miR—21在心肺復(fù)蘇后大鼠血漿中的表達(dá)意義

何愛文　王東升　張倩倩

[摘要] 目的 探討微小RNA-21（miR-21）在心肺復(fù)蘇（cardiopulmonary resuscitation，CPR）后大鼠血漿中的表達(dá)差異及其意義。 方法 SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)對(duì)照組（對(duì)照組）和心肺復(fù)蘇組（CPR組），每組16只。采用窒息法建立大鼠心肺復(fù)蘇模型，測(cè)定大鼠氣管切開后（對(duì)照組）或心肺復(fù)蘇后（CPR組）24 h的心率（HR）、左室收縮末壓（LVESP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室內(nèi)壓的最大上升和下降速率（±dp/dtmax）等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。兩組于氣管切開后（對(duì)照組）或心肺復(fù)蘇后（CPR組）24 h取全血，離心取血漿，提取總miRNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測(cè)血漿miR-21含量并分析血漿miR-21在兩組中表達(dá)的差異。測(cè)定CK、CK-MB和cTnI，并分析血漿miR-21與上述指標(biāo)的相關(guān)性。采用計(jì)算受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）評(píng)估m(xù)iR-21、CK、CK-MB及cTnI診斷CPR后心功能障礙的效能。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，CPR組大鼠HR、LVSEP、LVEDP、±dp/dtmax及血漿miR-21、CK、CK-MB、cTnI表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。相關(guān)分析表明，CPR后大鼠血漿miR-21的表達(dá)量與CK、CK-MB、cTnI和LVEDP呈正相關(guān)性，與HR、LVSEP和±dp/dtmax呈負(fù)相關(guān)（P<0.01）。血漿miR-21、CK、CK-MB和cTnI的曲線下面積分別為0.859、0.719、0.803、1.000。 結(jié)論 miR-21可能參與了CPR后心功能障礙，血漿miR-21可能是CPR后心肌損傷潛在的診斷學(xué)標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] 心搏驟停；心肺復(fù)蘇；心功能障礙；微小RNA-21；qRT-PCR

[中圖分類號(hào)] R459.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）24-0037-04

[Abstract] Objective To investigate the difference of microRNA-21（miR-21）expression in rat plasma after cardiopulmonary resuscitation（CPR） and its significance. Methods SD rats were randomly divided into sham operation control group（control group）and cardiopulmonary resuscitation group（CPR group）， with 16 rats in each group. The model of cardiopulmonary resuscitation in rats was established by using smothering method. Hemodynamic parameters were measured after tracheotomy（control group） or after cardiopulmonary resuscitation（CPR group）， such as heart rate（HR）， left ventricular end-systolic pressure （LVESP）， left ventricular end-diastolic blood pressure（LVESP）， maximum rise and fall rate of left ventricular pressure （±dp/dtmax） and other hemodynamic parameters. Whole blood was collected 24 h after tracheotomy （control group） or cardiopulmonary resuscitation（CPR group）in both group， the plasma was collected after centrifuge， and total miRNA was extracted. The plasma miR-21 content was measured by real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）and the difference of plasma miR-21 expressions between the two groups was analyzed. CK， CK-MB and cTnI were measured and the correlation between plasma miR-21 and the above indexes were analyzed. The efficacy of miR-21， CK， CK-MB and cTnI in the diagnosis of cardiac dysfunction after CPR was assessed by calculating the area under the ROC curve（AUC）. Results Compared with the control group， the differences of expressions of HR， LVSEP， LVEDP， ± dp/dtmax and plasma miR-21， CK， CK-MB and cTnI in CPR group were statistically significant（P<0.01）. Correlation analysis showed that the expression volume of miR-21 in rat plasma after CPR was positively correlated with CK， CK-MB， cTnI and LVEDP， and negatively correlated with HR， LVSEP and ± dp/dtmax（P<0.01）. The area under the curves of plasma miR-21， CK， CK-MB and cTnI were 0.859， 0.719， 0.803 and 1.000 respectively. Conclusion miR-21 may be involved in cardiac dysfunction after CPR. Plasma miR-21 may be a potential diagnostic marker for myocardial injury after CPR.endprint

[Key words] Cardiac arrest； Cardiopulmonary resuscitation； Cardiac dysfunction； MicroRNA-21； qRT-PCR

心搏驟停（cardiac arrest，CA）作為最嚴(yán)重的全身性缺血缺氧損傷，嚴(yán)重威脅人類健康。隨著“生命之門”之現(xiàn)代CPR術(shù)50余年的發(fā)展與推廣，越來越多的CA患者得到及時(shí)救治并恢復(fù)自主循環(huán)（recovery of spontaneous circulation，ROSC），但仍有約30%的患者在ROSC后24 h內(nèi)死亡，CPR后心功能障礙是患者復(fù)蘇后早期死亡的主要原因之一[1]。目前尚缺乏早期、準(zhǔn)確、敏感的預(yù)警指標(biāo)評(píng)估CPR后心功能障礙，目前主要參照的是冠心病相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，其存在一定的局限性，因此需要尋找新的生物標(biāo)志物，為臨床上對(duì)CPR后心功能障礙的早期診斷、治療和預(yù)后判斷提供依據(jù)[2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性的非編碼微小RNA，通過完全或不完全性配對(duì)方式與互補(bǔ)mRNA結(jié)合，從而降解靶mRNA或抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯，可調(diào)控30%以上的人類基因表達(dá)[3]。2008年Mitchell PS等[4]在研究前列腺癌時(shí)首次報(bào)道了血漿miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在血清或血漿中可以穩(wěn)定地存在，其不受內(nèi)源性核糖核酸酶（RNase）活性的影響，使得miRNA有望成為疾病的生物學(xué)標(biāo)志物。研究已發(fā)現(xiàn)[5]，血漿miR-21在冠心病患者中表達(dá)明顯升高，提示其可能參與了心肌梗死后心肌損傷過程，是急性心肌梗死潛在的診斷學(xué)標(biāo)志物。但目前尚未見有關(guān)于CPR后血漿miR-21表達(dá)情況的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用窒息法建立大鼠CA/CPR模型，檢測(cè)大鼠CPR后血漿miR-21的表達(dá)變化，并探討血漿miR-21在心肺復(fù)蘇后心肌損傷中的意義，為CPR后心功能障礙的診斷與預(yù)警方面提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取2015年7月～2016年1月間成年雄性SD大鼠32只，體重320～400 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2015-0007），由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心負(fù)責(zé)飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；梯度PCR儀、凝膠成像儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；UV751GD紫外/可見分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；Univerval-32R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；7600生化儀（上海申能生物技術(shù)有限公司）；Access免疫化學(xué)發(fā)光分析儀（美國(guó)Beckman公司）；MedLab-U/4CS生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（南京美易科技有限公司）；HX-300動(dòng)物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）。miRcute miRNA Isolation Kit（天根生化科技北京有限公司），Trizol LS Reagent（美國(guó)Invitrogen公司），Bulge-Loop miRNATM qRT-PCR Prime（廣州銳博生物科技有限公司），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（東洋紡上海生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及心肺復(fù)蘇模型建立

根據(jù)研究目的按隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)對(duì)照組（對(duì)照組）、心肺復(fù)蘇組（CPR組），每組16只大鼠，術(shù)前12 h禁食但不禁水。模型建立：（1）對(duì)照組：大鼠僅進(jìn)行注射5%水合氯醛液腹腔注射麻醉和氣管插管、血管穿刺，不窒息不復(fù)蘇。（2）CPR組：基本操作同對(duì)照組，采用經(jīng)典窒息法建立大鼠CPR模型[6]，大鼠在心臟停搏后3 min開始CPR（胸外心臟按壓+腎上腺素+呼吸機(jī)輔助通氣）。當(dāng)大鼠恢復(fù)ROSC并維持24 h納入CPR組。參照Utstein標(biāo)準(zhǔn)[7]，當(dāng)心電圖呈室顫、停搏或無脈性電活動(dòng)，收縮壓≤25 mmHg時(shí)提示心搏驟停；當(dāng)心電圖恢復(fù)自主節(jié)律，收縮壓>60 mmHg，并持續(xù)10 min以上時(shí)提示ROSC。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 兩組大鼠均常規(guī)頸動(dòng)脈穿刺置管，然后接換能器及多導(dǎo)生理檢測(cè)儀，再連接MedLab-U/4CS生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，直接測(cè)定并記錄所有大鼠24 h時(shí)相的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，包括HR、LVESP、LVEDP、±dp/dtmax。

1.4.2 血漿總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè) 按照miRcute miRNA Isolation Kit試劑盒的說明書提取血漿中的總RNA；采用NanoDrop ND-1000檢測(cè)RNA的濃度和純度；瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)一步檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：參照大量的文獻(xiàn)報(bào)道和我們前期所取得的一系列實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)需要的逆轉(zhuǎn)錄引物由廣州銳博生物科技有限公司提供，本實(shí)驗(yàn)中所采用的內(nèi)參對(duì)照由廣州銳博生物科技公司提供的miRNA qRT-PCR Standard RNA作為標(biāo)準(zhǔn)品基因（cel-miR-39）外源加入血漿中作為內(nèi)參。RT反應(yīng)參數(shù)：42℃ 60 min，70℃ 5 min。Real-Time PCR 反應(yīng)參數(shù)：95℃ 3 min，95℃ 5sec，62℃ 35sec（40個(gè)循環(huán)）。本實(shí)驗(yàn)采用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)復(fù)孔，記錄每個(gè)孔中信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)，即Ct值，計(jì)算3個(gè)孔Ct值的平均值作為最終結(jié)果。miRNA表達(dá)水平的計(jì)算方法：以cel-miR-39作為內(nèi)參照，計(jì)算miR-21相對(duì)表達(dá)值RQ（RQ=2-△Ct），△Ct=Ct miR-21-Ct cel-miR-39。

1.4.3 血清CK、CK-MB和cTnI測(cè)定 采用生化儀免疫抑制法測(cè)定血清CK、CK-MB含量，Access免疫化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑測(cè)定血清cTnI含量，同時(shí)測(cè)定紅細(xì)胞壓積（HCT）值校正0.9%氯化鈉溶液稀釋的影響。endprint

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性評(píng)估采用Spearman相關(guān)分析，效能評(píng)估采用ROC曲線，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)參數(shù)

對(duì)照組和CPR組（CA前）大鼠體質(zhì)量、心率、MAP基礎(chǔ)值、水合氯醛使用量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 兩組大鼠血漿miR-21表達(dá)水平變化

對(duì)照組miR-21相對(duì)表達(dá)量（2-△Ct）為（0.20575±0.06939），CPR組miR-21相對(duì)表達(dá)量（2-△Ct）為（0.57037±0.17243），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.847，P<0.01）。

2.3 兩組大鼠血流動(dòng)力學(xué)變化及miR-21與HR、LVESP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax的相關(guān)性

兩組大鼠于氣管切開后或心肺復(fù)蘇后24 h血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)HR、LVESP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，CPR后大鼠循環(huán)miR-21的表達(dá)量與HR、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax呈負(fù)相關(guān)（r= -0.563、-0.737、-0.755、-0.801，P<0.01），與LVEDP呈正相關(guān)（r=0.753，P<0.01）。見表2。

2.4 兩組血漿中CK、CK-MB和cTnI的差異及miR-21與CK、CK-MB和cTnI的相關(guān)性

CK、CK-MB和cTnI在對(duì)照組和CPR組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，CPR后大鼠循環(huán)miR-21的表達(dá)量與CK、CK-MB和cTnI呈正相關(guān)性（r=0.658、0.733、0.852，P<0.01）。見表3。

表3 兩組大鼠血漿中CK、CK-MB和cTnI比較（x±s）

2.5 miR-21、CK、CK-MB及cTnI在CPR大鼠的ROC曲線

CPR后大鼠miR-21表達(dá)水平的敏感性78.9%，特異性85.1%。采用ROC曲線（Receiver operating characteristic curve）評(píng)價(jià)循環(huán)miR-21相對(duì)表達(dá)量與心肺復(fù)蘇后心肌損傷的診斷是否有價(jià)值。循環(huán)miR-21表達(dá)量ROC曲線下面積AUC=0.859（95%CI 0.731～0.988），與CK、CK-MB、cTnI具有相似的敏感度（AUC分別為0.719、0.803、1.000，95% CI分別為0.519～0.919、0.622～0.984、1.000～1.000）。見封三圖3。

3 討論

CA作為全身性的缺血缺氧性損傷過程，是臨床中嚴(yán)重威脅人類健康的急危重癥，死亡率極高[8]。50余年來，隨著現(xiàn)代CPR術(shù)的建立、逐步完善與推廣普及，越來越多的CA患者得到了及時(shí)的救治，但救治成功率仍差強(qiáng)人意，其中心功能障礙是患者成功復(fù)蘇后早期死亡的直接原因之一[9]。本研究采用窒息法建立CA/CPR大鼠模型是經(jīng)典的小動(dòng)物復(fù)蘇模型，具有制作方便、所需設(shè)備簡(jiǎn)單、重復(fù)性好的特點(diǎn)，能較好的模擬臨床中缺氧所導(dǎo)致的CA與CPR過程。同時(shí)通過檢測(cè)CK、CK-MB、cTnI能一定程度上反映病理?xiàng)l件下的心肌損傷，是經(jīng)典的預(yù)警指標(biāo)。本研究中發(fā)現(xiàn)，心肺復(fù)蘇后大鼠HR、LVESP、±dp/dtmax較對(duì)照組均明顯下降，LVEDP明顯上升，提示CA/CPR后心功能障礙明顯，尤其是左心收縮和舒張功能明顯降低。同時(shí)提示心肌損傷的指標(biāo)較對(duì)照組明顯升高，提示CA/CPR后心肌細(xì)胞受損嚴(yán)重，而心肌細(xì)胞損傷則是CA/CPR后心功能障礙的根本原因。

miRNA是一類由22～23個(gè)核糖核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼微小RNA，通常來源于長(zhǎng)鏈RNA的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（Pri-miRNA），其可在RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物引導(dǎo)下與互補(bǔ)的信使RNA（mRNA）完全或不完全性配對(duì)，從而降解或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯，調(diào)控著30%以上人類基因的表達(dá)[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可存在于多種體液中，如尿液、唾液、血漿、血清等，其通過與LDL、HDL、Ago等結(jié)合形成具有酶活性的蛋白質(zhì)復(fù)合物，以凋亡小體、微囊泡、外來體等形式穩(wěn)定存在于體液中不被降解，即病理狀態(tài)下組織表達(dá)的miRNA通過特定途徑釋放入血并可穩(wěn)定存在[12-14]。因此，通過測(cè)定循環(huán)miRNA表達(dá)水平可一定程度上反映病理狀態(tài)下特定組織的病理變化。

miR-21定位于液泡膜蛋白基因（vacuole membrane protein-1，VMP1）非編碼區(qū)17q23.2，即VMP1的第十內(nèi)含子，目前尚未發(fā)現(xiàn)特定的組織特異性。但研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下miR-21在心肌中很少表達(dá)，但在各種病理?xiàng)l件下心肌miR-21表達(dá)明顯升高，如急性冠脈綜合征、心力衰竭、心肌肥厚、缺血性心臟病等[15-16]。研究已發(fā)現(xiàn)，miR-21具有心血管效應(yīng)的靶基因有四個(gè)，分別是磷酸酯酶-張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）和程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）、Sprouty1、Sprouty2，上述基因均具有顯著的細(xì)胞和條件特異性[17-19]，因此研究認(rèn)為，心血管疾病過程中miR-21可能發(fā)揮了重要作用。楊壽娟等[5]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死患者血漿miR-21較冠狀動(dòng)脈無病變者明顯升高，提示其可能參與了心肌梗死后心肌損傷過程，并預(yù)言miR-21可能是急性心肌梗死潛在的診斷學(xué)標(biāo)志物。

本研究中，血漿miR-21在CPR組中表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高，表明miR-21在CPR后心肌中表達(dá)活躍，此結(jié)果與一些學(xué)者[20-21]的研究結(jié)果一致，即心肌損傷時(shí)miR-21的表達(dá)明顯上調(diào)，其可能參與了心肌缺血相關(guān)基因的調(diào)控，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，心肺復(fù)蘇后大鼠循環(huán)miR-21的表達(dá)量與心肌梗死診斷標(biāo)志物CK、CK-MB、cTnI、LVEDP呈正相關(guān)性，與HR、LVESP、+dp/dtmax、-dp/dtmax呈負(fù)相關(guān)，即心肌損傷時(shí)miR-21表達(dá)上調(diào)，且與心功能障礙程度呈一定的相關(guān)性，提示miR-21可能參與了CPR后心功能障礙，有成為CA/CPR后心肌損傷診斷標(biāo)志物的可能。ROC曲線下面積顯示miR-21與CK、CK-MB、cTnI診斷CA/CPR后心功能障礙的效能相似，高于CK和CK-MB，稍低于cTnI，敏感性78.9%，特異性85.1%，據(jù)此推斷miR-21可能是CPR后心肌損傷潛在的診斷學(xué)標(biāo)志物，具有較高的敏感性和特異性，為未來的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。endprint