固相萃取-高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中硫酸新霉素殘留量

劉永濤， 李 樂， 徐春娟， 胥 寧， 董 靖，楊秋紅， 楊移斌， 艾曉輝*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北武漢 430223；2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430223；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141；4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

新霉素(Neomycin Sulfate，NS)屬于氨基糖苷類抗生素，新霉素B是新霉素的主要成分(含量>90%)，在獸藥中用其硫酸鹽[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中硫酸新霉素是我國允許使用的國標(biāo)漁藥，用于治療魚、蝦、河蟹等水產(chǎn)動(dòng)物由氣單胞菌、愛德華氏菌及弧菌等引起的腸道疾病[2]。由于新霉素對人具有明顯的腎毒性和耳毒性[3]，其在水產(chǎn)品中的殘留引起了人們的廣泛關(guān)注。歐盟規(guī)定有鰭魚類自然比例的肌肉和皮膚中新霉素(殘留標(biāo)示物為新霉素B)的最高殘留限量(MRL)值為500 μg/kg[3]，日本規(guī)定鮭形目、鰻鱺目、鱸形目及其它魚類、去殼軟體動(dòng)物、甲殼綱動(dòng)物和其他水產(chǎn)動(dòng)物中新霉素最高殘留限量值為500 μg/kg[4]，我國僅規(guī)定了牛、羊、豬肌肉中新霉素(殘留標(biāo)示物為新霉素B)的最高殘留限量為500 μg/kg[5]。因此，對水產(chǎn)品中硫酸新霉素殘留量檢測技術(shù)研究是非常必要的。

目前，畜禽肌肉中新霉素的分析方法有液相色譜法[6 - 7]、微生物法[8]、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)[9 - 11]、液相色譜/質(zhì)譜法[12 - 13]，而水產(chǎn)品中硫酸新霉素的檢測方法僅見有羅非魚肌肉中硫酸新霉素測定的柱前衍生高效液相色譜法[14]。我們在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)上述方法應(yīng)用于水產(chǎn)品中硫酸新霉素殘留量檢測時(shí)存在一定的不足，如微生物法和酶聯(lián)免疫法不適于對肌肉組織中新霉素殘留量進(jìn)行定量分析，而用液相色譜法分析肌肉組織中新霉素殘留量時(shí)需要對其進(jìn)行衍生，過程復(fù)雜，不易操作。已報(bào)道的液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物性食品中殘留的新霉素，采用揮發(fā)性離子對試劑作為流動(dòng)相[12 - 13]，該方法分析新霉素時(shí)對儀器和色譜柱的損傷大，需要對離子源和色譜柱定期清洗以防污染和靈敏度下降，因而，不適用于大批量樣品的檢測。本文通過選擇合適的提取劑、凈化方法，優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測定水產(chǎn)品中硫酸新霉素殘留量，該方法具有簡單、快速、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ Quantum Access Max液-質(zhì)聯(lián)用儀(美國，Thermo Fisher Scientific公司)；HITACHI 20PR-520自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(日本，HITACHI公司)；Mettler-TOLEDO XP-205型精密電子天平(瑞士，METTLER TOLEDO公司)；HQ-60-Ⅱ旋渦混合器(北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；DC12-DA氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品(≥90.0%，德國Dr Ehrenstotfer GmbH公司)。硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取0.01 g(精確至0.0001 g)硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用適量水(LC-MS級)溶解，并稀釋定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再用水(LC-MS級)稀釋成濃度為10 μg/mL中間標(biāo)準(zhǔn)溶液。乙腈、甲醇和甲酸(色譜純，美國J.T.Baker公司)；水(LC-MS級，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；三氯乙酸(分析純，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；超純水：自制雙蒸水后經(jīng)美國Millipore-Q Advantage A10超純水機(jī)制備。

草魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、南美白對蝦、鰻鱺和甲魚分別購自武漢市白沙洲農(nóng)副產(chǎn)品大市場和華南海鮮市場。草魚，去鱗去皮，取背部肌肉；蝦，去頭去殼去內(nèi)臟，取肌肉部分；甲魚，去殼取肌肉部分，充分勻質(zhì)后于-18 ℃保存，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取準(zhǔn)確稱取2.0 g(精確至0.01 g)肌肉樣品于15 mL離心管中，加入6 mL 5%三氯乙酸水溶液，渦旋震蕩1 min，超聲提取2 min，8 000 r/min離心5 min，將提取液轉(zhuǎn)移到另一支15 mL離心管中，再向殘?jiān)屑尤? mL 5%三氯乙酸溶液重復(fù)提取一次，合并提取液于15 mL離心管中，待凈化。

1.2.2凈化Waters Oasis HLB固相萃取小柱用3 mL乙腈、3 mL超純水、3 mL 5%三氯乙酸水溶液活化后，將提取液過HLB固相萃取小柱，過柱時(shí)保持每秒1滴，過柱后用3 mL 5%三氯乙酸水溶液淋洗固相萃取小柱并將固相萃取小柱抽干。用6 mL乙腈將富集在固相萃取小柱上的目標(biāo)物洗脫于10 mL塑料離心管中，置50 ℃氮吹儀上吹干。向殘?jiān)屑尤? mL 0.5%三氯乙酸水溶液，渦旋振蕩1 min，10 000 r/min離心5 min，取澄清液過0.22 μm聚醚砜濾頭后，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

1.3 水產(chǎn)品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

按1.2節(jié)方法制備草魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、南美白對蝦、鰻鱺和甲魚肌肉空白基質(zhì)溶液，并用上述5種肌肉空白基質(zhì)溶液稀釋硫酸新霉素中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成含硫酸新霉素濃度分別為10、25、50、100、500、1 000、2 000 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.22 μm聚醚砜濾頭過濾后，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

1.4 色譜/質(zhì)譜分析條件

1.4.1色譜條件色譜柱：BDS HYPERSIL C18柱(150×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A相：乙腈，B相：0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫程序如下：0～1.0 min，5%A；1.0～4.0 min，5%～60%A；4.0～5.5 min，60%A；5.5～7.0 min，60%～5%A；7.0～8.0 min，5%A；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件離子源：加熱大氣壓電噴霧離子源(HESΙ)；掃描模式：正離子模式；檢測方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)；噴霧電壓：3 500 V；蒸發(fā)氣溫度：400 ℃；鞘氣壓力：40 kPa；輔助氣壓力：4 kPa；碰撞氣(Ar)壓力：1.5 Pa；離子傳輸毛細(xì)管溫度：350 ℃；選擇離子監(jiān)測優(yōu)化參數(shù)：監(jiān)測母離子：m/z615.2，定量子離子：m/z161.0，碰撞能量： 31 eV，定性子離子：m/z293.0，碰撞能量：22 eV。

2 結(jié)果和討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

乙腈的洗脫能力較甲醇的洗脫能力強(qiáng)，并且在同樣條件下乙腈做流動(dòng)相較甲醇為流動(dòng)相時(shí)，硫酸新霉素有更好的峰形，所以本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈為流動(dòng)相的有機(jī)相(A相)。分別以0.2%和0.3%甲酸水溶液為流動(dòng)相的水相時(shí)硫酸新霉素在質(zhì)譜上的響應(yīng)度相當(dāng)，且均優(yōu)于純水和0.1%甲酸水溶液，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇了乙腈-0.2%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。劉莉治等[12]和孫雷等[13]報(bào)道了采用離子對試劑七氟丁酸作為流動(dòng)相，用于檢測動(dòng)物性食品中的新霉素殘留，而七氟丁酸會(huì)對質(zhì)譜儀的離子源和色譜柱造成污染，使質(zhì)譜儀靈敏度下降，從而增加了儀器維護(hù)的頻率和成本。本方法采用乙腈-0.2%甲酸為流動(dòng)相，減少了色譜柱和質(zhì)譜儀離子源的清洗頻率和維護(hù)成本，有利于延長色譜柱和儀器的使用壽命。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將10 μg/mL的硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)注射泵注入質(zhì)譜儀對其進(jìn)行調(diào)諧和優(yōu)化，使其達(dá)到最大的離子響應(yīng)值。在氬氣壓力為1.5 Pa的條件下，采用氬氣將進(jìn)入三重四極質(zhì)譜碰撞室Q2的新霉素離子碰撞為離子碎片，找到了適合用作定量的離子(m/z161.0)和定性的離子(m/z293.0)，并優(yōu)化出各自的碰撞能量。HESI源(帶加熱的電噴霧離子源)是采用電噴霧離子化(ESI)與加熱輔助氣相結(jié)合的方法，將溶液中的離子轉(zhuǎn)換成氣相中的離子，可以更有效去除溶劑。本文優(yōu)化了HESI源的輔助氣溫度(50 ℃、100 ℃、200 ℃、300 ℃、400 ℃)，結(jié)果表明隨著輔助氣溫度的增加，硫酸新霉素的響應(yīng)度也逐漸增大，相同條件下硫酸新霉素在輔助氣溫度400 ℃時(shí)的響應(yīng)度約是在輔助氣50 ℃時(shí)響應(yīng)度的10倍。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇硫酸新霉素易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚、丙酮、氯仿，因此樣品中硫酸新霉素宜采用水或含鹽的水溶液進(jìn)行提取。宋潔等[14]采用pH=6.5的磷酸鹽緩沖液和5%三氯乙酸(體積比1∶1)作為提取劑，提取后再用三氟乙酸水溶液調(diào)節(jié)提取液的pH。本實(shí)驗(yàn)分別采用純水、1%、2.5%、5%的三氯乙酸水溶液作為提取劑，結(jié)果表明純水會(huì)溶解樣品中水溶性蛋白，進(jìn)而干擾目標(biāo)物的分析；1%、2.5%的三氯乙酸水溶液沉淀蛋白的效果不佳，而5%的三氯乙酸水溶液沉淀蛋白的效果好，且硫酸新霉素提取率高，所以本實(shí)驗(yàn)選用5%的三氯乙酸水溶液作為提取劑。

2.3.2樣品凈化條件的優(yōu)化樣品經(jīng)5%三氯乙酸水溶液提取后，采用Waters Oasis HLB固相萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化。本實(shí)驗(yàn)對提取液過柱后的淋洗液和洗脫液進(jìn)行了篩選，當(dāng)水作為淋洗液時(shí)會(huì)洗脫部分吸附在固相萃取小柱上的硫酸新霉素，回收率低，而5%三氯乙酸水溶液作為淋洗液則不易將吸附在固相萃取小柱上的硫酸新霉素淋洗下來，故選擇5%三氯乙酸水溶液作為淋洗液；分別采用6 mL的乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈洗脫液對吸附在固相萃取小柱上的硫酸新霉素進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明4種溶液均能將硫酸新霉素從固相萃取小柱上洗脫下來。本實(shí)驗(yàn)最終選擇了純乙腈作為洗脫液。

2.4 方法的評價(jià)

2.4.1方法的線性范圍將配制成不同濃度的水產(chǎn)品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，以待測物的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)作線性回歸分析。硫酸新霉素在10～2 000 ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均≥0.9987。

2.4.2方法準(zhǔn)確度和精密度按1.2節(jié)方法對不含目標(biāo)分析物的草魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、南美白對蝦、鰻鱺和甲魚空白肌肉樣品中添加硫酸新霉素的濃度水平為25、200、500、1 000 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行，硫酸新霉素的加標(biāo)回收率及精密度(RSD)結(jié)果見表1。硫酸新霉素在草魚等水產(chǎn)品中添加水平為25～1 000 μg/kg時(shí)，平均回收率為89.03%～114.57%，RSD為2.84%～9.62%。由此可見該方法的準(zhǔn)確度和精密度高，能滿足水產(chǎn)品中硫酸新霉素殘留量的測定。

表1 不同水產(chǎn)品中硫酸新霉素的回收率和精密度(n=6)

圖1 50 ng/mL硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液SRM色譜圖Fig.1 The SRM chromatogram of 50 ng/mL neomycin sulfate standard solution with (a) m/z615.2,(b)m/z615.2>161.0,(c)m/z615.2>293.0

硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的SRM色譜圖見圖1。

2.4.3方法檢測限和定量限當(dāng)加標(biāo)水平為10 μg/kg時(shí)，硫酸新霉素的信噪比大于3，加標(biāo)水平為25 μg/kg時(shí)，平均回收率大于89.03%，RSD小于9.62%，因此該方法的檢測限和定量限分別為10 μg/kg和25 μg/kg。本方法的定量限遠(yuǎn)低于歐盟[5]和日本[6]規(guī)定的硫酸新霉素在水產(chǎn)品中的最高殘留限量值，能夠滿足我國進(jìn)出口水產(chǎn)品中硫酸新霉素的檢測。

2.5 方法的應(yīng)用

將該方法用于市售的5份團(tuán)頭魴、6份斑點(diǎn)叉尾鮰、3份黃鱔、5份草魚樣品的測定，結(jié)果均未檢出硫酸新霉素的殘留，說明上述水產(chǎn)品未使用硫酸新霉素或硫酸新霉素在上述水產(chǎn)品中已被代謝消除。有研究報(bào)道羅非魚使用硫酸新霉素后休藥期少于7 d[15 - 16]，作者也用該方法研究了硫酸新霉素在斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)的組織分布規(guī)律和殘留消除規(guī)律，研究結(jié)果也表明，硫酸新霉素在斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉中消除到最高殘留限量(500 μg/kg)以下，所需時(shí)間較短(將另文報(bào)道)。

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中硫酸新霉素的殘留量。該方法完成1個(gè)樣品的前處理僅需1 h、9 mL有機(jī)溶劑，減少了操作人員和有機(jī)溶劑的接觸；選用非離子對試劑做流動(dòng)相，保護(hù)了質(zhì)譜檢測器，提高了分析效率，具有簡單、快速、安全、高效的特點(diǎn)，適于應(yīng)用和推廣。