基于寡核苷酸探針套painting的小麥“中國春”非整倍體高清核型及應(yīng)用

王丹蕊 杜 培 裴自友 莊麗芳,* 亓增軍,*南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室, 江蘇南京 0095;山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 山西太原 030030

作物遺傳育種·種質(zhì)資源·分子遺傳學(xué)

基于寡核苷酸探針套painting的小麥“中國春”非整倍體高清核型及應(yīng)用

王丹蕊1杜 培1裴自友2莊麗芳1,*亓增軍1,*1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室, 江蘇南京 210095;2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 山西太原 030030

基于寡核苷酸探針套painting的染色體鑒定技術(shù)簡單、經(jīng)濟(jì)和高效, 可以促進(jìn)小麥品種及親緣物種染色體識別和變異體鑒定, 提高染色體工程效率。我們前期開發(fā)了寡核苷酸探針套, 包含 pAs1-1、pAs1-3、AFA-4、(GAA)10和pSc119.2-1共5個探針。本研究通過一次熒光原位雜交(FISH), 對源于17個非整倍體的18份材料分析發(fā)現(xiàn), 其中14個染色體組成正確, 可以清晰識別相應(yīng)的缺體、四體和端體。還構(gòu)建了基于寡核苷酸探針套涂染的、能準(zhǔn)確識別3個基因組和7個部分同源群染色體的高清核型, 發(fā)現(xiàn)4個非整倍體發(fā)生變異, 其中從N5BT5D中鑒定出一個可能的小片段相互易位系T6AS·6AL-6DL和T6DS·6DL-6AL。進(jìn)一步對7個地方品種、10個栽培品種(系)和1個人工合成小麥分析, 發(fā)現(xiàn)15條染色體存在多態(tài)性, 涉及6條B組(除4B)、5條A組(除1A和3A)和4條D組(1D、2D、4D和7D)染色體, 可以清晰識別我國小麥生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的 3種易位類型(T1RS·1BL、T6VS·6AL及相互易位 T1RS·7DL和T7DS·1BL), 省去了基因組原位雜交(GISH)程序。另外, 對5個親緣物種分析發(fā)現(xiàn), 該探針套可以識別栽培一粒小麥、硬粒小麥Langdon、荊州黑麥、長穗偃麥草(2n=2x=14)全部和中間偃麥草30條染色體, 并構(gòu)建了這5個物種的核型。本研究結(jié)果證實該寡核苷酸探針套可以有效用于小麥及親緣物種染色體鑒定, 高清晰的中國春非整倍體核型為小麥染色體工程提供了參考標(biāo)準(zhǔn)。

寡核苷酸探針套; 染色體painting; 染色體多樣性; 小麥易位系; 非整倍體

Abstract:Oligonucleotide (oligo hereafter) multiplex-based chromosome painting facilitates chromosome identification of both wheat cultivars and its relatives in a simple, easy and high efficient way. In this study, an oligo multiplex containing oligos pAs1-1,pAs1-3, AFA-4, (GAA)10, and pSc119.2-1 developed earlier was used for chromosome painting of 18 accessions from 17 Chinese Spring (CS) aneuploids. The high resolution karyotypes allowed to clearly distinguish individual wheat chromosomes. Fourteen aneuploids had the expected chromosome constitutions whereas the other four had chromosome variations including one with a possible small segmental reciprocal translocation T6AS·6AL-6DL and T6DS·6DL-6AL occurred in N5BT5D. The following analysis on eight landraces, nine cultivars (lines), and one synthetic hexaploid wheat, observed karyotype diversities from 15 chromosomes including six B- (except for 4B), five A- (except for 1A and 3A), and four D-genome (1D, 2D, 4D, and 7D) chromosomes. The three widely-used translocations in China, i.e. T1BL·1RS, T6AL·6VS and the reciprocal translocation T1RS·7DL and T7DS·1BL, were clearly detected after only once fluorescence in situ hybridization (FISH) using the oligo multiplex and without genomic in situ hybridization (GISH). This oligo multiplex also produced rich signals in all chromosomes of Triticummonococum, rye cultivar “Jingzhouheimai”, durum wheat “Langdon”, and Thinopyrum elongatum, and 30 chromosomes of Thinopyrum intermedium. The karyotypes of these five species were thus developed. These results indicate that oligo multiplex-based chromosome painting will play active roles on chromosome identifying, and provide a reference for the standard karyotypes of CS aneuploids.

Keywords:Oligonucleotide multiplex probe; Chromosome painting; Chromosome diversity; Wheat translocations; Aneuploids

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一, 據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計, 2014年全球小麥?zhǔn)斋@面積約2.204億公頃, 總產(chǎn)約7.29億噸(http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC)。然而, 隨著全球氣候變化, 小麥生產(chǎn)受到更多的脅迫[1-2], 不斷發(fā)掘和利用親緣物種中的有益基因是拓寬栽培小麥遺傳基礎(chǔ)和應(yīng)對這些挑戰(zhàn)的重要途徑。染色體工程技術(shù)的發(fā)展為定向轉(zhuǎn)移和利用外源基因和加快育種進(jìn)程等提供了許多新工具[3]。

染色體工程在小麥育種中取得了顯著的成效, 不但育成一些重要的異源易位系在生產(chǎn)上大量應(yīng)用[4-5],而且創(chuàng)造出一批寶貴的遺傳材料廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究[6-8]。小麥染色體工程從過去關(guān)注較多的黑麥(Secale cereale)[4,9-11]、簇毛麥(Haynaldia villosa)[5,12-13]、長穗偃麥草(Thinopyrum elongatum)[7,14]和中間偃麥草(Thinopyrum intermedium)[15-16]等拓展到更多的物種,例如大麥(Hordeum vulgare)[17]、冰草(Agropyron cristatum)[18-19]、百薩偃麥草(Thinopyrum bessarabicum)[20-21]及山羊草屬(Aegilops)[22-24], 甚至探討關(guān)系更遠(yuǎn)的超遠(yuǎn)緣雜交[25]。隨著染色體誘變技術(shù)發(fā)展和成熟, 目前在短時間內(nèi)可以誘致大量染色體變異體, 特別是小片段頂端或插入易位、缺失、小染色體、倒位等[26-28]。雖然多種方法誘導(dǎo)的很多變異體發(fā)生在非部分同源染色體之間, 生產(chǎn)上直接利用價值不大, 但這些材料為外源目標(biāo)基因發(fā)掘與定位、染色體物理作圖、染色體基因組學(xué)和生物學(xué)研究提供了重要的遺傳工具[7-8,12,18-19,21,29], 同時, 包含目標(biāo)基因(簇)的小片段易位或漸滲系, 未來有望通過同源重組系統(tǒng)定向轉(zhuǎn)移進(jìn)優(yōu)良栽培小麥背景[3], 成為優(yōu)異基因聚合的重要基因元件[30], 大大減少整條外源染色體或區(qū)段導(dǎo)入因遺傳累贅造成的負(fù)效應(yīng)。但是, 受染色體鑒定技術(shù)的局限, 很多非補(bǔ)償性的變異體難以得到準(zhǔn)確鑒定, 因此限制了這些材料的進(jìn)一步利用, 開發(fā)更有效的染色體鑒定技術(shù)具有很大的實用價值。

單鏈寡核苷酸是一類短的 DNA和 RNA序列,可有效侵入染色體雙鏈DNA而發(fā)展成為新的FISH探針, 具有開發(fā)簡單、容易修飾、成本低、效率高等特點[31-32], 目前已經(jīng)發(fā)展成為生物染色體鑒定的新一代工具, 廣泛用于核型分析、染色體多態(tài)性分析、染色體易位鑒定、目標(biāo)染色體或區(qū)段特異追蹤、部分同源染色體鑒定、物種識別、染色體比較作圖等研究[31-44]。本課題組從2010年開始相關(guān)研究, 目前成功開發(fā)出一批高效寡核苷酸探針(套)用于小麥、黑麥、百薩偃麥草、玉米等染色體研究[38,43-45], 其中,Du等[43]報道的4個寡核苷酸探針套, 通過一次熒光原位雜交(FISH)可以清晰識別全部小麥染色體, 與基因組原位雜交(GISH)結(jié)合, 可以識別小麥異染色體系, 為小麥染色體工程提供了簡單、經(jīng)濟(jì)和高效的工具。為進(jìn)一步驗證上述寡核苷酸探針套及其應(yīng)用潛力, 本研究利用簡化的寡核苷酸探針套#4分析系列中國春非整倍體, 旨在建立準(zhǔn)確識別 7個部分同源群染色體的中國春非整倍體高清核型, 并分析我國地方小麥品種、栽培品種、人工合成小麥以及親緣物種, 探討該探針套和標(biāo)準(zhǔn)核型在識別不同品種和物種染色體多態(tài)性的應(yīng)用價值, 為小麥染色體工程提供新的工具和參考核型。

1 材料與方法

1.1 植物材料

為源于17個中國春非整倍體的18份材料、7個地方品種、10個栽培品種、1個人工合成小麥和5個小麥親緣植物(表1)。其中, 中國春非整倍體轉(zhuǎn)引自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊學(xué)明研究員和吳紀(jì)中研究員, 栽培一粒小麥引自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)馬正強(qiáng)教授, 硬粒小麥和人工合成小麥引自日本鳥取大學(xué) Hisashi Tsujimoto教授。

1.2 細(xì)胞遺傳分析

1.2.1 根尖有絲分裂中期染色體制片 參照Dolezel等[46-47]描述的方法, 稍作改動。將種子置墊兩層濾紙的培養(yǎng)皿, 加水至浸沒種子, 在 24℃恒溫箱發(fā)芽; 種子露白后, 倒掉多余水分, 24℃繼續(xù)培養(yǎng)至根長約1.2～1.5 cm; 將0.2 μmol L-1甲基氨草磷溶液(amiprophos-methyl, 簡稱 APM, 溶劑為丙酮)倒入培養(yǎng)皿浸沒種子, 24℃繼續(xù)培養(yǎng) 2 h, 然后倒掉APM, 用清水沖洗種子3次后, 剪取2～3條根置1.5 mL離心管(離心管蓋子打好孔), 加1～2滴蒸餾水, 保證根尖濕潤; 將離心管放入笑氣罐中充笑氣, 至壓力達(dá)0.8～1.2 MPa, 處理1.5 h后取出, 置90%乙酸中在冰上固定10 min后用于制片。

表1 本研究所用的植物材料Table 1 Materials used in this study

制片時, 取出根尖, 在 45%醋酸中解離 3～5 min,切掉根冠, 再切取根尖分生區(qū)組織于載玻片, 滴一滴45%醋酸, 蓋上蓋玻片, 輕敲使細(xì)胞分散, 用酒精燈外焰均勻烘烤待霧氣散開后壓片; 在相差顯微鏡下觀察,將染色體形態(tài)好、數(shù)目完整和分散均勻的制片放入-70℃冰箱冷凍過夜, 然后揭去蓋玻片, 在100%無水乙醇中脫水30 min以上, 取出氣干后用于原位雜交。

1.2.2 寡核苷酸FISH 寡核苷酸探針套包含5個寡核苷酸探針(表2), 根據(jù)Du等[43]報道的探針套#4略作調(diào)整而成, 分別包含 TAMRA修飾的pAs1-1、pAs1-3、AFA-4和 FAM 修飾的 pSc119.2-1和(GAA)10。在同時進(jìn)行寡核苷酸探針套FISH和GISH時, 改用TAMRA修飾的pSc119.2-1, 以與基因組的綠色信號區(qū)別。

表2 本文所用的寡核苷酸探針Table 2 Oligonucleotide probes used in this study

參考Zhuang等[11]描述的FISH程序, 雜交液體系為 16.6 μL, 包括 7.5 μL dFA, 1.5 μL 20× SSC, 0.5 μL Salmon sperm DNA (10 mg mL-1), pAs1-1 (10 pmol μL-1), pAs1-3 (10 pmol μL-1), AFA-4 (10 pmol μL-1)和 pSc119.2-1 (10 pmol μL-1)各 1 μL, 0.1 μL(GAA)10(10 pmol μL-1), 3 μL dextran sulfate (50%)。在鑒定小麥–黑麥和小麥–簇毛麥易位系時, 除單獨采用寡核苷酸探針套分析外, 為確證易位身份還進(jìn)一步將寡核苷酸探針套與基因組 DNA探針同時進(jìn)行 GISH/FISH分析, 此時, 雜交液中分別增加黑麥或簇毛麥基因組DNA探針2.5 μL和輝縣紅基因組DNA 1.7 μL作為封組。采用缺刻平移法制備黑麥和簇毛麥基因組DNA探針, 分別利用簇毛麥和黑麥基因組 DNA為模板, 用 Fluorescein-12-dUTP標(biāo)記探針。反應(yīng)液體系 50 μL, 包括 5 μL 10× DNA Polymerase I buffer, 5 μL dNTP, 3～4 μg 模板 DNA, 3 μL DNA Polymerase I (3～6 U μL-1), 1.2 μL Recombinant DNase I (1∶1000), 1 μL Fluorescein-12-dUTP, 30 μL ddH2O。在冰上完成反應(yīng)液配制, 然后于PCR儀16℃溫育2 h, 以-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

原位雜交時, 混勻雜交液, 在105℃加熱塊中變性13 min, 取出后迅速置–20℃冰酒精10 min以上;制片置于70%酒精 + NaOH (0.15 mol L-1)中, 24℃變性6 min, 迅速依次置于70%、95%和100%酒精,各脫水3 min, 氣干; 將雜交液加在制片上, 于37℃恒溫箱雜交6 h以上。

完成雜交后, 揭去蓋片, 在室溫條件下, 2× SSC洗8 min, 再用清水沖洗一下, 氣干。將6.5 μL DAPI膠加在制片上, 蓋上蓋片, 吸去余膠; 在 Olympus DL72型熒光顯微鏡下鏡檢, 用 SPOT CCD (SPOT Cooled Color Digital Camera)攝取圖像。分析核型時,觀察每個材料 4～15個細(xì)胞, 從中選取染色體數(shù)完整、分散良好的一個細(xì)胞用于核型分析, 少數(shù)材料由于染色體重疊或不完整等原因選用 2個細(xì)胞進(jìn)行核型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國春非整倍體分析與小麥高清核型

利用寡核苷酸探針套通過一次FISH分析, 對源于17個中國春非整倍體的18份材料(表1)的染色體進(jìn)行了分析, 與Du等[43]報道的中國春核型比, 由于減少了紅色信號探針數(shù)目, 使染色體更容易區(qū)分,其中在 B組染色體信號最豐富, 且以綠色為主, 其次為D組, 以紅色為主, 而A組, 紅綠均弱, 據(jù)此可以清晰識別3個基因組及全部染色體, 并構(gòu)建了16個非整倍體高清核型(圖 1, 圖 2; 附圖 1～16)。由圖可見, 14個非整倍體染色體組成穩(wěn)定, 包括N1BT1D、N2BT2D、N3AT3B、N3BT3A、N3DT3B、N4DT4B、N5AT5D、N6AT6D、Dt7AS、N7AT7D、N7BT7D、N7DT7B、Dt7BL (圖 2; 附圖 1～5, 7～9,11～15)和 N2DT2B (附圖 17, 核型未排), 均可以清晰識別相應(yīng)缺體、四體和端體, 特別是根據(jù) 7AS和7BL特征, 將7A和7B長、短臂準(zhǔn)確區(qū)分; 但是, 4個非整倍體發(fā)生變異, 其中 N5BT5D沒有缺少 5B,5D也僅有2條, 但發(fā)現(xiàn)1對小片段相互易位, 推測為 T6AS·6AL-6DL 和 T6DS·6DL-6AL, 另外, 其 7D長臂頂端也發(fā)生變化(圖1-F, 圖2); 對2份N4DT4B材料的鑒定結(jié)果, 其中一份鑒定準(zhǔn)確, 而另一份則從中發(fā)現(xiàn)1個單株僅包含1條4D但3條4B (圖1-E,圖2), 明顯發(fā)生了異交; 從 N6BT6A中鑒定出1個單株雖為6B缺體, 但沒有預(yù)期6A四體, 而分別多了1條1D和3B, 其2A、2B、5B和7B同時表現(xiàn)明顯的多態(tài)性(圖2); N4AT4B (附圖18)中沒有發(fā)現(xiàn)4A缺體和4B四體, 為正常的整倍體類型。綜合非整倍體核型特征, 繪制了中國春高清標(biāo)準(zhǔn)核型, 用于清晰識別小麥3個基因組和7個部分同源群全部染色體(圖 2)。

圖1 中國春非整倍體寡核苷酸探針套paintingFig. 1 Chromosomes of Chinese Spring aneuploids after oligonucleotide multiplex painting

2.2 地方品種和栽培品種分析

為驗證該寡核苷酸探針套及中國春標(biāo)準(zhǔn)核型的應(yīng)用潛力, 對7個地方品種、10個栽培品種和1個人工合成小麥進(jìn)行了分析。與中國春相比, 供試材料在15條染色體上具有多態(tài)性, 其中B組除4B外6條染色體均具多態(tài), A組5條染色體(2A、4A、5A、6A和7A)具有多態(tài), 而D組4條染色體(1D、2D、4D 和 7D)有多態(tài)(圖 3, 圖 4; 附圖 19～36)。我國小麥品種(系)包含的3種易位類型, 分別是T6VS·6AL類型, 如 92R137和南農(nóng) 1258 (圖 3-A, 圖 4; 附圖31～32), T1RS·1BL類型, 如周麥27、原泛3號和矮孟牛 VII (圖 3-C、E, 圖 4; 附圖 33～35), 以及相互易位 T7DS·1BL 和 T1RS·7DL 類型, 如矮孟牛 IV (圖3-G, 圖 4; 附圖 36), 通過該探針套一次 FISH可以清晰識別, 與GISH分析結(jié)果完全一致(圖3-B、D、F、H)。經(jīng)過多次不同顏色探針組合的雜交確證, 在南農(nóng)1258中除T6VS·6AL外, 還發(fā)現(xiàn)1對明顯的5A和3B相互易位, 形成T5AS·3BS和5AL·3BL (圖3-A、B, 圖4; 附圖31), 發(fā)生易位的3B染色體來自親本92R137 (圖 4, 附圖 32)。

圖2 基于寡核苷酸探針套painting的中國春非整倍體高清核型Fig. 2 Oligonucleotide multiplex painting-based high resolution standard karyotypes of Chinese Spring aneuploids箭頭示染色體多態(tài)性。Arrowheads show the polymorphism of chromosomes.

2.3 親緣物種分析

為了解該探針套在小麥親緣物種中的應(yīng)用潛力,對5個物種進(jìn)行了分析。該探針套在栽培一粒小麥、硬粒小麥“Langdon”、黑麥、長穗偃麥草全部染色體產(chǎn)生清晰信號, 可識別不同染色體(圖5, 附圖37～附圖40), 其中Langdon與普通小麥A、B組染色體相似, 黑麥與Du等[43]報道的結(jié)果相似, 但栽培一粒小麥與Langdon、普通小麥A組染色體均存在明顯差異; 中間偃麥草30條染色體產(chǎn)生了清晰且豐富的信號, 12條沒有明顯信號(圖5, 附圖41), 3個基因組差異明顯。

圖3 基于寡核苷酸探針套painting和GISH與寡核苷酸探針套painting相結(jié)合的小麥品種染色體Fig. 3 Chromosomes of wheat varieties after oligonucleotide multiplex painting and combined GISH oligonucleotide multiplex painting

3 討論

圖4 基于寡核苷酸探針套painting的18個小麥品種核型Fig. 4 Oligonucleotide multiplex painting-based karyotypes of 18 wheat varieties

圖5 基于寡核苷酸探針套painting的小麥親緣物種核型Fig. 5 Oligonucleotide multiplex painting-based karyotypes of wheat relatives

FISH技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用大大推動了植物染色體工程和細(xì)胞遺傳學(xué)發(fā)展[48], 而基于寡核苷酸painting的染色體鑒定技術(shù)將迅速發(fā)展的基因組學(xué)與分子細(xì)胞遺傳學(xué)緊密結(jié)合, 不但為染色體精確鑒定和生物學(xué)研究提供了新工具, 同時也將推動染色體工程發(fā)展。本研究利用我們前期開發(fā)的寡核苷酸探針套, 對41份小麥材料進(jìn)行了迅速鑒定, 明確了這些材料的染色體特征, 構(gòu)建了多數(shù)材料的高清核型。這些帶型與曾廣泛應(yīng)用的 C-分帶核型[49]相比,不但具有更高的清晰度, 而且 3個基因組染色體顏色和帶紋差異明顯, 因此更容易識別不同基因組和染色體。利用這些核型, 不但可以發(fā)現(xiàn)供試材料間明顯的染色體多態(tài)性, 而且僅通過一次 FISH, 不通過GISH分析, 即可直接區(qū)分生產(chǎn)上常用的3種異源易位系, 甚至揭示發(fā)生在6A和6D之間的小片段相互易位, 充分表明這種方法的應(yīng)用潛力。該法可用于分析更多的小麥品種及親緣物種, 以揭示其中包含的染色體變異, 特別是自發(fā)的相互易位、倒位和小片段易位, 為構(gòu)建準(zhǔn)確的遺傳圖譜以及骨干親本基因組重測序后的序列組裝提供參考。同時還可以揭示不同多態(tài)性染色體的地理分布特征以及骨干親本變異類型與傳遞特點, 從染色體水平上解釋某些骨干親本優(yōu)良變異的聚合與優(yōu)勢傳遞。

供試18份非整倍體中, 14個保存完好, 未檢測出明顯的變化, 為進(jìn)一步利用這些材料提供了信息,但是4份材料發(fā)生了明顯的變異, 其中N6BT6D的一個單株同時包含3條1D、3條3B, 缺少6B, 其他染色體包括 6D均是完整的, 但多條染色體表現(xiàn)出多態(tài)性(圖2)。推測該材料因為異交而造成了復(fù)雜的染色體變化。進(jìn)一步鑒定應(yīng)該可以發(fā)現(xiàn)更多的變異類型, 但由于引進(jìn)的種子有限, 尚未進(jìn)一步分析。更有趣的是, 從N5BT5D中發(fā)現(xiàn)含有完整的5B和5D,但也發(fā)現(xiàn)一對明顯發(fā)生在6A和6D長臂頂端的小片段相互易位。推測早期的 5B缺體由于缺少 Ph1基因而導(dǎo)致部分同源染色體重組產(chǎn)生, 7D染色體長臂頂端的變化可能也歸因于此。這說明5B缺體誘導(dǎo)部分同源染色體配對的效應(yīng)是明顯的, 值得在染色體工程中的利用; 但在引進(jìn)和保存 N5BT5D時要特別注意及時鑒定和嚴(yán)格套袋自交。

從供試栽培品種和地方品種中共發(fā)現(xiàn)15條染色體具有多態(tài)性, 其中 B組最多, 其次為 A, 最后為D, 這與Du等[43]的分析結(jié)果相似, 說明我國小麥D組染色體多態(tài)性仍需要繼續(xù)拓寬。本文鑒定的合成小麥 1D染色體存在明顯多態(tài)(圖 4), 在所有鑒定的品種中均未發(fā)現(xiàn), 說明人工合成小麥可以作為我國小麥 D基因組改良的重要供體, 需要繼續(xù)進(jìn)行鑒定和利用。另外, 通過對栽培一粒小麥的鑒定發(fā)現(xiàn), 其A組染色體與普通小麥和硬粒小麥均存在很大多態(tài)性, 因此是拓寬 A基因組遺傳基礎(chǔ)的供體。研究還發(fā)現(xiàn), 該探針套可以通過一次FISH清晰區(qū)分小麥生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的3種易位系, T1RS·1BL、T6VS·6AL及相互易位系T1RS·7DL和T7DS·1BL, 而對這些易位系的準(zhǔn)確鑒定過去需要采用多種手段[50-51]。另外,發(fā)現(xiàn)于“矮孟?！敝械南嗷ヒ孜?T1RS·7DL和T7DS·1BL 是繼 T1BL·1RS、T1AL·1RS 在小麥生產(chǎn)上大量應(yīng)用的第3種小麥–黑麥易位系, 其在把黑麥多個有利基因傳遞的同時, 由于相互易位雜合體基因重組率下降而使 3條小麥染色體臂上的有利基因也總以集團(tuán)的形式傳遞給后代, 因此這種易位在人工選擇的過程中可能會有較高的出現(xiàn)頻率。相互易位 T1RS·7DL和 T7DS·1BL的育成和大量使用給我們繼續(xù)培育新的骨干親本提供了借鑒, 采用染色體工程將優(yōu)良親本的有利基因組合以相互易位或倒位的方式加以固定起來以降低基因重組率、保持優(yōu)良的基因單倍體型應(yīng)該引起人們的足夠重視, 一些新的染色體工程技術(shù)(例如同源重組系統(tǒng)或其他基因組編輯系統(tǒng))可以加速實現(xiàn)這一夢想[3]。值得注意的是, 我們通過矮孟牛V (包含相互易位T1RS·7DL和T7DS·1BL)和 92R137 (T6VS·6AL)雜交育成的小麥新品系南農(nóng)1258[52]因較好地結(jié)合了抗病性和農(nóng)藝性狀, 已被多個單位用作育種親本, 但是本文鑒定發(fā)現(xiàn), 該品系除含有T6VS·6AL外, 還有1對新的相互易位染色體T5AS·3BS和T5AL·3BL, 很可能由于南農(nóng)1258雙親涉及多條易位染色體引起的配對異常造成。由此可以推測, 復(fù)雜易位的利用可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更多新易位, 因此為創(chuàng)造更多相互易位以減少目標(biāo)區(qū)段的重組率和保留優(yōu)異親本中的優(yōu)異基因組合提供了可能。

黑麥、長穗偃麥草和中間偃麥草是我國小麥染色體工程中廣泛應(yīng)用的親本, 我國科學(xué)家已經(jīng)育成了大量相關(guān)小麥異染色體系, 本文建立的核型為鑒定這些材料的染色體組成提供了重要信息。目前,我們已經(jīng)開發(fā)出 20多個小麥、百薩偃麥草寡核苷酸探針, 本文所用的探針套根據(jù) Du等[43]開發(fā)的oligonucleotide multiplex#4簡化而成, 僅包含5個寡核苷酸探針, 其中紅色探針3個(pAs1-1、pAs1-3和AFA-4), 綠色探針2個[pSc119.2-1和(GAA)10],每次合成(每個探針5 OD)僅需要約1500元, 可以分析至少 750張染色體制片, 因此每張成本僅需要約2元, 而且省去了原先質(zhì)粒的引進(jìn)、繁殖、保存、質(zhì)粒提取、檢測和標(biāo)記等程序, 大大簡化了實驗程序, 適合高通量分析。另外, 我們已經(jīng)開發(fā)出可以循環(huán)利用的寡核苷酸染液, 將會進(jìn)一步簡化程序, 為小麥染色體自動化分析提供可能。值得一提的是, 我們開發(fā)的寡核苷酸探針完全可以根據(jù)在不同物種上的分布特征重新組配, 優(yōu)化出針對不同物種的特異探針套, 例如, 在鑒定小麥異染色體系的過程中, 由于 pSc119.2-1在很多物種上也能產(chǎn)生雜交信號, 因此為了與GISH信號相區(qū)別,可以將FAM修飾改用TAMRA修飾, 以更好地識別不同染色體。同理, 對其他寡核苷酸探針也可以根據(jù)實際需要改變修飾物。所有這些都需要對待鑒定物種進(jìn)行單核苷酸探針的順序FISH分析, 明確不同探針的信號分布特征和位置, 特別是對于那些前期缺乏遺傳研究的小麥親緣物種, 從而更好地轉(zhuǎn)移和利用親緣物種的有利基因, 提高染色體工程效率。

4 結(jié)論

基于寡核苷酸探針的染色體 panting技術(shù)在中國春非整倍體上產(chǎn)生了更加清晰穩(wěn)定的多色帶紋,從而可以將小麥3個基因組和7個部分同源群染色體全部準(zhǔn)確區(qū)分, 為小麥染色體工程提供了新的參考標(biāo)準(zhǔn); 我國小麥地方品種和栽培品種, 雖然15條染色體具有多態(tài)性, 但是大部分品種具有相似的染色體特征, 缺乏足夠的多態(tài)性; 同時, 該探針套可以不通過GISH分析清晰區(qū)分廣泛應(yīng)用的3種異源易位系, 即 T1RS·1BL、T6VS·6AL 和相互易位系T1RS·7DL 和 T7DS·1BL; 除硬粒小麥“Langdon”外,其他4個親緣物種均表現(xiàn)出豐富的染色體多態(tài)性, 是拓寬栽培小麥遺傳基礎(chǔ)的重要基因資源。本文報道的寡核苷酸探針套及中國春非整倍體核型為小麥染色體工程提供了新的工具, 值得進(jìn)一步研究和利用。

致謝:本研究部分植物材料轉(zhuǎn)引自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)馬正強(qiáng)教授、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊學(xué)明研究員和吳紀(jì)中研究員、日本鳥取大學(xué)Hisashi Tsujimoto教授, 特此致謝。

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Development and Application of High Resolution Karyotypes of Wheat “Chinese Spring” Aneuploids

WANG Dan-Rui1, DU Pei1, PEI Zi-You2, ZHUANG Li-Fang1,*, and QI Zeng-Jun1,*1State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Crop Science Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China

附圖1 N1BT1D Fig. S1 N1BT1D

附圖2.1 N2BT2D Fig. S2.1 N2BT2D

附圖2.2 N2BT2D Fig. S2.2 N2BT2D

附圖3 N3AT3B Fig. S3 N3AT3B

附圖4 N3BT3A Fig. S4 N3BT3A

附圖5 N3DT3B Fig. S5 N3DT3B

附圖6.1 N4DT4B (包含1條4D和3條4B) Fig. S6.1 N4DT4B (with one 4D and three 4B)

附圖6.2 N4DT4B (包含1條4D和3條4B) Fig. S6.2 N4DT4B (with one 4D and three 4B)

附圖7 N4DT4B Fig. S7 N4DT4B

附圖8 N5AT5D Fig. S8 N5AT5D

附圖9 N6AT6D Fig. S9 N6AT6D

附圖10 N6BT6A (缺2條6B、有3條1D和3條3B) Fig. S10 N6BT6A (absence of two 6B, with one 1D and three 3B)

附圖11 Dt7AS Fig. S11 Dt7AS

附圖12 N7AT7D Fig. S12 N7AT7D

附圖13.1 N7BT7D Fig. S13.1 N7BT7D

附圖13.2 N7BT7D Fig. S13.2 N7BT7D

附圖14 N7DT7B Fig. S14 N7DT7B

附圖15.1 Dt7BL Fig. S15.1 Dt7BL

附圖15.2 Dt7BL Fig. S15.2 Dt7BL

附圖16.1 N5BT5D變異為相互易位T6AS·6AL-6DL和T6DS·6DL-6ALFig. S16.1 N5BT5D, a small segmental reciprocal translocation T6AS·6AL 6DL and T6DS·6DL-6AL occurred

附圖 16.2 N5BT5D (T6AS·6AL-6DL 和 T6DS·6DL-6AL)Fig. S16.2 N5BT5D (T6AS·6AL-6DL and T6DS·6DL-6AL)

附圖17 N2DT2B Fig. S18 N2DT2B

附圖18.1 N4AT4B (無4A缺體和4B四體) Fig. S18.1 N4AT4B (nullisomic 4A and tetrasomic 4B not found)

附圖18.2 N4AT4B (無4A缺體和4B四體) Fig. S18.2 N4AT4B (nullisomic 4A and tetrasomic 4B not found)

附圖19 望水白 Fig. S19 Wangshuibai

附圖20 和尚麥 Fig. S20 Heshangmai

附圖21.1 赤面小麥 Fig. S21.1 Chimianxiaomai

附圖21.2 赤面小麥 Fig. S21.2 Chimianxiaomai

附圖22.1 翻山小麥 Fig. S 22.1 Fanshanxiaomai

附圖22.2 翻山小麥 Fig. S22.2 Fanshanxiaomai

附圖23.1 紅頭麥 Fig. S23.1 Hongtoumai

附圖23.2 紅頭麥 Fig. S23.2 Hongtoumai

附圖24 薔薇麥 Fig. S24 Qiangweimai

附圖25.1 絲籽麥 Fig. S25.1 Sizimai

附圖25.2 絲籽麥 Fig. S25.2 Sizimai

附圖26.1 蘇麥3號 Fig. S26.1 Sumai 3

附圖26.2 蘇麥3號 Fig. S26.2 Sumai 3

附圖27.1 寧麥9號 Fig. S27.1 Ningmai 9

附圖28.1 人工合成小麥 Fig. S28.1 Langdon/KU-2088 synthetic wheat

附圖28.2 人工合成小麥 Fig. S28.2 Langdon/KU-2088 synthetic wheat

附圖29.1 揚麥6號 Fig. S29.1 Yangmai 6

附圖29.2 揚麥6號 Fig. S29.2 Yangmai 6

附圖30.1 津強(qiáng)6號 Fig. S30.1 Jinqiang 6

附圖30.2 津強(qiáng)6號 Fig. S30.2 Jinqiang 6

附圖31.1 南農(nóng)1258 Fig. S31.1 Nannong 1258

附圖31.2 南農(nóng)1258 Fig. S31.2 Nannong 1258

附圖31.3 南農(nóng)1258 Fig. S31.3 Nannong 1258

附圖31.4 南農(nóng)1258 Fig. S31.4 Nannong 1258

附圖32.1 92R137 Fig. S32.1 92R137

圖32 .2 92R137 Fig. S32.2 92R137

附圖33.1 周麥27 Fig. S33.1 Zhoumai 27

附圖33.2 周麥27 Fig. S32.2 Zhoumai 27

附圖34.1 原泛3號 Fig. S33.1 Yuanfan 3

附圖34.2 原泛3號 Fig. S33.2 Yuanfan 3

附圖34.3 原泛3號 Fig. S34.3 Yuanfan 3

附圖34.4 原泛3號 Fig. S34.4 Yuanfan 3

附圖35.1 矮孟牛VII Fig. S35.1 Aimengniu VII

附圖35.2 矮孟牛VII Fig. S35.2 Aimengniu VII

附圖35.3 矮孟牛VII Fig. S35.3 Aimengniu VII

附圖36.1 矮孟牛IV Fig. S36.1 Aimengniu IV

附圖36.2 矮孟牛IV Fig. S36.2 Aimengniu IV

附圖36.3 矮孟牛IV Fig. S36.3 Aimengniu IV

附圖37.1 栽培一粒小麥 Fig. S37.1 Triticum monococcum

附圖37.2 栽培一粒小麥 Fig. S37.2 Triticum monococcum

附圖38 硬粒小麥Langdon Fig. S38 Langdon Triticum turgidum var. durum

附圖39.1 荊州黑麥 Fig. S39.1 Rye cultivar Jingzhouheimai

附圖39.2 荊州黑麥 Fig. S39.2 Rye cultivar Jingzhouheimai

附圖40.1 長穗偃麥草(2n = 2x = 14) Fig. S40.1 Thinopyrum elongatum (2n = 2x = 14)

附圖40.2 長穗偃麥草(2n = 2x = 14) Fig. S40.2 Thinopyrum elongatum (2n = 2x = 14)

附圖41.1 中間偃麥草 Fig. S41.1 Thinopyrum intermedium

附圖41.2 中間偃麥草 Fig. S41.2 Thinopyrum intermedium

10.3724/SP.J.1006.2017.01575

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31370385)和山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院所長青年引導(dǎo)專項(yydzx09)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31370385) and Institute Director Foundation of Shanxi Academy of Agricultural Sciences for Youth (yydzx09).

*通訊作者(Corresponding authors): 亓增軍, E-mail: zjqi@njau.edu.cn; 莊麗芳, E-mail: lfzhuang@njau.edu.cn

聯(lián)系方式: E-mail: 2014101112@njau.edu.cn

): 2017-03-06; Accepted(接受日期): 2017-07-23; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-08-11.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170811.1306.004.html