樣本,采用血液流變儀進(jìn)行樣品血液流變學(xué)相關(guān)參數(shù)的測(cè)定。

    2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    3 試驗(yàn)結(jié)果

    3.1 體征變化

    與空白對(duì)照組大鼠相比較,各組大鼠從第4天起出現(xiàn)煩躁不安、易激怒、易相互撕咬的狀態(tài),第5天起,毛色開始變黃,且大鼠精神萎靡不振,喜好扎堆,飲食減少,飲水量減少,由于進(jìn)行給藥刺激,造成其急性淤血,大鼠足部及舌頭上均出現(xiàn)瘀紫現(xiàn)象,與文獻(xiàn)報(bào)道的肝郁型血瘀大鼠的體征相吻合,故可認(rèn)為造模成功。部分各給藥組給藥后,大鼠的毛色有變光澤趨勢(shì),食量增多,扎堆現(xiàn)象減輕,活動(dòng)量增加,足部瘀斑有消失趨勢(shì)。模型組,在停止刺激后,有一定的恢復(fù)趨勢(shì),瘀斑及一般外觀狀態(tài)有一定的改善,但相對(duì)于給藥組愈后較差。

    3.2 醋香附各提取部位對(duì)肝郁血瘀模型大鼠對(duì)血液流變學(xué)的影響

    由表1數(shù)據(jù)分析可知,與空白組相比,模型組中全血切變1、5,血漿粘度、血漿黏度、壓積、全血高切相對(duì)指數(shù)、血沉方程K值、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、全血高切還原粘度、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、血漿纖維蛋白原水平顯著升高(P<0.05),說明造模成功。與模型組比較,乙醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組全血切變率1水平顯著降低(P<0.05),具有顯著性差異;石油醚組、乙醚組、正丁醇組血漿粘度、壓積水平顯著降低(P<0.05),具有顯著性差異;乙酸乙酯組和水提組雖然與模型組不具有顯著性差異,但其數(shù)值仍存在降低趨勢(shì),表明仍具有化瘀作用,作用較弱。與模型組比較,正丁醇、水提組血沉方程K值及紅細(xì)胞聚集指數(shù)水平顯著降低(P<0.05),具有顯著性差異;石油醚組、乙醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、水提組血漿纖維蛋白原水平顯著降低(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在不同提取部位組中,唯石油醚組全血高切還原粘度與模型組比較,有顯著差異(P<0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 醋香附各提取部位對(duì)大鼠肝郁血瘀模型的血液流變學(xué)值的影響(±s,n=10 )

    表1 醋香附各提取部位對(duì)大鼠肝郁血瘀模型的血液流變學(xué)值的影響(±s,n=10 )

    正常對(duì)照組 模型組 柴胡舒肝丸組 石油醚組 乙醚組 乙酸乙酯組 正丁醇組 水提組全血切變率1 44.5060±3.0988△ 54.0567±2.3265* 45.8117±1.0089△ 50.5740±6.1144 48.7550±4.53175△ 46.0500±2.55423△ 48.1633±4.14285△ 47.3800±8.38348全血切變率5 17.7380±0.9256△ 20.5683±0.9099* 18.8233±0.6003△ 20.0783±1.9498* 19.5860±1.5387* 18.6320±0.9198△ 19.4300±1.2382 19.0983±2.4242全血切變率30 10.2780±1.5152 9.6367±0.6237 9.9150±0.4792 10.0167±0.9658 9.8300±0.7852 9.4880±0.4178 10.0417±0.4104 10.0533±1.14266全血切變率200 6.6183±1.7833 6.5283±0.37806 6.6683±0.3288 6.8117±0.8566 6.7317±0.7298 6.0567±1.2897 7.0000±0.4079 7.1067±0.9563血漿黏度 1.1567±0.0333 1.4133±0.0320* 1.2800±0.0237*,△ 1.2983±0.0557*,△ 1.2983±0.0431*,△ 1.3333±0.0547* 1.3517±0.0392*,△ 1.3550±0.0394*血沉 2.00±1.00 1.80±0.8367 2.60±1.5166 1 2.20±0.8367 2.25±1.50 1.80±0.4472 1.80±0.4472壓積 0.34±0.0237* 0.4983±0.0214* 0.4317±0.0232*,△ 0.4550±0.0281*,△ 0.4267±0.0175*,△ 0.4300±0.0235*,△ 0.4367±0.0197*,△ 0.4400±0.0141*,△全血高切相對(duì)指數(shù) 4.4620±0.5552 5.4400±0.2468* 5.1460±0.2374△ 5.1560±0.6209 5.2120±0.6199 4.9360±0.3174 5.2400±0.3710* 4.9780±0.3318

    注: “*”表示與正常對(duì)照組相比,P<0.05,“△”表示與模型組相比,P<0.05。

    4 結(jié)論與討論

    4.1 肝郁血瘀模型的建立及指標(biāo)評(píng)價(jià)

    肝郁證候動(dòng)物模型是研究較為成熟的中醫(yī)證候模型之一。目前,研究中醫(yī)的肝郁證候模型更多是從情志因素的影響出發(fā),利用對(duì)動(dòng)物情志上的刺激和折磨進(jìn)行郁證研究。本試驗(yàn)利用“怒傷肝,久則郁”的原理,結(jié)合經(jīng)典的外界隨機(jī)刺激造模法及鹽酸腎上腺素所致的急性血瘀造模法,形成肝郁型血瘀模型[8-9]。從大鼠外觀表征變化到各項(xiàng)血液檢查指標(biāo),包括全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、血漿纖維蛋白原等評(píng)價(jià)指標(biāo),其數(shù)值大小與血液黏度成正比,其值越小血液黏度越小,對(duì)給藥組而言,其值越小,藥物效果越好。均顯示出該造模方法可行、有效。

    4.2 醋香附不同提取部位對(duì)肝郁血瘀模型大鼠的綜合評(píng)價(jià)

    本文以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)思想,以中藥炮制“醋制入肝”理論為支撐,以疏肝代表藥醋香附為研究對(duì)象,針對(duì)目前醋香附疏肝理氣物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)理研究的不足,建立相關(guān)病證結(jié)合動(dòng)物模型,設(shè)計(jì)相關(guān)藥效學(xué)試驗(yàn),旨在從多角度篩選醋香附的有效部位。

    采用大鼠肝郁型血瘀模型,以醋香附的石油醚部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提部位灌胃給藥,測(cè)定小鼠血液的血液流變學(xué)及血常規(guī),采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,以篩選醋香附疏肝活血化瘀的有效部位。結(jié)果表明,各提取有效部位均能在一定程度上對(duì)肝郁血瘀行大鼠模型的瘀血情況加以改善,醋香附各提取部位的疏肝散瘀效果由強(qiáng)到弱的排序?yàn)椋阂宜嵋阴ゲ课唬臼兔巡课唬娟栃运幬铮疽颐巡课唬舅岵课唬菊〈疾课?。其中乙酸乙酯部位及石油醚部位相?duì)于其他提取部位的綜合評(píng)分較高,故可認(rèn)為此二者為醋香附疏肝散瘀的主要有效提取部位,可認(rèn)為醋香附的疏肝散瘀有效部位主要為其極性較小的成分。

    [1] 國家藥典委員會(huì)編,中國藥典.一部.中國醫(yī)藥科技出版社.第一版,2010:241.

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    (責(zé)任編輯:何瑤)

    In fl uences of different extracts of Xiangfu prepared with vinegar on liver of rat with liver stagnation and blood stasis /

    JING Ning-ping, ZHOU Li-jiang, YAN Xin, LU Jun-rong, WANG Shi-yu, FU Chao-mei//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education;National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources,Chengdu 611137, Sichuan)

    Objective:Based on traditional Chinese medicine, rat model of liver disease with liver stagnation and blood stasis was established to explore the material basis for effective treatment of liver stagnation and blood stasis of Xiangfu prepared with vinegar, and screen for the effective parts.Method:The model was established using random stimulating methods and epinephrine hydrochloride. The indexes of sign characteristics, blood rheology were used to evaluate the pharmacodynamics diversity of different extracts of Xiangfu prepared with vinegar and select the best active parts.Result:The indicators were improved after drug administration including dissipating of the surface ecchymosis. Ethyl acetate group, ether group and n-butanol group signi fi cantly decreased the level of blood shear rate 1 compare to model group (P<0.05). Ethyl acetate group also signi fi cantly reduced the level of blood shear rate 5 (P<0.05). Petroleum ether group, ether group, n-butanol group significantly decreased the level of plasma viscosity and hematokrit level (P<0.05). Ethyl acetate group, water extract group only reduced the level of hematokrit (P<0.05).N-butanol group, water extract group signi fi cantly reduced K value of erythrocyte sedimentation rate and red cell assembling index(P<0.05). Petroleum ether group signi fi cantly increased whole blood higher shear reductive viscosity (P<0.05). Petroleum ether group,ether group, ethyl acetate group, n-butanol group, water extract group signi fi cantly reduced the level of plasma fi brinogen(P<0.05).Conclusion:The best active parts were ethyl acetate extract and petroleum ether. It suggests that Xiangfu prepared with vinegar plays a role in promoting blood circulation to remove blood stasis by decreasing plasma fi brinogen and blood viscosity in the blood.

    Xiangfu prepared with vinegar; extract parts; effective parts; promoting blood circulation to remove blood stasis

    R 285.5

    A

    1674-926X(2017)02-016-04

    國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目 (81303227); 成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金 ( ZRQN1412);成都中醫(yī)藥大學(xué)?;穑╖RQN1653)

    成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,四川 成都 611137

    季寧平(1989-),助教,從事中藥新制劑、新劑型、新工藝研究,Tel:13882189250 Email:504749915@qq.com

    王世宇,教授,從事藥事管理學(xué)、中藥新劑型研究,Tel:028-61800231 Email:497217505@qq.com

    2016-12-05

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