熟三七飲片的HPLC指紋圖譜研究

連艷，黃鳳，蔣桂華

·品種品質(zhì)·

熟三七飲片的HPLC指紋圖譜研究

連艷，黃鳳，蔣桂華*

目的：建立熟三七飲片的HPLC指紋圖譜，為其鑒別及質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：采用HPLC方法，XAqua C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μ)色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-水（梯度洗脫），流速：1.0 mL．min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫25 ℃。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件對(duì)圖譜進(jìn)行處理。結(jié)果：建立了熟三七飲片的指紋圖譜，確定了16個(gè)共有峰，各熟三七樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度均在0.9以上。結(jié)論：該方法具有重復(fù)性好、特征性強(qiáng)、方法簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，可用于熟三七飲片的品質(zhì)評(píng)價(jià)。

熟三七；高效液相色譜；皂苷；指紋圖譜

三七為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根，始載于《本草綱目》，主產(chǎn)于我國(guó)云南、廣西等地，功效散瘀止血，消腫定痛。根據(jù)三七的不同炮制方法，炮制后的三七分“生三七”和“熟三七”。傳統(tǒng)中醫(yī)及民間對(duì)三七均有“生消熟補(bǔ)”之說，即生三七主要用于活血化瘀、止血止痛，熟三七主要用于補(bǔ)血和血，以滋補(bǔ)見長(zhǎng)?，F(xiàn)代研究表明，三七的主要活性成分為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷[1]。文獻(xiàn)報(bào)道[2-6]，生三七和熟三七的皂苷構(gòu)成做HPLC分析，結(jié)果有明顯的差異，蒸制過程中皂苷類成分發(fā)生轉(zhuǎn)化。本文采用HPLC法建立熟三七飲片的指紋圖譜，為解決生、熟三七品質(zhì)評(píng)價(jià)提供科學(xué)的方法。

1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀；DAD紫外檢測(cè)器； BT25S型1/10萬(wàn)電子分析天平，北京賽多利科學(xué)儀器有限公司。人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)：110703-201128，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；人參皂苷Rbl對(duì)照品(批號(hào)：110704-201424，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；人參皂苷Rh4對(duì)照品(批號(hào)：14072505，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)；人參皂苷20(S)-Rg3對(duì)照品(批號(hào)：14030604，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)；人參皂苷20(R)-Rg3對(duì)照品(批號(hào)：14052908，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)；三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào)：110745-201318，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；熟三七飲片，實(shí)驗(yàn)室自制樣品（批號(hào)：161101）；乙腈為色譜級(jí)，F(xiàn)isher Scienti fi c公司；其他試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑）。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 XAqua C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μ)；乙腈(A)-水(B) 為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫25 ℃；流速：1.0 mL．min-1；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫條件見表1，色譜圖見圖1.

表1 梯度洗脫程序

圖1 方法專屬性HPLC圖譜

2.1.2 參照物的選擇 三七的主要活性成分為皂苷類，蒸制過程中，生三七中的主要皂苷成分人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd和三七皂苷R1逐漸減少，同時(shí)有新的皂苷成分生成[2-5]，分別是人參皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5。本文結(jié)合藥效成分，同時(shí)兼顧生、熟三七中含有的成分，選擇三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3作為參照物，對(duì)熟三七飲片指紋圖譜進(jìn)行定位。

2.1.3 參照物溶液的制備 精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷20(S)-Rg3、人參皂苷20(S)-Rg3、人參皂苷Rh4及三七皂苷R1對(duì)照品適量，加甲醇制成每l mL 含三七皂苷R10.3 mg、人參皂苷 Rg11.0 mg、人參皂苷Rb11.0 mg、人參皂苷Rh40.2 mg、人參皂苷20(S)-Rg30.1 mg、人參皂苷20(R)-Rg30.06 mg的混合溶液，即得。

2.1.4 供試品溶液的制備 精密稱取熟三七粉末1.0 g，精密加入50 mL甲醇，稱定重量，超聲30 min，放至室溫，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取同一份熟三七飲片的供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖并積分，圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版處理，得到各次進(jìn)樣的相似度。結(jié)果表明，6次進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度均高于0.96，符合指紋圖譜測(cè)定要求，精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份熟三七飲片按供試品溶液制備方法處理，分別在0，2，4，6，8，24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖并積分，計(jì)算24 h內(nèi)進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度。結(jié)果表明，24 h內(nèi)進(jìn)樣所得指紋圖譜的相似度均高于0.96，符合指紋圖譜測(cè)定要求，穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批熟三七飲片6份，按供試品溶制備方法處理，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖并積分，計(jì)算6份藥材所得指紋圖譜的相似度。結(jié)果表明，6 份樣品所得指紋圖譜的相似度均高于0.97，符合指紋圖譜測(cè)定要求，重復(fù)性良好。

2.2 指紋圖譜的建立

精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液及“2.1.4”項(xiàng)下制備的供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄HPLC圖譜，生成10批次生三七及炮制品熟三七指紋圖譜，結(jié)果見圖2、3。通過與對(duì)照品的比較，確認(rèn)1號(hào)峰為三七皂苷R1，2號(hào)峰為人參皂苷Rg1，5號(hào)峰為人參皂苷Rb1，12號(hào)峰為人參皂苷Rh4，13號(hào)峰為人參皂苷20(S)-Rg3，14號(hào)峰為人參皂苷20(R)-Rg3，其中5號(hào)峰人參皂苷Rb1在色譜圖中處在中間位置，且較穩(wěn)定有助于色譜峰的辨認(rèn)，故選擇此峰為參照峰，得到熟三七飲片對(duì)照指紋圖譜見圖4。以 5號(hào)峰人參皂苷Rb1為參照，去除溶劑峰后確定16個(gè)共有峰為構(gòu)成熟三七飲片指紋圖譜的特征峰，樣品共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積分別列于表2、3。10批熟三七飲片與對(duì)照指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果分別為1.000，0.952，0.982，0.990，0.956，0.978，0.978，0.945，0.955，0.982。

圖2 10批生三七樣品匹配圖譜

圖3 10批熟三七樣品匹配圖譜

表2 10批熟三七飲片共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表3 10批熟三七飲片共有峰的相對(duì)峰面積

未知 0.519 0.412 0.438 0.387 0.398 0.387 0.433 0.421 0.394 0.412 9未知 0.264 0.166 0.180 0.203 0.136 0.151 0.188 0.131 0.153 0.170 10 未知 0.502 0.355 0.382 0.369 0.251 0.288 0.399 0.236 0.320 0.309 11 人參皂苷Rk3 1.559 0.689 0.687 0.876 0.623 0.686 0.774 0.655 0.662 0.723 12 人參皂苷Rh4 2.523 1.089 1.078 1.413 0.978 1.080 1.225 1.013 1.026 1.155 13 人參皂苷20(S)-Rg3 0.592 0.207 0.213 0.294 0.193 0.217 0.253 0.205 0.198 0.240 14 人參皂苷20(R)-Rg3 0.309 0.104 0.120 0.159 0.083 0.102 0.110 0.081 0.073 0.116 15 未知 1.037 0.370 0.389267 0.531 0.339 0.382 0.422 0.353 0.334 0.421 16 未知 1.376 0.478 0.506 0.708 0．429 0．493 0．543 0．442 0．416 0．549 8

3 討論

3.1 熟三七飲片HPLC指紋圖譜色譜條件考察，熟三七中皂苷類成分在反相HPLC上的分離規(guī)律：(1)有6個(gè)參照峰，按出峰順序依次為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd；(2)三七皂苷R1的分離度最好、最穩(wěn)定；(3)人參皂苷Rg1與人參皂苷Re基本不受其他成分干擾，但是兩峰之間的分離則較為困難，文獻(xiàn)報(bào)道[7]人參皂苷Rg1與人參皂苷Re兩成分獲基線分離的變量“窗口”相當(dāng)窄，絕大多數(shù)時(shí)候表現(xiàn)為完全重疊的單一色譜峰，本實(shí)驗(yàn)在0～30 min保持等度洗脫，且以18.9%的乙腈梯度分離效果較好。

3.2 以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rh4、人參皂苷20(S)-Rg3、人參皂苷20(S)-Rg3為對(duì)照峰確定了熟三七飲片的16個(gè)共有峰，并通過相似度計(jì)算軟件得到10批熟三七飲片的對(duì)照?qǐng)D譜及各批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度，結(jié)果均大于0.9，表明檢測(cè)方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，HPLC指紋圖譜可作為熟三七飲片的品質(zhì)評(píng)價(jià)方法。

3.3 在數(shù)百年臨床應(yīng)用中，三七被認(rèn)定為“外傷科之圣藥、止血之神藥、理血之妙品”，可治一切血證，得到了極高評(píng)價(jià)[8]，經(jīng)考證，三七補(bǔ)益功效有文字記載的最早時(shí)間是清朝，《本草綱目拾遺》首次記載了三七補(bǔ)益作用：“三七大如拳者治打傷，有起死回生之功，價(jià)與黃金等”，“三七頗類人參，人參補(bǔ)氣第一，三七補(bǔ)血第一，味同功亦等，故人并稱曰人參、三七為藥品中之最珍貴者”。指出了三七具有補(bǔ)益的功效，既能補(bǔ)血，又能補(bǔ)氣。此后，無(wú)論是醫(yī)家及民間對(duì)三七均有“生消熟補(bǔ)”之說[9]。曲媛等通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明人參皂苷Rh4的主要作用為抑制腫瘤[10]，人參皂苷Rg3為參一膠囊的主要成分，功效培元固本，補(bǔ)益氣血。三七炮制后人參皂苷Rg1、Rb1含量略有下降，但人參皂苷Rh4、人參皂苷20(S)-Rg3、人參皂苷20(S)-Rg3含量大幅增加，見圖1，進(jìn)而熟三七表現(xiàn)出“補(bǔ)益”作用，初步研究可知，三七生、熟異治可能因?yàn)槌煞纸M成變化及配比變化而導(dǎo)致，具體作用機(jī)制尚待深入探討。

[1] 曾江,崔秀明,周家明,等.三七根莖的化學(xué)成分研究[J].中藥材,2007,30(11):1388.

[2] Sun S, Wang C Z, Tong R, et al. Effects of steaming the root of Panax notoginseng on chemical composition and anticancer activities [J]. Food Chem, 2010,118:307.

[3] Lau A J, Seo B H, Woo S O, et al. High-performance liquid chromatographic method with quantitative comparisons of whole chromatograms of raw and steamed Panax notoginseng[J]. Journal of Chromatography A, 2004,1057(1–2):141.

[4] Lau A J, Woo S O, Koh H L. Analysis of saponins in raw and steamed Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array detection.[J]. Journal of Chromatography A, 2003, 1011(1–2):77.

[5] Liao P Y, Wang D, Zhang Y J, et al. Dammarane-type glycosides from steamed notoginseng.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2008, 56(5):1751.

[6] 任德權(quán).中藥指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)的意義與作用[J]. 中藥新藥與臨床藥理,2001,12(3):135.

[7] 賴宇紅,陳浩桉,區(qū)卓瑩,等.三七總皂苷指紋圖譜及含量測(cè)定HPLC條件的耐用性考察[J].中國(guó)天然藥物,2006,4(2):107.

[8] 徐冬英. 三七名稱及其有文字記載時(shí)間的考證[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2000, 17(3): 911.

[9] 田華詠,瞿顯友,熊鵬輝.中國(guó)民族藥炮制集成[M]. 北京: 中醫(yī)古籍出版社,2000.

[10] 曲媛,王承瀟,崔秀明.人參皂苷Rh4對(duì)小鼠移植性腫瘤的抑制作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014,26:782.

（責(zé)任編輯：何瑤）

HPLC fi ngerprint analysis of processed Sanqi decoction/

LIAN Yan, HUANG Feng, JIANG Gui-hua//(School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To establish the HPLC fingerprint chromatograms of processed Sanqi decoction, and provide evidence for the identi fi cation and quality control of processed Sanqi decoction.Method:The HPLC procedure was performed on XAqua C18chromatographic column. The mobile phase was acetonitrile and water in gradient elution with the fl ow rate of 1.0 mL．min-1. The detection wavelength was set at 203 nm and the column temperature was 25℃. The chromatograms was analyzed by “similarity evaluation system for chromatographic fi ngerprint of Traditional Chinese Medicine”.Result:Sixteen common peaks were selected as the fi ngerprint peaks of processed Sanqi decoction, and the similarities of the chromatograms were all larger than 0.9.Conclusion:The method of the HPLC fi ngerprint chromatogram is simple, accurate and stable, which is suitable for quality control of processed Sanqi decoction.

Processed Sanqi; HPLC; saponins; fi ngerprinting chromatogram

R 282

A

1674-926X(2017)02-008-04

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

連艷(1990- )，女，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥品種與質(zhì)量的研究工作Tel:18030415334 Email:715844015@qq.com

蔣桂華( 1970- )，女，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥品種與質(zhì)量的研究工作Tel:18980923782 Email:11469413@qq.com

2017-01-29