丁基膠塞細菌內(nèi)毒素檢查方法研究

張偉+陳瑞超+蘆錦

摘 要： 丁基膠塞作為常用藥品包材，無論是生產(chǎn)還是使用階段均會與藥品產(chǎn)生直接接觸，為保證其質(zhì)量達標，必須要對其進行熱源檢查。而在實際檢查中，為避免熱源法敏感度對最終檢查結果準確性的影響，多選擇應用細菌內(nèi)毒素檢查法處理，具有更高的靈敏性。本文主要以丁基膠塞作為對象，對其細菌內(nèi)毒素檢查方法要點與控制措施進行了簡單分析。

關鍵詞： 丁基膠塞；細菌；內(nèi)毒素檢查

丁基膠塞具有較強的化學穩(wěn)定性、氣密性、潔凈性以及生物性，是比較常見的藥品包材，但是因為配方復雜性以及原材料所選不同，會存在部分活性較強的分在封裝后與藥品產(chǎn)生反應，出現(xiàn)膠塞與藥物之間的相容性問題。為確保所用丁基膠塞質(zhì)量達標，需要對其進行細菌內(nèi)毒素檢查，確認是否存在細菌內(nèi)毒素污染情況，保證藥品、器械的安全性。

一、細菌內(nèi)毒素檢查法原理

細菌內(nèi)毒素為與革蘭陰性菌細胞壁相關的一種熱原物質(zhì)，也是目前發(fā)現(xiàn)普遍處于水溶液容重的熱原，可以作為藥品安全性檢查的重要指標。細菌內(nèi)毒素多由革蘭陰性菌產(chǎn)生，為細胞壁最外層部分脂多糖，同時含有親水多糖鏈與輸水脂肪酸鏈，使其在水溶液內(nèi)具有自然聚集成團特點。表現(xiàn)在機體上，如致死毒性、發(fā)熱性、體重減輕、白細胞減少等；表現(xiàn)在細胞水平上，如阻止巨噬細胞游走以前列腺抗腫瘤壞死等。基于其特性，可以通過細菌內(nèi)毒素檢查法確認藥品質(zhì)量是否達標，對比傳統(tǒng)家兔熱原檢測方法，此種檢查方法具有更大應用優(yōu)勢，檢查結果也更為精確[1]。檢查時主要是利用鱟試劑與細菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應機制，確認試驗品細菌內(nèi)毒素限量是否合理，主要包括凝膠法與光度測定法兩種，且光度測定法又可分為濁度法與顯色基質(zhì)法，現(xiàn)在在實際應用中標準化程度不斷提高。

二、細菌內(nèi)毒素檢查影響因素

在應用細菌內(nèi)毒素檢查方法時，需要保證試驗過程的無菌性，全程采取無菌操作，避免微生物對供試品產(chǎn)生影響，而降低檢查結果準確性。因此，在試驗前需要對實驗室進行全面清潔，并利用紫外燈持續(xù)滅菌1h，然后在百級凈化臺上實驗操作，盡量減小動作幅度，最大程度上來避免試管的振動。另外，還要提前準備好實驗所需的各項器皿，并全面清潔消毒，確保不存在外源性內(nèi)毒素，一般可將其置于250℃條件下持續(xù)干烤60min[2]。以凝膠法實驗過程為例，要求細菌內(nèi)毒素檢查用水內(nèi)毒素含量在0.015ml～1之間。部分供試品還要進行復溶、稀釋處理，或者是在水性溶液內(nèi)浸提制成供試品溶液，并控制溶液pH在6.0～8.0之間，確保可以正常凝聚。就以往經(jīng)驗來看，溶液pH值過高或過低均會對部分內(nèi)毒素產(chǎn)生損壞，降低鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生的聚集效果。而對于自身酸堿性較大，或者具有緩沖能力的供試品，需要提前對被測溶液pH進行調(diào)整，將其控制在技術要求范圍內(nèi)。其中，在對溶液進行稀釋時，可以利用漩渦混合器，促使溶液均勻混合，盡量避免出現(xiàn)假陽性或者假陰性結果，提高檢查結果的準確性與代表性。

三、丁基膠塞細菌內(nèi)毒素檢查實驗

1.實驗準備

1.1儀器

電熱恒溫水浴箱與渦輪混合器，數(shù)量若干的玻璃器皿，且要對所有玻璃用具進行250℃條件下的1h干熱滅菌，以免存在外源性內(nèi)毒素。

1.2試劑

靈敏度為0.5EU/mL的鱟試劑，為保證實驗結果的準確性，可以分別選擇同靈敏度的多種批號試劑。還需要提前準備好效價為150EU/支的細菌內(nèi)毒素工作標準品，細菌內(nèi)毒素檢查用水以及注射用鹵化丁基膠塞[3]。

2.實驗方法

2.1 靈敏度復核

以《中國藥典》相關規(guī)定與資料作為依據(jù)，對鱟試劑進行靈敏度復核，可得三種不同批號的鱟試劑靈敏度均符合要求。

2.2制備浸提液

在制備浸提液時，需要保證全程無菌操作，排除微生物對試驗結果的影響。選取3支相同批號的注射用鹵化丁基膠塞，然后用純化水將其沖洗干凈，用濾紙吸收剩余水分，放置到250mL的廣口瓶內(nèi)并加塞處理，最后將廣口瓶放入壓力蒸汽滅菌器內(nèi)，保持115℃條件持續(xù)滅菌30min。滅菌結束后按照表面積加入50mL細菌內(nèi)毒素檢查用水，確保能夠將膠塞全部浸沒，重新將廣口瓶加塞密封，后放置于37±1℃恒溫水浴內(nèi)保溫72±2h。其中，在保溫階段還需要進行數(shù)次振蕩處理，避免產(chǎn)生微生物。保溫時間結束后取出冷卻，作為注射用鹵化丁基膠塞的浸提液。

2.3預干擾試驗

按照樣品表面積：水為1：0.5比例選取注射用鹵化丁基膠塞浸提液，并用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋，獲得1：0.5、1：1、1：2、1：3、1：4功5種濃度的溶液。利用細菌內(nèi)毒素檢查用水來對細菌內(nèi)毒素進行稀釋，得到0.25λ、0.5λ、λ、2λ共4種濃度溶液[4]。然后利用細菌內(nèi)毒素標準品配置不同濃度的樣品陽性液，按照專業(yè)標準進行預干擾試驗。

2.4供試品干擾試驗

根據(jù)《中國藥典》內(nèi)容進行供試品預干擾試驗，即選擇細菌內(nèi)毒素檢查用水與注射用鹵化丁基膠塞浸提液，加入到同支細菌內(nèi)毒素溶液內(nèi)，且每一個濃度均需要做4管平行試驗。然后選擇細菌內(nèi)毒素工作標準品0.25λ、0.5λ、λ、2λ的細菌內(nèi)毒素溶液，同樣每一濃度做4管平行試驗。另外，對細菌內(nèi)毒素檢查用水以及注射用鹵化丁基膠塞浸提液做2管陰性對照試驗。最大濃度2.0λ均設定為陽性，最低濃度0.25λ則均為陰性，按照工程En=lg（∑X/4）計算，分別確定細菌內(nèi)毒素檢查用水與注射用鹵化丁基膠塞浸提液所制細菌內(nèi)毒素標準溶液的反應終點幾何平均值En與Et，其中X表示細菌內(nèi)毒素檢查用水或者注射用鹵化丁基膠塞浸提液制成的細菌內(nèi)毒素標準溶液反應終點濃度對數(shù)值。當En處于0.5λ～2.0λ時，Et在0.5En～2.0En時，確認注射用鹵化丁基膠塞浸提液不干擾試驗。

3.結論分析

經(jīng)過試驗后可以確定，0.5EU/支的鱟試劑作為干擾試劑時，Et值在0.5En～2.0En范圍內(nèi)，即注射用鹵化丁基膠塞浸提液不會對細菌內(nèi)毒素試驗產(chǎn)生干擾，確定細菌內(nèi)毒素檢查法對丁基膠塞的熱原檢查可行。

結束語：

應用細菌內(nèi)毒素檢查法來確定丁基膠塞質(zhì)量是否達標，對比以往檢查方法其具有更大的優(yōu)勢，但是整個過程要做好細節(jié)管理，消除各類因素的影響，保證檢查結果的可靠性?！?/p>

參考文獻

[1] 裴宇盛，蔡彤，高華.細菌內(nèi)毒素檢查新方法進展[J].藥物分析雜志，2014，（03）：392-395.

[2] 肖貴南，孫清萍，盛英美.如何建立新藥的細菌內(nèi)毒素檢查方法[J].中國醫(yī)藥導報，2011，（32）：159-160+162.

[3] 張義偉.細菌內(nèi)毒素檢查的幾點體會[J].中國實用醫(yī)藥，2010，（03）：86-87.

[4] 張之奎，梁風芹，辛國忠，于文勝，鄭勇強.注射用鹵化丁基橡膠塞的細菌內(nèi)毒素檢查法[J].中國藥業(yè)，2007，（02）：41-42.