固相萃取-超高效液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中的甲硝唑和氯霉素

劉 偉， 張 楠， 李 兵， 范 賽， 屠瑞瑩， 吳國華， 薛 穎， 趙 榕*

(北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100013)

甲硝唑(Metronidazole，MNZ)屬于硝基咪唑類抗生素，其抗菌廣譜，對厭氧原生動物和細(xì)菌十分有效。研究表明，硝基咪唑類藥物及其代謝產(chǎn)物具有潛在的動物致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性[1 - 2]。氯霉素(Chloramphenicol，CAP)屬于酰氨醇類藥物，曾被廣泛地用于動物各種傳染性疾病的預(yù)防和治療。氯霉素對人體有嚴(yán)重的副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[3 - 4]。甲硝唑和氯霉素早在2002年就被農(nóng)業(yè)部列入禁止用于包括蜜蜂在內(nèi)的所有食用動物的物質(zhì)名單中，且不得在動物源食品中檢出[5]。然而，在養(yǎng)蜂過程中，蜂場為避免蜂群感染某些疾病，可能會違規(guī)使用這些便宜且治療指數(shù)較高的抗生素。蜂蜜中檢出甲硝唑或氯霉素的案例時有發(fā)生[6]。

目前，關(guān)于蜂蜜中甲硝唑或氯霉素的檢測主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7 - 8]；樣品前處理方法主要采用溶劑直接提取[9]、QuEChERS方法[10]或固相萃取法[11 - 12]。由于甲硝唑與氯霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有較大差異，在采用串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測器時，需要分別采用正離子和負(fù)離子采集模式，因此同時測定甲硝唑和氯霉素的方法報道不多。本文報道的方法可以采用一種前處理過程同時對蜂蜜樣品中殘留的甲硝唑和氯霉素進(jìn)行提取、富集和凈化，并且通過串聯(lián)質(zhì)譜的正負(fù)離子切換模式達(dá)到甲硝唑和氯霉素的同時測定，提高了檢測效率，降低了檢測成本。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Waters 公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國，SIGMA公司)；氮氣吹干儀(美國，Orgnomation公司)；固相萃取裝置(日本，SHIMADZU-GL公司)；InertSep RP-1固相萃取柱(日本，SHIMADZU-GL公司)。

甲硝唑、甲硝唑內(nèi)標(biāo)物(Metronidazole-d4，MNZ-d4)，氯霉素和氯霉素內(nèi)標(biāo)物(Chloramphenicol-d5，CAP-d5)，均購自 Dr.Ehrenstorfer，純度 ≥ 99%。乙酸乙酯、甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純(美國Dikma公司)；實驗用水由Milli-Q系統(tǒng)(美國，Millipore公司)制得。

1.2 樣品前處理

1.2.1提取稱取2 g蜂蜜樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞塑料離心管中，加入50 μL濃度為10 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)液。向離心管內(nèi)加入5 mL超純水，待蜂蜜完全溶解后再加入20 mL乙酸乙酯，渦旋混勻1 min再置于搖床上振蕩20 min。之后，將離心管置于高速冷凍離心機(jī)中，以10 000 r/min離心5 min，再將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，在40 ℃的水浴中氮氣吹干。然后，向離心管中加入10 mL水并渦旋混勻，待固相萃取凈化。

1.2.2凈化InertSep RP-1固相萃取柱預(yù)先用5 mL甲醇和5 mL水進(jìn)行活化與平衡。將10 mL樣品溶液分批倒入固相萃取小柱中；待溶液全部通過小柱后，用5 mL含10%甲醇水溶液淋洗小柱。再通過減壓抽干小柱中的水分，采用5 mL含70%甲醇水溶液洗脫目標(biāo)物。洗脫液在40 ℃的水浴中用氮氣吹至近干，加入1 mL定容液(流動相初始比例)，過0.22 μm濾膜，供儀器測定。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱:Endeavorsil C18柱(100×2.1 mm，1.8 μm，美國Dikma公司)；流動相：A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～3 min，5%～95%B；3～5 min，95%B；5～7 min，95%～5%B；7～8 min，5%B；流動相流速：0.25 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；甲硝唑為正離子模式(ESI+)，氯霉素為負(fù)離子模式(ESI-)；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：2.5 V；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 甲硝唑與氯霉素的質(zhì)譜參數(shù)與保留時間

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

在串聯(lián)質(zhì)譜上進(jìn)行正負(fù)離子采集模式切換時，系統(tǒng)通常需要一定的時間來達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。為了使目標(biāo)物均在系統(tǒng)穩(wěn)定時得到采集，兩個目標(biāo)物應(yīng)有適當(dāng)?shù)姆蛛x度。實驗比較了4種不同的流動相組合：(1)水+甲醇；(2)水+乙腈；(3)0.1%甲酸水溶液+甲醇；(4)0.1%甲酸水溶液+乙腈。通過對梯度洗脫程序進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，確定了采用水與乙腈組成二元流動相體系。在此條件下，目標(biāo)物在質(zhì)譜上的響應(yīng)值(峰面積)較高，兩個組分的峰形和分離度較好。通過多次進(jìn)樣(n>6)計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表明，采集目標(biāo)物時系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

針對蜂蜜樣品和目標(biāo)物的性質(zhì)，本實驗比較了4種不同的前處理方式，包括：(1)采用水直接溶解蜂蜜，再將蜂蜜水溶液進(jìn)行固相萃取凈化；(2)加水溶解蜂蜜后，加入乙酸乙酯萃取目標(biāo)物，取乙酸乙酯層并將溶劑吹干后加入超純水溶解殘渣，再進(jìn)行固相萃取凈化；(3)采用pH=8.8的磷酸緩沖液溶解蜂蜜，再將樣品溶液進(jìn)行固相萃取凈化；(4)采用QuEChERS前處理方法，用乙腈提取目標(biāo)物，取部分乙腈層吹干溶劑后定容、過膜，上機(jī)測定。通過加標(biāo)回收實驗比較回收率表明，采用方法(2)的回收率明顯高于其他3種方式，故對蜂蜜試樣采用方法(2)前處理方式。

為達(dá)到較好的凈化效果，本實驗前處理采用固相萃取技術(shù)對兩種目標(biāo)物進(jìn)行同時富集和凈化。參考文獻(xiàn)確定采用反相機(jī)理的固相萃取柱。根據(jù)目標(biāo)物的理化性質(zhì)，對固相萃取的淋洗和洗脫曲線進(jìn)行了考察，確定了采用含10%甲醇水溶液作為淋洗液，去除在萃取柱上極性較強(qiáng)、保留相對較弱的雜質(zhì)；采用含70%甲醇水溶液作為洗脫液以避免有更多極性相對較弱的雜質(zhì)被洗脫下來。淋洗曲線和洗脫曲線見圖1與圖2。

圖1 固相萃取淋洗曲線Fig.1 The relationship between rinse solution and recoveries of metronidazole and chloramphenicol

圖2 固相萃取洗脫曲線Fig.2 The relationship between elute solution and recoveries of metronidazole and chloramphenicol

2.3 方法學(xué)評價

以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性方程。結(jié)果表明，甲硝唑和氯霉素在1～100 ng/mL范圍內(nèi)，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定時，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。取陰性蜂蜜樣品進(jìn)行3個濃度水平(0.5、5和25 μg/kg)的加標(biāo)回收實驗，每個添加水平重復(fù)6次。由表2可見，目標(biāo)物的回收率范圍為71.4%～122.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍為 5.0%～12.3%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足分析要求。方法檢出限和定量限見表2。

表2 方法檢出限(LODs)、定量限(LOQs)、回收率與精密度(RSDs)

2.4 實際樣品的測定

采用本方法對市售20種不同蜂蜜樣品進(jìn)行檢測，其中1件同時檢出甲硝唑和氯霉素殘留，含量分別是0.36 μg/kg和0.64 μg/kg。

3 結(jié)論

本文建立了同時測定蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘留量的方法。目標(biāo)物采用乙酸乙酯提取，固相萃取富集和凈化，通過串聯(lián)質(zhì)譜的正負(fù)離子切換模式來同時測定甲硝唑和氯霉素。本方法縮短了檢測時間，提高了檢測效率，靈敏度和準(zhǔn)確度滿足監(jiān)管要求，可用于蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘留的監(jiān)測。