利用冷凍掃描電子顯微鏡觀察金納米顆粒原位標(biāo)記紅細(xì)胞膜陰離子通道蛋白

關(guān)鍵詞帶3蛋白；冷凍掃描電子顯微鏡；金納米顆粒；原位標(biāo)記；蛋白分布；蛋白島

膜蛋白在細(xì)胞生命活動中發(fā)揮著重要作用，包括物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附等[1-4]。膜蛋白的功能與其在細(xì)胞膜上的空間結(jié)構(gòu)位置密切相關(guān)，研究表明，膜蛋白傾向于聚集成蛋白簇發(fā)揮其生理功能[5-7]，然而，膜蛋白在細(xì)胞膜上的精確結(jié)構(gòu)位置目前尚不清楚。在天然狀態(tài)下，對細(xì)胞膜進(jìn)行成像并精準(zhǔn)定位膜蛋白對于深入理解膜蛋白在細(xì)胞生理活動中的功能機(jī)制具有重要意義。

在以往的研究中，熒光顯微鏡通常被用于研究細(xì)胞中特定蛋白的空間分布[8-10]，采用光學(xué)顯微鏡觀察抗體連接的熒光分子，對抗體所標(biāo)記的蛋白進(jìn)行定位成像。但是，即使是非常先進(jìn)的超分辨顯微成像技術(shù)，其分辨率也只能達(dá)到約20nm，而膜蛋白本身的直徑只有8nm左右，因此，很難采用光學(xué)顯微鏡精確繪制細(xì)胞膜蛋白的分布圖譜[11-12]。

紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的一類細(xì)胞，是人體內(nèi)傳輸氧氣和二氧化碳的主要媒介[13-14]。紅細(xì)胞通常呈雙凹圓盤狀，這種形狀不僅可增大其氣體交換面積，還可在穿過口徑更小的毛細(xì)血管時(shí)快速進(jìn)行形變和恢復(fù)[15]，而紅細(xì)胞變形能力的改變會導(dǎo)致體內(nèi)氧氣傳輸效率以及血流速率下降，引發(fā)一系列心血管疾病和代謝疾病。因此，紅細(xì)胞膜和膜蛋白是許多疾病研究的重要靶標(biāo)[16-18]。

帶3蛋白（Band3protein）是紅細(xì)胞膜上的陰離子通道蛋白，介導(dǎo)HCO3–/Cl–的跨膜交換，這是機(jī)體呼吸在細(xì)胞水平的基礎(chǔ)過程[19-20]；此外，帶3蛋白還與紅細(xì)胞的骨架相連，有助于維持細(xì)胞形狀[21]。近年來，有關(guān)帶3蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究取得了一系列進(jìn)展，2015年確定了其晶體結(jié)構(gòu)，證實(shí)了帶3蛋白含有14個(gè)具有復(fù)雜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的α-螺旋跨膜片段[22]；2022年，Xia等[23]通過冷凍電鏡解析了帶3蛋白相關(guān)的錨蛋白復(fù)合物的原子級分辨率結(jié)構(gòu)，闡述了其在紅細(xì)胞形成過程中可能的組裝方式。然而，生理狀態(tài)下帶3蛋白在紅細(xì)胞膜上的精確空間分布目前尚不清楚。

掃描電子顯微鏡常用于對樣品微區(qū)的形貌進(jìn)行高分辨率分析，其原理是利用聚焦的電子束在樣品表面進(jìn)行光柵式掃描，通過收集樣品表面被激發(fā)出的信號觀察并分析樣品的表面形貌，具有成像直觀、分辨率高、放大范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)的掃描電鏡要求樣品干燥且不易揮發(fā)，但生物樣品在經(jīng)歷脫水干燥等過程后通常無法維持其原始的生理結(jié)構(gòu)[24-25]。冷凍掃描電子顯微鏡可有效地解決此問題，超低溫樣品制備和成像技術(shù)使得細(xì)胞和生物組織等含水樣品可經(jīng)過快速冷凍后再進(jìn)行掃描電鏡觀察，并可維持其原本的結(jié)構(gòu)狀態(tài)[26]。

為了探究帶3蛋白在紅細(xì)胞膜上的精確定位和分布特征，本研究利用冷凍掃描電子顯微鏡對近生理狀態(tài)下的紅細(xì)胞膜進(jìn)行成像，結(jié)合金納米顆粒（Goldnanoparticles，GNPs）具有良好的導(dǎo)電性和生物相容性的特點(diǎn)[27]，通過構(gòu)建抗體-GNPs復(fù)合物，標(biāo)記出紅細(xì)胞膜上的帶3蛋白。本研究高分辨地展現(xiàn)了紅細(xì)胞膜表面的形貌特點(diǎn)，同時(shí)觀察到了GNPs所標(biāo)記的帶3蛋白在紅細(xì)胞膜上的空間分布，為進(jìn)一步理解帶3蛋白的結(jié)構(gòu)分布與功能機(jī)制提供了參考。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Sigma300掃描電子顯微鏡（德國蔡司公司）；PP3010T掃描電鏡冷凍制樣及傳輸系統(tǒng)（英國Quorum公司）；BioScopeResolve生物型原子力顯微鏡（美國布魯克公司）；TGL-21M高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；單晶硅片（10mm×10mm，中鏡科儀公司）。

NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4·12H2O（分析純，北京化工廠）；Au-PEG1000-COOH（50mg/mL，西安瑞禧生物公司）；帶3蛋白抗體（200mg/mL，美國Invitrogen公司）；1-3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳二亞胺（EDC）和N-羥基丁二酰亞胺（NHS）（99%，美國Sigma公司）；N，N-二異丙基乙胺（DIPEA）和3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）（99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1抗體修飾的GNPs的制備

取1mLAu-PEG1000-COOH（50mg/mL），按照n（—COOH）∶n（EDC）∶n（NHS）=1.0∶1.5∶1.5的比例加入EDC和NHS[28]，混勻，再加入10μL抗體（200mg/mL），室溫下連接反應(yīng)4h，60000r/min離心1h，棄去上清液以去除未連接的抗體，加入1mL低滲PBS緩沖液（7.5mmol/L，pH7.5）重懸。

1.2.2GNPs標(biāo)記人血紅細(xì)胞膜

參考文獻(xiàn)[5]的方法制備單層人血紅細(xì)胞膜。首先將硅片硅烷化：用乙醇將硅片超聲清洗干凈，干燥后，將硅片和2個(gè)干凈的小皿放在干燥器中，通入氬氣5min，在氬氣環(huán)境中向2個(gè)小皿中分別加入15μLDIPEA和50μLAPTES，再持續(xù)通入氬氣5min，密閉干燥，室溫放置4h以上。取20μL新鮮人指尖血，在PBS緩沖液（150mmol/L，pH7.5）中離心（1000r/min，2min）、清洗5次，棄上清液，加入10mLPBS緩沖液，混勻，滴加在硅烷化的硅片上，沉降30min，使紅細(xì)胞黏附在硅片上。用PBS緩沖液洗去未貼附的RBC，利用注射器及針尖形成的快速低滲PBS緩沖液柱剪切開紅細(xì)胞，去除頂端膜，獲取單層紅細(xì)胞膜。此時(shí)，紅細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)是向上的，采用低滲PBS緩沖液洗滌紅細(xì)胞膜5min，去除殘余骨架，再將細(xì)胞膜連同硅片放入小皿中，加入低滲PBS緩沖液浸沒。取1mL1.2.1節(jié)制備的抗體-GNPs連接產(chǎn)物加入小皿中，總體積為3mL，4℃孵育過夜。孵育完成后，將小皿中的溶液吸出，先后采用低滲PBS緩沖液和0.3mol/LNaCl溶液進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的GNPs。

1.2.3非特異性吸附的GNPs清洗對照實(shí)驗(yàn)

制備兩組相同的細(xì)胞膜樣品，步驟與1.2.2節(jié)相同，向小皿中直接加入1mLAu-PEG1000-COOH，總體積為3mL，4℃孵育過夜。將小皿中的溶液吸出，第一組先后采用低滲PBS緩沖液和0.3mol/LNaCl溶液進(jìn)行清洗，第二組僅采用低滲PBS緩沖液進(jìn)行清洗。

1.2.4紅細(xì)胞膜的冷凍掃描電子顯微鏡成像

采用液氮泥快速冷凍的辦法制備冷凍樣品[26]，隨后轉(zhuǎn)移至冷凍傳輸裝置中，提升溫度至–95℃并維持10min，使表面的冰升華以暴露出細(xì)胞膜，再采用掃描電鏡觀察。掃描電鏡成像采用鏡筒內(nèi)電子探測器（In-lens模式），電壓選擇0.5～3.0kV，工作距離lt;2mm。

1.2.5紅細(xì)胞膜的原子力顯微鏡成像

采用SCANASYST-FLUID+原子力掃描探針以峰值力成像模式探測紅細(xì)胞膜胞質(zhì)側(cè)結(jié)構(gòu)，掃描速度為0.4Hz，掃描密度為256×256像素。數(shù)據(jù)采用NanoScopeAnalysis和Gwyddion軟件進(jìn)行分析和處理[29]。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

通過觀察所獲圖像中GNPs的位置，可得出特異性標(biāo)記的帶3蛋白的空間分布。采用MATLAB軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，處于預(yù)定距離內(nèi)的點(diǎn)被視作一個(gè)蛋白簇。分析細(xì)胞膜上蛋白簇的特征，包括蛋白簇的密度和蛋白簇所含的蛋白數(shù)量。

2結(jié)果與討論

2.1冷凍掃描電鏡對紅細(xì)胞膜進(jìn)行成像

人血紅細(xì)胞膜的厚度約為10nm，主要由磷脂和蛋白質(zhì)組成，組成元素主要為C、H、O、N和P等不導(dǎo)電的輕元素[30]。為了得到更好的紅細(xì)胞膜掃描電鏡圖像，實(shí)驗(yàn)中未對細(xì)胞膜表面進(jìn)行導(dǎo)電噴涂，最大限度地保留其原始形貌，同時(shí)通過低電壓減少荷電效應(yīng)和對樣品的破壞，設(shè)置盡可能小的工作距離，并采用In-lens模式收集樣品極表面的信號，進(jìn)而獲得真實(shí)且高分辨率的圖像[31]。圖1A展示了冷凍掃描電鏡下的單個(gè)紅細(xì)胞膜，直徑約為8μm，符合人血紅細(xì)胞的直徑大小范圍，表面可看見較暗襯度的凸起，并緊密連接，在膜上形成了交叉網(wǎng)絡(luò)狀分布（圖1A和1C），結(jié)合細(xì)胞膜表面成分，這些黑色的凸起應(yīng)為細(xì)胞膜胞質(zhì)側(cè)表面的膜蛋白，單個(gè)膜蛋白的直徑多在6～8nm范圍內(nèi)，而這些膜蛋白復(fù)合體的直徑主要分布在65～120nm之間，說明膜蛋白在細(xì)胞膜表面傾向于緊密聯(lián)系并形成蛋白簇，也可稱之為“蛋白島”，這與之前對膜蛋白的研究結(jié)果相符[5-7]。本研究組曾通過原子力顯微鏡在單分子層面對生理狀態(tài)下的紅細(xì)胞膜進(jìn)行成像，并提出了紅細(xì)胞膜的Semi-mosaic模型[5]，為了驗(yàn)證本研究成像的真實(shí)性及可靠性，采用原子力顯微鏡對同一細(xì)胞膜樣品進(jìn)行成像（圖1B），所得的原子力顯微圖像與以往研究結(jié)果相類似，原子力顯微成像中較高的蛋白顆粒與掃描電鏡成像中較暗襯度的形貌也可一一對應(yīng)。此外，由于In-lens模式成像的立體效果差，為了觀察膜蛋白的高度，將黏附了樣品的硅片從中間斷裂，傾斜80°進(jìn)行成像，可以見到高度約10nm的膜蛋白（圖1E），而原子力顯微鏡對膜蛋白的高度測量在6～8nm左右（圖1D），這個(gè)差距可能是因?yàn)樵诶鋬鲋茦舆^程，雖然對細(xì)胞膜表面的冰進(jìn)行了升華，但仍有一層很薄的冰（2～4nm）包裹了膜蛋白，有利于保護(hù)細(xì)胞膜不受電子轟擊的破壞。

綜上，利用冷凍掃描電子顯微鏡對細(xì)胞膜進(jìn)行成像是一種高效可行的細(xì)胞膜研究方法。本研究通過冷凍掃描電子顯微鏡觀察到了生理狀態(tài)下的人血紅細(xì)胞膜及膜蛋白的形貌，顯示出膜蛋白在細(xì)胞膜上成簇的網(wǎng)絡(luò)狀分布。

2.2GNPs標(biāo)記人血紅細(xì)胞膜上的帶3蛋白

GNPs常用于生物物理學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷和治療等領(lǐng)域的研究[32]，具有良好的生物相容性；同時(shí)，GNPs具有導(dǎo)電性和較高的電子密度，可廣泛應(yīng)用于生物電鏡成像領(lǐng)域。蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)特定位置的分布模式直接影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，帶3蛋白在紅細(xì)胞膜蛋白中占比最高，并且直接參與了紅細(xì)胞氣體交換與運(yùn)輸這一基本生理過程，探究帶3蛋白在生理?xiàng)l件下的分布狀態(tài)有助于理解其在細(xì)胞水平上的功能機(jī)制。

本研究選擇PEG1000-COOH包被的GNPs，PEG1000可對GNPs進(jìn)行包裹，減少非特異性吸附[33]，—COOH可用于連接帶3蛋白抗體，使GNPs通過抗原-抗體的相互作用實(shí)現(xiàn)對帶3蛋白的標(biāo)記。帶3蛋白的直徑約為6nm，大粒徑的GNPs有可能會導(dǎo)致相鄰分布的帶3蛋白由于GNPs自身空間位阻的原因而遺漏標(biāo)記；但是，如果選擇粒徑過小的GNPs，除了孵育過程中GNPs自身的穩(wěn)定性易被破壞外，掃描電鏡成像效果也會大幅降低。綜合考慮實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性、成像清晰度和蛋白自身的大小等因素，本研究選擇5nm的GNPs對帶3蛋白進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)過程見圖2A。在抗體修飾過程中，抗體的添加量遠(yuǎn)大于GNPs，多余的抗體會通過離心去除，得到GNPs標(biāo)記的帶3蛋白。

GNPs與蛋白之間可非特異性吸附，PEG1000的包被可在一定程度上減輕該吸附；同時(shí)，在清洗過程中加入了高濃度鹽溶液，去除非特異性吸附的GNPs，并通過未連接抗體的GNPs的對照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證（圖3A和3B），因此，可以認(rèn)為這些GNPs的定位代表了細(xì)胞膜上帶3蛋白的分布位置。標(biāo)記GNPs后的人血紅細(xì)胞膜整體形貌與標(biāo)記前相似（圖3C），說明在標(biāo)記過程中很好地維持了細(xì)胞膜的生理狀態(tài)，當(dāng)提高放大倍數(shù)后，在圖像中清晰可見5nmGNPs均勻地分布在整個(gè)細(xì)胞膜上，并且都定位在襯度較暗的蛋白區(qū)域（圖3D和3E）。將這些GNPs的坐標(biāo)提取出來進(jìn)一步分析，由于帶3蛋白的直徑約為6nm，考慮到GNPs與帶3蛋白的相對位置并不清楚，本研究以2個(gè)帶3蛋白的直徑（12±2）nm為GNPs之間距離的閾值，將在此范圍內(nèi)的點(diǎn)劃分為一簇，發(fā)現(xiàn)1/2的帶3蛋白會形成不同數(shù)量的蛋白簇，圖3F展示了劃分結(jié)果，同一顏色的點(diǎn)代表相同的簇。對比原始圖像（圖3E）與劃分結(jié)果（圖3F）可知，同一簇內(nèi)的帶3蛋白均屬于一個(gè)蛋白島?；贒BSCAN算法對這些簇進(jìn)行聚類分析[34]，得出每個(gè)聚類中帶3蛋白的典型數(shù)量（主要為2～3個(gè)，圖3G）和聚類密度（（40.1±2.8）Cluster/μm2，圖3H）。

研究表明，帶3蛋白、4.2蛋白與錨蛋白會形成大的錨蛋白復(fù)合體，有助于維持紅細(xì)胞的形狀和完整性，而帶3蛋白通常從形成二聚體開始，通過與4.2蛋白相互作用而形成不同的亞復(fù)合物，最終形成完整的錨蛋白復(fù)合物[23]。在本研究中，帶3蛋白的二聚體數(shù)量最多（67%），這也說明了帶3蛋白通常以二聚體形式結(jié)合其它蛋白成為復(fù)合體而發(fā)揮作用，聚集體多達(dá)40個(gè)/μm2，確保紅細(xì)胞保持雙凹圓盤形的狀態(tài)，并在變形后可迅速通過遍布細(xì)胞膜的致密網(wǎng)絡(luò)狀分布的錨蛋白復(fù)合體恢復(fù)原本的形狀，從而繼續(xù)行駛其生理功能。但是，紅細(xì)胞膜上也存在較多的單體和三聚體，說明二聚體并不是帶3蛋白發(fā)揮作用的唯一形式。除了維持紅細(xì)胞的形態(tài)外，帶3蛋白還介導(dǎo)了機(jī)體氣體運(yùn)輸?shù)碾x子交換，在這個(gè)過程中帶3蛋白極有可能是作為單體與其它蛋白發(fā)生相互作用而實(shí)現(xiàn)此生理功能?？傊狙芯客ㄟ^GNPs偶聯(lián)抗體標(biāo)記帶3蛋白并利用冷凍掃描電鏡技術(shù)對細(xì)胞膜進(jìn)行成像，可得到帶3蛋白在細(xì)胞膜上的定位，并繪制帶3蛋白的分布圖譜（圖2B）。結(jié)果表明，帶3蛋白在細(xì)胞膜整體上均勻密集分布，在蛋白島中主要以單體和二聚體形式存在，這也有利于帶3蛋白與其它蛋白相互作用，發(fā)揮其生物學(xué)功能，此結(jié)果有助于研究者深入理解帶3蛋白的作用機(jī)理，揭示機(jī)體在進(jìn)行基本的氣體交換的生理過程中帶3蛋白與其蛋白復(fù)合體發(fā)揮的關(guān)鍵作用。此外，帶3蛋白與多種疾病相關(guān)，包括心腦血管疾病和代謝疾病等，了解帶3蛋白的分布有助于相關(guān)藥物的設(shè)計(jì)和研發(fā)。在后續(xù)研究中，通過研究蛋白質(zhì)在疾病狀態(tài)下的分布變化，可以發(fā)現(xiàn)潛在的疾病機(jī)制，并為建立治療策略提供參考。

3結(jié)論

膜蛋白在細(xì)胞膜上的空間分布與細(xì)胞的許多功能和重要生物過程密切相關(guān)。本研究采用冷凍掃描電鏡對人血紅細(xì)胞膜的胞質(zhì)側(cè)進(jìn)行了高分辨率的形貌觀察，通過低溫成像技術(shù)以及細(xì)胞膜的液氮快速冷凍技術(shù)，確保了細(xì)胞膜及膜蛋白的近生理狀態(tài)。GNPs具有優(yōu)越的導(dǎo)電性和電子密度，可作為電鏡成像標(biāo)志物；同時(shí)，GNPs良好的生物相容性可以維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不被破環(huán)，抗體與GNPs的偶聯(lián)使GNPs可特異性地標(biāo)記帶3蛋白。結(jié)果顯示，膜蛋白在人血紅細(xì)胞膜上呈網(wǎng)狀聚集分布，形成了不同尺寸的蛋白島，帶3蛋白在整體上均勻分布在細(xì)胞膜上的蛋白島中，并在蛋白島中形成小的聚集體，可作為功能微區(qū)發(fā)揮相應(yīng)的生理功能。本研究精確地繪制出了人血紅細(xì)胞膜胞質(zhì)側(cè)的蛋白島形貌圖，同時(shí)定位了帶3蛋白在細(xì)胞膜上的分布。GNPs標(biāo)記與冷凍掃描電鏡的結(jié)合可以精確定位特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜上的位置，為進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)島的結(jié)構(gòu)組成以及細(xì)胞膜功能與蛋白質(zhì)島之間的關(guān)系提供了新的研究方法和證據(jù)；同時(shí)，增加了對膜蛋白分布模式的了解，有助于在分子和細(xì)胞水平上深入認(rèn)識結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系，為疾病治療和藥物開發(fā)提供參考。