抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑活性及理化性質(zhì)

樊艷平 張耀文 趙雪英 張仙紅,*山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山西太谷03080;山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 山西太原030000

抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑活性及理化性質(zhì)

樊艷平1張耀文2趙雪英2張仙紅1,*1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山西太谷030801;2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 山西太原030000

以4個(gè)抗豆象綠豆品系B18、B20、B24和A22為試材, 以感蟲(chóng)綠豆品種晉綠1號(hào)為對(duì)照, 研究了不同綠豆中胰蛋白酶抑制劑活性及其在高溫、酸堿及超聲波下綠豆的胰蛋白酶抑制劑穩(wěn)定性。結(jié)果表明, 4個(gè)抗豆象綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性均顯著高于對(duì)照感蟲(chóng)品種, 且均與對(duì)照在0.01水平差異極顯著, 其中B18活性最高, 高達(dá)70.2 TI U g–1, B20和A22活性次之, B24活性最差, 但仍高達(dá)55.2 TI U g–1。4個(gè)抗豆象綠豆品種在不同溫度、不同pH和不同振幅超聲波下, 殘余活性均比對(duì)照高, 且殘余活性均隨溫度升高、溫浴時(shí)間延長(zhǎng)而降低, pH在2～12之間, 隨pH值的升高, 殘余活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 且pH值為6～8之間殘余活性最高, 殘余活性也隨超聲波輻射強(qiáng)度升高、時(shí)間延長(zhǎng)而降低, 且4個(gè)抗蟲(chóng)品種中B18的耐高溫性、耐酸堿性和耐輻射性最強(qiáng), B20次之, B24的耐高溫性、耐酸堿性最差, A22耐輻射性最差, 說(shuō)明在不同溫度、pH和超聲波處理后, B18、B20是抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑殘余活性保存最高的2個(gè)品種, 應(yīng)用價(jià)值較大。

抗豆象綠豆; 胰蛋白酶抑制劑; 活性; 溫度; pH; 超聲波

Abstract:Taking bruchid-resistant mung bean lines including B18, B20, B24, and A22 as experimental materials, a susceptible variety mung bean Jinlyu 1 as control, the activity of trypsin inhibitor and the stability of mung bean trypsin inhibitor under high temperature, pH and ultrasonic were measured. The trypsin inhibitor activities of four bruchid-resistant mung bean lines were significantly higher than those of control (Jinlyu 1). There were significant differences of trypsin inhibitor activity between four bruchid-resistant mung bean lines and the control at the 1% probability level. Among them, B18 had the highest activity (70.2 TI U g–1), following by B20 and A22, and B24 had the lowest one (55.2 TI U g–1). When treated with temperature, pH and amplitude of ultrasonic, the residual activities of trypsin inhibitor from the four bruchid-resistant mung bean lines were higher than those of control. The residual activities decreased with the increase of temperature and time of warm bath, which enhanced initially and then weakened when pH value was elevating between 2–12, with the highest when pH ranged from six to eight. The residual activities also reduced with the increasing ultrasonic intensity and treatment time. Among the four tested lines, B18 had the highest tolerance to high temperature, high acid and alkali stress, and ultrasonic intensity; B20 had the moderate tolerance, B24 had the lowest tolerance to high temperature, acid and alkali stress, while A22 had the lowest tolerance to ultrasonic treatment. We concluded that among four lines, B18 and B20 have the highest residual activity of bruchid-resistant mung bean trypsin inhibitor under temperature, pH and ultrasonic treatments, being of higher value of its application.

Keywords:Bruchid-resistant mung bean; Trypsin inhibitor; Activity; Temperature; pH; Ultrasonic

胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor, TI)普遍存在 于種子和塊莖等植物的儲(chǔ)藏器官中, 在豆類(lèi)作物種子中含量較高[1-3]。它能在生物體內(nèi)與胰蛋白酶結(jié)合形成一類(lèi)不可逆的無(wú)酶活性的復(fù)合物, 從而抑制生物對(duì)蛋白質(zhì)的消化、吸收和利用。胰蛋白酶抑制劑作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子, 可與昆蟲(chóng)腸道中的胰蛋白酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物而影響昆蟲(chóng)對(duì)食物的消化和吸收; 同時(shí), 胰蛋白酶抑制劑與胰蛋白酶形成的復(fù)合物還可能作為一個(gè)負(fù)反饋信號(hào)抑制昆蟲(chóng)的取食,這種雙重效應(yīng)有效地降低了害蟲(chóng)對(duì)食物蛋白的消化利用[4-7]。此外, 胰蛋白酶抑制劑還具有抗病毒、抗癌的作用, 據(jù)報(bào)道, 自豆類(lèi)中提取的 Kunitz型和Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑可抑制HIV-1病毒增殖的反轉(zhuǎn)錄酶的活性, 從而抑制 HIV-1病毒的增殖[8]; 自蠶豆中提取的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑, 不僅可以抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶活性, 同時(shí)具有通過(guò)誘導(dǎo)染色質(zhì)凝聚和細(xì)胞凋亡而抑制 HepG2肝腫瘤細(xì)胞增殖的能力[9]。此外, 大豆的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑對(duì)卵巢癌、宮頸癌及腸癌等多種腫瘤表現(xiàn)明顯的抗癌活性[10-12]; 北海道黑豆的 Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑對(duì)乳房癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制[13];蕎麥胰蛋白酶抑制劑可通過(guò)誘導(dǎo)實(shí)體癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用[14-16]。因此, 目前胰蛋白酶抑制劑被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品和生物工程等領(lǐng)域[17-19]。

綠豆胰蛋白酶抑制劑的研究始于20世紀(jì)60年代[20-21], 屬 Bowman-Birk類(lèi)抑制劑, 其 2個(gè)活性中心Lys和Arg可分別抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性[22], 因此被認(rèn)為是自然界里胰蛋白酶最有效的抑制劑之一[23]。目前, 許多學(xué)者已對(duì)綠豆胰蛋白酶抑制劑分離純化技術(shù)進(jìn)行了研究[24-28], 其LysGP33活性片段抑制人結(jié)腸癌 SW480細(xì)胞的遷移[29]及對(duì)Kexin和Furin蛋白前體加工酶的抑制活性也得到了證實(shí)[23], 此外, 綠豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡也有明顯抑制作用[30], 但對(duì)其生物學(xué)活性研究較少?？瓜x(chóng)害是胰蛋白酶抑制劑具有的生物功能之一, 那么抗蟲(chóng)綠豆中胰蛋白酶抑制劑活性會(huì)不會(huì)高于感蟲(chóng)品種, 其活性是否穩(wěn)定？目前這方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。為此本試驗(yàn)以4個(gè)不同的抗蟲(chóng)綠豆為材料, 進(jìn)行了綠豆品種中胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定及在高溫、酸堿及超聲波作用下其穩(wěn)定性的研究, 旨在為抗蟲(chóng)綠豆資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試綠豆

選用高抗豆象綠豆品系A(chǔ)22、B18、B20和B24及普通綠豆品種晉綠1號(hào), 以普通綠豆晉綠1號(hào)為對(duì)照, 均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 供試試劑及儀器

胰蛋白酶購(gòu)自 Sigma公司; 苯甲酰-DL-精氨酸-對(duì)硝基酰胺鹽(BAPNA)、鹽酸、Tris堿為分析純乙酸。

粉碎機(jī)購(gòu)自北京科技有限公司; 恒溫水浴鍋購(gòu)自北京永光明醫(yī)療儀器廠; 離心機(jī)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司; 天平購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)DANAHER公司; 搖床購(gòu)自上海長(zhǎng)城生化廠; 超聲波處理器購(gòu)自美國(guó)Branson公司; 移液槍購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 胰蛋白酶抑制劑的提取

用多功能食品粉碎機(jī)粉碎綠豆并通過(guò)孔徑 140 μm篩, 稱(chēng)取過(guò)篩樣品20 g溶于20 mL蒸餾水, 于4℃振蕩過(guò)夜, 振蕩速度為 180 r min–1, 以 2000 × g 離心 15 min, 將所得沉淀(i)再次溶于等量蒸餾水重復(fù)以上操作, 合并 2次上清液為(I), 用磁力攪拌器緩慢攪拌, 緩慢加入研細(xì)的無(wú)水 CaCl2, 使 CaCl2最終濃度達(dá)到0.0375 mol L–1, 蛋白質(zhì)形成較大顆粒沉淀后立即停止攪拌, 靜置20 min, 5000 × g離心15 min,得到上清液(II)和沉淀(ii)。將沉淀(ii)用蒸餾水復(fù)溶、二次提取后, 同樣以5000 × g離心15 min, 得到上清液(III)和沉淀(iii)。重復(fù)以上操作得到上清液(IV)和沉淀(iv), 合并上清液備用。

1.4 胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定

取上述提取液0.1 mL加5 mg mL–1胰蛋白酶溶液0.1 mL與0.05 mol L–1Tris-HCl緩沖液(pH 8.1) 0.6 mL, 混勻后置37℃水浴10 min, 加底物BNPNA 1.0 mL, 于 37℃水浴 10 min, 最后加 30%乙酸 0.5 mL終止反應(yīng), 410 nm測(cè)吸光度, 計(jì)算抑制劑的活性[31]。

在上述反應(yīng)條件下抑制 1 mg (1∶250)胰蛋白酶活性所需要的抑制劑量為 1個(gè)抑制劑活性單位(TI U)。

1.5 溫度對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響

取 0.5 mL提取液置帶螺旋蓋的菌種冷凍管中,加入0.5 mL蒸餾水, 擰緊蓋子, 分別在40℃、60℃、80℃、100℃恒溫水浴處理30 min和60 min, 取出后立即置冰上冷卻 15 min, 終止反應(yīng)后離心, 取上清液按前述方法計(jì)算抑制劑的殘余活性。

1.6 pH對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響

取 0.05 mol L–1pH 2、pH 4、pH 6、pH 8、pH 10、pH 12的緩沖液0.5 mL分別于離心管(其中pH 2和pH 4為檸檬酸緩沖液, pH 6、pH 8、pH 10和pH1 2為T(mén)ris-HCl緩沖液), 再分別加0.5 mL提取液于每種緩沖液, 混勻后37℃靜置8 h。取上清液按前述方法計(jì)算抑制劑的殘余活性。

（40）吾知此地造析天會(huì)，方從無(wú)間來(lái)赴之。（《太上說(shuō)玄天大聖真武本傳神呪妙經(jīng)註》卷六，《中華道藏》30/579）

1.7 超聲波對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性的影響

用吸管吸取 5 mL待測(cè)液放入一個(gè)特殊的玻璃容器中(能通過(guò)循環(huán)冷水保持周?chē)鷾囟仍?25±3℃,減少對(duì) TI的熱效應(yīng)), 把玻璃容器放進(jìn)超聲波處理器, 使錐形探頭伸進(jìn)樣品溶液中。以振幅25%、35%、45%、55%和65%分別處理5、10、15和20 min來(lái)檢測(cè)超聲波處理下抑制劑的殘余活性[32]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)中胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定3次重復(fù), 以其平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。采用Microsoft Excel處理數(shù)據(jù), 用SPS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗豆象綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性比較

由表1可知, 4個(gè)抗豆象綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性均顯著高于對(duì)照, 且與對(duì)照在 0.01水平差異極顯著, 4個(gè)抗蟲(chóng)品種間B18分別與A22、B20和B24在0.01水平差異極顯著, B20和B24在0.01水平差異極顯著, 其中B18活性最高, 達(dá)70.2 TI U g–1, 為對(duì)照的1.65倍, B20和A22次之, 分別達(dá)62.5 TI U g–1和 60.1 TI U g–1, 分別是對(duì)照的 1.47 倍和 1.41 倍,B24活性最低, 為55.2 TI U g–1, 仍為對(duì)照的1.30倍,4個(gè)抗蟲(chóng)品種間胰蛋白酶抑制劑活性差異較大, 高低相差1.27倍。

表1 不同抗豆象綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性比較Table 1 TI activity of different bruchid-resistant mung bean varieties

2.2 溫度對(duì)抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響

由表 2可知, 不同溫度不同溫浴時(shí)間對(duì)各供試綠豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響不同, 參試品種的抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑殘余活性有隨溫度升高、溫浴時(shí)間延長(zhǎng)而降低的趨勢(shì), 在 40℃時(shí), 分別溫浴30 min、60 min各綠豆胰蛋白酶抑制劑殘余活性均在 90%以上, 說(shuō)明低溫下溫浴時(shí)間對(duì)殘余活性的影響很小, 但隨溫度升高, 溫浴時(shí)間延長(zhǎng), 各綠豆品種活性均降低, 而 B18、B20在 100℃溫浴 60 min殘余活性仍比對(duì)照分別高 21.0%和 14.7%, B24活性最低, 僅比對(duì)照高 7.5%。在各溫度處理下, 抗蟲(chóng)綠豆B18和B20的胰蛋白酶抑制劑均有較高的殘余活性, 且均與對(duì)照差異顯著, 說(shuō)明 B18的耐高溫性最強(qiáng), B20次之, B24最差。各綠豆品種在各溫度處理下變異系數(shù)在0.035～0.082之間, 其中100℃下溫浴30 min變異系數(shù)要比其他各處理均大, 說(shuō)明溫度為100℃溫浴30 min對(duì)各綠豆品種活性的影響較大。同時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果作均數(shù)間的多重比較(表3)表明,在各溫度處理下, 4個(gè)抗蟲(chóng)品種 TI活性均值均高于對(duì)照, 且 4個(gè)抗蟲(chóng)品種之間及與對(duì)照之間均在 0.01水平差異極顯著, B18的TI活性均值明顯高于其他3個(gè)抗蟲(chóng)品種。而不同溫浴時(shí)間、不同溫度處理下TI活性均值也均在 0.01水平差異極顯著, 且溫浴 30 min比溫浴60 min TI活性的均值要高, 40℃的溫度處理比其他溫度處理TI活性的均值也高一些, 說(shuō)明較短的溫浴時(shí)間和低溫對(duì)TI活性的影響較小, 相反較長(zhǎng)的溫浴時(shí)間和高溫對(duì)TI活性的影響較大。

2.3 pH對(duì)抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響

表4表明, 在pH 2～12范圍內(nèi), 參試品種的抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑殘余活性隨 pH值的升高,呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 在各pH處理下, 4個(gè)抗蟲(chóng)品種中B18和B20均有較高的殘余活性, 且均與對(duì)照差異顯著, 當(dāng)pH為2時(shí), 分別比對(duì)照高27.0%和17.4%, 此外, B18在pH為12時(shí)殘余活性為對(duì)照的2.81倍, 說(shuō)明B18耐酸堿性均很強(qiáng), B20次之, B24最差。當(dāng)pH值為6～8時(shí), 對(duì)供試各綠豆胰蛋白酶抑制劑活性影響較小。供試各綠豆品種在pH 12下變異系數(shù)比其他各處理均大, 說(shuō)明偏堿性環(huán)境對(duì)各綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性的影響較大。對(duì)測(cè)定結(jié)果作均數(shù)間的多重比較(表5)表明, 在各pH處理下,4個(gè)抗蟲(chóng)品種TI活性均值均高于對(duì)照, 且4個(gè)抗蟲(chóng)同一列數(shù)據(jù)后不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

表2 溫度對(duì)抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響Table 2 Effect of temperature on TI activity in bruchid-resistant mung bean

表3 對(duì)不同綠豆品種和不同溫度處理下TI活性作均數(shù)間的多重比較Table 3 Multiple comparisons of TI activity in different mung bean varieties and different temperatures

表4 pH對(duì)抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響Table 4 Effect of pH on TI activity in bruchid-resistant mung bean

表5 對(duì)不同綠豆品種和不同pH處理下TI活性作均數(shù)間的多重比較Tab 5 Multiple comparisons of TI activity in different mungbean varieties and different pH values

2.4 超聲波鈍化對(duì)抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響

由表 6可知, 不同振幅不同處理時(shí)間的超聲波對(duì)各供試綠豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響不同。參試品種的抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑殘余活性有隨超聲波輻射強(qiáng)度升高、時(shí)間延長(zhǎng)而降低的趨勢(shì), 在較低振幅短時(shí)間處理下, 4個(gè)抗蟲(chóng)品種均保持較高的殘余活性, 說(shuō)明低振幅對(duì)活性的影響較小, 但隨振幅增加、處理時(shí)間延長(zhǎng), 殘余活性均有所降低, 各綠豆品種在各振幅處理下變異系數(shù)在 0.035～0.133之間, 其中65%的振幅下處理20 min變異系數(shù)均大于其他各處理, 說(shuō)明較高的振幅處理下, 時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)各綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性的影響越大, 但B18、B20在65%的振幅下處理20 min, 殘余活性仍比對(duì)照分別高48.4%和30.2%。在各振幅處理下, B18和 B20均有較高的殘余活性, 且均與對(duì)照有顯著差異, 說(shuō)明B18的耐輻射性最強(qiáng), B20次之, A22最差。同時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果作均數(shù)間的多重比較(表7)表明, 在各振幅處理下, 4個(gè)抗蟲(chóng)品種 TI活性均值均高于對(duì)照, 且 4個(gè)抗蟲(chóng)品種之間以及與對(duì)照之間均在 0.01水平差異極顯著, B18的TI活性均值明顯高于其他3個(gè)抗蟲(chóng)品種。而不同振幅、不同輻射時(shí)間下TI活性均值也均在α=0.01水平差異極顯著, 且5 min的輻射時(shí)間比其他輻射時(shí)間 TI活性均值要高一些, 及25%的振幅處理要比其他振幅處理的TI活性均值高一些, 說(shuō)明較短的輻射時(shí)間和低振幅對(duì)TI活性的影響較小, 相反較長(zhǎng)的輻射時(shí)間和高振幅對(duì)TI活性的影響較大。

從表1、表2、表4和表6的分析可知, 參試品種在不同溫度、pH和超聲波處理后, B18、B20是抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑活性保存最高的2個(gè)品種,可見(jiàn)抗蟲(chóng)品種B18胰蛋白酶抑制劑的耐高溫性、耐酸堿性和耐輻射性均最強(qiáng), B20次之, B24的耐高溫性、耐酸堿性最差, A22耐輻射性最差, 說(shuō)明B18、B20是生產(chǎn)TI的潛在原料, 即B18、B20中的TI實(shí)際應(yīng)用價(jià)值更大。

3 討論

據(jù)報(bào)道, TI含量與植物品種、生理狀態(tài)及受病蟲(chóng)侵害程度有一定關(guān)系[33], 我國(guó)不同產(chǎn)地的26個(gè)綠豆品種 TI活性為 29.0～53.5 TI U g–1[34]。本試驗(yàn)表明, 4個(gè)抗蟲(chóng)綠豆胰蛋白酶抑制劑活性均顯著高于感蟲(chóng)品種及江均平的報(bào)道結(jié)果。研究表明, TI對(duì)絲氨酸蛋白酶具有廣譜的抑制作用, 可與胰蛋白酶和胰凝乳酶等消化酶結(jié)合而使其失活, 從而治療由于消化酶過(guò)多而對(duì)胰腺造成損傷的胰腺炎[35]; 此外, 綠豆胰蛋白酶抑制劑可有效抵制人肺腺癌 A549細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡[30], 其LysGP33活性片段能夠有效抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的遷移[29], 抗蟲(chóng)綠豆B18和B20中TI含量均較高, 因此綠豆B18、B20有望作為生產(chǎn)TI的潛在原料而用于治療人類(lèi)疾病。

試驗(yàn)表明, 供試抗蟲(chóng)綠豆B18、B20的TI活性在 100℃加熱 30 min后殘余活性可高達(dá) 85.2%～88.5%, 而黑豆的TI活性在同等加熱時(shí)間內(nèi)90℃時(shí)則完全失活[25], 大豆的TI活性在溫度高于80℃活性也急劇下降[36], 可見(jiàn)抗蟲(chóng)綠豆B18、B20較黑豆、大豆的 TI活性具有很強(qiáng)的耐熱性, 這對(duì)于抗蟲(chóng)綠豆B18、B20的TI的開(kāi)發(fā)利用具有非常重要的意義。

據(jù)邵彪等[25]報(bào)道, 黑豆TI經(jīng)pH 2～12處理1 h,活性殘存率均在80%以上; 大豆TI活性在pH 2～11條件下保存30 min, 其活性基本沒(méi)有明顯的變化[36];苦蕎種子在pH 2～6的不同緩沖溶液中放置1 h 后,其抑制活性可保留80%左右, 在pH 12條件下, 抑制活性只保留約30%[26], 本研究中4個(gè)抗豆象綠豆在pH 2～12下保存8 h均有較高的殘余活性, 可見(jiàn)抗蟲(chóng)

綠豆均具有較高的 pH耐受性, 且耐酸性要強(qiáng)于耐堿性。據(jù)報(bào)道, TI作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子, 可與昆蟲(chóng)腸道中的胰蛋白酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物而影響昆蟲(chóng)對(duì)食物的消化和吸收[4-7], 可見(jiàn)抗蟲(chóng)綠豆中 TI可適用于腸中不同 pH的害蟲(chóng)的防治, 同時(shí)也可與不同酸堿性農(nóng)藥混合使用來(lái)控制害蟲(chóng)的為害。

表6 超聲波鈍化對(duì)抗豆象綠豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響Table 6 Effect of ultrasonic inactivation on TI activity in bruchid-resistant mung bean

表7 對(duì)不同綠豆品種和不同振幅處理下TI活性作均數(shù)間的多重比較Table 7 Multiple comparisons of TI activity in different mung bean varieties and different amplitudes

超聲波輻射對(duì)胰蛋白酶抑制劑活性影響的研究較少, Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制劑(KSTI)在65%振幅下隨處理時(shí)間增加殘余活性均快速下降[37], 苦蕎麥的TI活性隨超聲波輻射強(qiáng)度升高、時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)[26], 和本研究的結(jié)果基本一致, 但 4個(gè)抗蟲(chóng)品種在65%振幅下處理20 min殘余活性均高于大豆和苦蕎麥。

研究表明, TI與內(nèi)源抗蟲(chóng)物質(zhì)協(xié)調(diào)作用可增加植物的抗蟲(chóng)性。目前, 至少有15種不同來(lái)源的TI基因轉(zhuǎn)入不同植物, 獲得具有不同抗性的轉(zhuǎn)基因植株,如Hilder等[38]將豇豆TI基因轉(zhuǎn)入煙草中, 獲得了高抗棉鈴蟲(chóng)、粘蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植株; 大麥、南瓜、馬鈴薯、番茄等TI基因轉(zhuǎn)入煙草中獲得抗棉鈴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因煙草; 利用大豆Kunitz型TI基因也獲得抗棉鈴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因煙草、棉花、馬鈴薯等[39]。綠豆B18、B20種子中不僅TI活性高, 且耐高溫、耐酸堿和耐輻射,因此如何科學(xué)使用抗蟲(chóng)綠豆B18、B20的TI基因需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

4個(gè)抗豆象綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性均顯著高于對(duì)照感蟲(chóng)品種, 且在不同溫度、pH和超聲波處理后, 殘余活性也均比對(duì)照感蟲(chóng)品種高, 其中,抗蟲(chóng)綠豆 B18胰蛋白酶抑制劑活性最高且耐高溫性、耐酸堿性和耐輻射性均最強(qiáng), B20次之, 可見(jiàn)綠豆B18、B20有望作為T(mén)I的潛在原料用于培育抗蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植株和治療人類(lèi)疾病。

[1]廖海, 杜林方, 周嘉裕. 植物中蛋白類(lèi)蛋白酶抑制劑的研究進(jìn)展. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2002, 14(1): 80–84 Liao H, Du L F, Zhou J Y. Research progress of protein protease inhibitors in plants. Nat Prod Res Dev, 2002, 14(1): 80–84 (in Chinese)

[2]萬(wàn)善霞, 王婉婉, 滑靜, 張淑平. 胰蛋白酶抑制劑在不同領(lǐng)域的研究概況. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 18: 152–155 Wan S X, Wang W W, Hua J, Zhang S P. Research status of trypsin inhibitor in different fields. J Beijing Agric Coll, 2003, 18:152–155 ( in Chinese with English abstract)

[3]羅玉嬌, 李濱, 舒衡平, 蔣立平. Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的研究進(jìn)展. 中國(guó)生化藥物雜志, 2012, 33: 316–319 Luo Y J, Li B, Shu H P, Jiang L P. Research advances in Kunitz trypsin inhibitor. Chin J Biochem Pharm, 2012, 33: 316–319 ( in Chinese)

[4]吳國(guó)昭, 朱克巖, 曾任森. 大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)斜紋夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育的影響. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2013, 22: 1335–1340 Wu G Z, Zhu K Y, Zeng R S. Effect of soybean trypsin inhibitor on the growth and development of Spodoptera litura. Ecol Environl Sci, 2013, 22: 1335–1340 (in Chinese)

[5]王榮春, 孫建華, 何述棟, 馬鶯. 胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展. 食品科學(xué), 2013, 34(9): 364–368 Wang R C, Sun J H, He S D, Ma Y. Recent advance in research on the structure and function of trypsin inhibitor. Food Sci, 2013,34(9): 364–368 (in Chinese with English abstract)

[6]Oliveira A S, Migliolo L, Aquino R O, Ribeiro J K C, Macedo L L P, Andrade L B, Bemquerer M P, Santos E A, Kiyota S, Sales M P. Purification and characterization of a trypsin-papain inhibitor from Pithecelobium dumosum seeds and its vitro effects towards digestive enzymes from insect pest. Plant Physiol Biochem,2007, 45: 858–865

[7]劉大偉, 陳立杰, 段玉璽. 灰皮支黑豆胰蛋白酶抑制劑基因的克隆及其在胞囊線蟲(chóng)脅迫下的表達(dá)分析. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016,39(4): 94–97 Liu D W, Chen L J, Duan Y X. Cloning of soybean Kunitz trypsin inhibitor gene from huipizhiheidou and expression analysis in soybean infected by Heterodera glycines. J Henan Agric Sci,2016, 39(4): 94–97 (in Chinese with English abstract)

[8]Ye X Y, Ng T B, Rao P F. A Bowman-Birk-type trypsin-chymotrypsin inhibitor from broad beans. Bichem Biophys Res Commun, 2001, 289: 91–96

[9]Evandro F F, Wong J H, Ng T B. Thermostable Kunitz trypsin inhibitor with cytokine inducing, antitumor and HIV-1 reverse transcriptase inhibitory activities from Korean large black soybeans. J Biosci Bioeng, 2010, 109: 211–217

[10]王長(zhǎng)良, 張永忠, 孫志剛. Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制劑研究進(jìn)展. 大豆科學(xué), 2007, 26: 757–761 Wang C L, Zhang Y Z, Sun Z G. Progress on the research of Bowman-Birk soybean trypsin inhibitor. Soybean Sci, 2007, 26:757–761 (in Chinese with English abstract)

[11]Kobayashi H, Suzuki M, Kanayama N, Terao T. A soybean Kunitz trypsin inhibitor suppresses ovarian cancer cell invasion by blocking urokinase upregulation. Clin Exp Metastas, 2004, 21:159–166

[12]張少娟, 薛曉鷗, 劉同祥, 艾浩, 牛建昭. 大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)人宮頸癌 Hela細(xì)胞增殖的影響. 遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008,29: 106–109 Zhang S J, Xue X O, Liu T X, Ai H, Niu J Z. The effect of soybean typsin inhibitor on proliferation of human Hela cells. J Liaoning Med Univ, 2008, 29: 106–109 (in Chinese with English abstract)

[13]Ho V S M, Ng T B. A Bowman-Birk trypsin inhibitor with antiproliferative activity from Hokkaido large black soybeans. J Pept Sci, 2008, 14: 278–282

[14]吳燕子. 重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞 MCF-7作用的研究. 山西大學(xué)碩士學(xué)位論文, 山西太原, 2015 Wu Y Z. Study on Effects of Recombinant Buckwheat TrypsinInhibitor in Breast Cancer Cell Lines MCF-7. MS Thesis of Shanxi University, Taiyuan, China, 2015 (in Chinese with English abstract)

[15]白崇智, 李玉英, 李芳, 張政, 王轉(zhuǎn)花. 重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞 H22凋亡的作用及其機(jī)制. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2009, 31: 79–83 Bai C Z, Li Y Y, Li F, Zhang Z, Wang Z H. Effect of recombinant buckwheat trypsin inhibitor on apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line H22 and its mechanism. Chin J Cell Biol,2009, 31: 79–83 (in Chinese)

[16]李嬌, 崔曉東, 馬曉麗, 王轉(zhuǎn)花. 重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑延長(zhǎng)C. elegans壽命的作用機(jī)制. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2016, 32: 1112–1120 Li J, Cui X D, Ma X L, Wang Z H. Mechanism underlying prolongevity induced by rBTI in Caenorhabditis elegans. Chin J Biochem Mol Biol, 2016, 32: 1112–1120 (in Chinese with English abstract)

[17]Sagili R R, Pankiw T, Zhu-Salzman K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L.).J Insect Physiol, 2005, 51: 953–957

[18]Zeng R S, Su Y J, Ye M, Xie L J, Chen M, Song Y Y. Plant induced defense and biochemical mechanisms. J South China Agric Univ, 2008, 29: 1–6

[19]Zeng R S, Niu G, Wen Z, Schuler M A, Berenbaum M R.Allelochemical induction of cytochrome P450 monooxygenases and amelioration of xenobiotic toxicity in Helicoverpa zea. J Chem Ecol, 2007, 33: 449–461

[20]戚正武, 任梅軒, 屈賢銘, 羅珊珊, 周元聰, 王克夷, 曹天欽.綠豆胰蛋白酶抑制劑化學(xué)與物化特征及其與活力的關(guān)系. 中國(guó)生理科學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集, 北京, 1964. pp 43–44 Qi Z W, Ren M X, Qu X M, Luo S S, Zhou Y C, Wang K Y, Cao T Q. Characterization of chemical and physicochemical properties of mung bean trypsin inhibitor and its relationship with viability. In: Proceedings of the Chinese Society of Physiological Sciences, Beijing, China, 1964. pp 43–44 (in Chinese)

[21]屈賢銘, 羅珊珊, 任梅軒, 戚正武, 曹天欽. 綠豆胰蛋白酶抑制劑的研究: II. 抑制劑A、B組份的關(guān)系及其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特征.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào), 1964, 4: 588–597 Qu X M, Luo S S, Ren M X, Qi Z W, Cao T Q. Studies on inhibitors of mung bean trypsin: II. The relationship between inhibitors, A, B components and their chemical structure characteristics. Acta Biochim Biophy Sin, 1964, 4: 588–597 (in Chinese)

[22]譚復(fù)隆, 戚正武. 綠豆胰蛋白酶抑制劑兩活性區(qū)域的拆分. 生理科學(xué), 1982, 2(5): 13 Tan F L, Qi Z W. Resolution of two active region of mung bean trypsin inhibitor. Physiol Sci, 1982, 2(5): 13 (in Chinese)

[23]曲梅, 韓錦鉑, 孟延發(fā). 綠豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白質(zhì)前體加工酶的抑制活性. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 27: 258–262 Qu M, Han J B, Meng Y F. Inhibitory activity of mung bean trypsin inhibitor on protein precursor processing enzymes. Acad J Second Mil Med Univ, 2006, 27: 258–262 (in Chinese with English abstract)

[24]趙現(xiàn)明. 豆類(lèi)胰蛋白酶抑制劑的提取分離及純化. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 黑龍江哈爾濱, 2013 Zhao X M. Extraction, Isolation and Purification of Trypsin Inhibitors from Leguminosae. MS Thesis of Harbin Institute of Technology, Harbin, China, 2013 (in Chinese with English abstract)

[25]邵彪, 汪少蕓, 饒平凡. 黑豆胰蛋白酶抑制劑的純化及性質(zhì)研究. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2010, 10(6): 47–53 Shao B, Wang S Y, Rao P F. Studies on Purification and characterization of trypsin inhibitor from black soybean. Chin J Food Sci, 2010, 10(6): 47–53 (in Chinese with English abstract)

[26]阮景軍. 苦蕎麥胰蛋白酶抑制劑的分離純化、基因克隆表達(dá)及其抗病蟲(chóng)害研究. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文, 四川成都,2011 Ruan J J. Study on Isolation, Purification, Gene Cloning and Expression of Trypsin Inhibitor of Tartary Buckwheat and Resistance to Diseases and Insect Pest. PhD Dissertation of Sichuan Agricultural University, Chengdu, China, 2011 (in Chinese with English abstract)

[27]王靜, 朱慶華, 陳杰. 紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化及降糖作用研究. 臨床合理用藥雜志, 2015, 8(9): 126–127 Wang J, Zhu Q H, Chen J. Purification and partial characterization of trypsin inhibitor from Phaseolus vulgaris. J Clinic Ration Use Drugs, 2015, 8(9): 126–127 (in Chinese)

[28]阮景軍, 唐自鐘, 陳惠, 程劍平. 核桃胰蛋白酶抑制劑的純化及抑制植物病原真菌研究. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 29: 826–830 Ruan J J, Tang Z Z, Chen H, Cheng J P. Purification of trypsin inhibitor from walnut and its inhibition on plant pathogenic fungi.Southwest China J Agric Sci, 2016, 29: 826–830 (in Chinese with English abstract)

[29]趙亞蕊, 李宗偉, 趙超, 付榮, 王興華, 李卓玉. 重組綠豆胰蛋白酶抑制劑片段對(duì)腸癌細(xì)胞SW480遷移的影響. 山西大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 35: 126–129 Zhao Y R, Li Z W, Zhao C, Fu R, Wang X H, Li Z Y. Effect of recombinant mung bean trypsin inhibitor fragment on the migration of SW480 in human colon cancer cells. J Shanxi Univ, 2012,35: 126–129 (in Chinese)

[30]王莎莎, 馬岳, 李玉銀, 羅深恒, 刁愛(ài)坡, 龍民慧. 綠豆胰蛋白酶抑制劑BBI誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡. 華南師范大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 45(3): 91–94 Wang S S, Ma Y, Li Y Y, Luo S H, Diao A P, Long M H. Apoptosis of lung adenocarcinoma A549 cells induced by mung bean trypsin inhibitor BBI. J South China Norm Univ, 2013, 45(3):91–94 (in Chinese)

[31]Godbole S, Krishna T, Bhatia C. Purification and characterization of protease inhibitors from pigeon pea (Cajanus cajan (L.) Millsp)seeds. J Sci Food Agric, 1994, 64: 87–93

[32]Huang H, Kwok K C, Liang H H. Inhibitory activity and conformation changes of soybean trypsin inhibitors induced by ultrasound. Ultrason Sonochem, 2008, 15: 724–730

[33]EI-Shamei Z, Wu J W, Haard N F. Influence of wound injury on accumulation of proteinase inhibitors in leaf and stem tissues of two processing tomato cultivars. J Food Biochm, 1996, 20(5):155–171

[34]江均平, 李春紅, 張濤, 云冬梅, 楊雪豐. 綠豆胰蛋白酶抑制劑的含量、多型性及穩(wěn)定性. 食品科學(xué), 2013, 34(11): 32–35 Jiang J P, Li C H, Zhang T, Yun D M, Yang X F. Activity,Polymorphism and stability of trypsin inhibitor from mung Beans.Food Sci, 2013, 34(11): 32–35 (in Chinese with English abstract)

[35]趙琳琳. 大豆胰蛋白酶抑制因子對(duì)小鼠胰腺結(jié)構(gòu)功能及基因表達(dá)的影響. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 吉林長(zhǎng)春, 2014 Zhao L L. The Effect of Soybean Trypsin Inhibitor on Structure and Function and Gene Expression Profile in Pancreas of Mice.MS Thesis of Jilin Agricultural University, Changchun, China,2014 (in Chinese with English abstract)

[36]張賓. 大豆胰蛋白酶抑制劑的制備、理化性質(zhì)和抗黃曲霉作用.中國(guó)海洋大學(xué)博士學(xué)位論文, 山東青島, 2010 Zhang B. Preparation, Purification and Properties of Soybean Trypsin Inhibitor with Anti-Aspergillus flavus Activity. PhD Dissertation of Ocean University of China, Qingdao, China, 2010(in Chinese with English abstract)

[37]黃惠華, 粱漢華, 郭乾初. 超聲波對(duì)大豆胰蛋白酶抑制劑活性及二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響. 食品科學(xué), 2004, 25(3): 29–33 Huang H H, Liang H H, Guo Q C. Different effects of ultrasound on two types of soybean trypsin inhibitors in activity and structures. Food Sci, 2004, 25(3): 29–33 (in Chinese with English abstract)

[38]Hilder V A, Gatehouse A M R, Sheerman S E, Barker R F, Boulter D. A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco. Nature, 1987, 300: 160–163

[39]柳武革, 薛慶中. 蛋白酶抑制劑及其在抗蟲(chóng)基因工程中的應(yīng)用. 生物技術(shù)通報(bào), 2000, (1): 20–25 Liu W G, Xue Q Z. Proteinase inhibitors and their application in insect-resistant gene engineering. Biotechnol Inform, 2000, (1):20–25 (in Chinese with English abstract)

Activity and Physico Chemical Properties of Trypsin Inhibitor in Bruchid-Resistant Mung Bean

FAN Yan-Ping1, ZHANG Yao-Wen2, ZHAO Xue-Ying2, and ZHANG Xian-Hong1,*1College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China;2Institute of Crop Science, Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030000, China

10.3724/SP.J.1006.2017.01696

本研究由國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(GARS-08-G11)資助。

The study was supported by the China Agriculture Research System (GARS-08-G11).

*通訊作者(Corresponding author): 張仙紅, E-mail: zxh6288@sina.com

聯(lián)系方式: E-mail: ndxxxy@126.com, Tel: 13485360715

): 2016-12-18; Accepted(接受日期): 2017-07-23; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-08-10.URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170810.1616.008.html