澇漬對(duì)Bt棉棉蕾殺蟲蛋白表達(dá)含量及氮代謝影響

李 遠(yuǎn) 李亞兵 胡大鵬 王 俊 衡 麗 張 祥陳 源 陳德華,*揚(yáng)州大學(xué)江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇揚(yáng)州 5009;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南安陽455000

耕作栽培·生理生化

澇漬對(duì)Bt棉棉蕾殺蟲蛋白表達(dá)含量及氮代謝影響

李 遠(yuǎn)1李亞兵2胡大鵬1王 俊1衡 麗1張 祥1陳 源1陳德華1,*1揚(yáng)州大學(xué)江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇揚(yáng)州 225009;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南安陽455000

以Bt棉常規(guī)種泗抗1號(hào)和雜交種泗抗3號(hào)為材料, 于盛蕾期設(shè)計(jì)不同程度澇漬(土壤持水量為最大持水量的90%、100%, 漬水2 cm)脅迫4 d以及土壤持水量為最大持水量90%逆境下持續(xù)脅迫24～120 h的試驗(yàn), 探討棉蕾中Bt殺蟲蛋白表達(dá)量變化及相關(guān)氮代謝生理機(jī)制。結(jié)果表明, 土壤不同澇漬程度影響棉蕾Bt蛋白含量。土壤持水量為最大持水量的90%、100%和漬水2 cm處理脅迫后, 常規(guī)種泗抗1號(hào)棉蕾中Bt蛋白含量分別下降36.5%、42.1%和51.4%,雜交種泗抗3號(hào)分別下降19.2%、57.2%和64.5%。90%的土壤持水量持續(xù)脅迫96 h使棉蕾Bt蛋白含量開始顯著下降, 泗抗1號(hào)和泗抗3號(hào)分別下降20.8%和17.6%。隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)下降幅度增大。不同澇漬程度或水漬持續(xù)脅迫條件下, 棉蕾中可溶性蛋白含量, 硝酸還原酶(NR)、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性下降, 游離性氨基酸含量, 肽酶、蛋白酶活性增加。說明澇漬逆境下, 棉蕾中蛋白質(zhì)合成能力下降、分解能力增強(qiáng), 引起可溶性蛋白包括Bt殺蟲蛋白含量下降, 導(dǎo)致棉蕾抗蟲性下降。

Bt棉; 澇漬; 殺蟲蛋白; 氮代謝

Abstract:Using Bt cotton conventional cultivar Sikang 1 and hybrid Sikang 3 as test materials, the experiments of water stress at different levels (relative soil water capacity at 90%, 100%, and 2 cm waterlogging above the soil surface respectively) and 90%soil water capacity remained 24–120 hours were conducted to investigate the square Bt insecticidal protein expression and nitrogen metabolism in bud developmental stage. The soil waterlogging treatments with three levels reduced the square Bt insecticidal protein content by 36.5%, 42.1%, and 51.4% for conventional cultivar Sikang 1 and by 19.2%, 57.2%, and 64.5% for hybrid Sikang 3, respectively. The continuous stress of 96 h in the 90% soil water capacity treatment decreased the square Bt insecticidal protein content significantly, which was 20.8% for Sikang 1 and 17.6% for Sikang 3, the longer the stress sustained, the more the Bt toxin content declined. The soluble protein content, NR, GOT, GPT, GS, and GOGAT activities decreased, and the free amino acids content, peptidase and protease activities increased under different levels of soil waterlogging and continuous stress of 90%soil water capacity stress. Therefore, the reduced protein synthesis ability, and enhanced protein degradation ability may decrease the square soluble protein content including Bt insecticidal protein content, resulting in reduction of the square insect resistance.

Keywords:Bt cotton; Water logging; Insecticidal protein; Nitrogen metabolism

轉(zhuǎn) Bacillus thuringiensis基因棉花(簡(jiǎn)稱 Bt棉)是利用現(xiàn)代生物技術(shù)將蘇云金桿菌的Bt基因?qū)朊藁ㄖ仓牦w內(nèi)培育的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品[1], 是當(dāng)今世界種植面積最大、分布范圍最廣的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物之一[2-6],至2015年我國(guó)推廣面積已達(dá)370萬公頃, 占內(nèi)地植棉面積96%[7]。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉能減少化學(xué)農(nóng)藥的用量和使用次數(shù), 減輕農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的壓力, 降低植棉成本, 具有顯著的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益[8-9]。雖然Bt棉具有以上效益, 但在大面積推廣過程中表現(xiàn)出了抗蟲性表達(dá)不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。Bt棉抗蟲性的表達(dá)存在“時(shí)空差異”, 即不同生育階段、不同器官或部位抗蟲性存在明顯差異[10]。除此之外, 不良的環(huán)境條件對(duì)Bt棉抗蟲性的表達(dá)具有明顯影響[11-12], 其中水分逆境干旱和澇漬是最重要的影響因子[13]。有關(guān)澇漬對(duì)Bt棉殺蟲蛋白表達(dá)量的影響前人已經(jīng)有了一定的研究。王家寶等[14]研究發(fā)現(xiàn), 澇漬后葉片Bt蛋白含量顯著降低。吳敬音等[15]首次報(bào)道土壤淹水對(duì)Bt棉抗蟲性有明顯的抑制作用, 導(dǎo)致轉(zhuǎn)Bt基因棉抗蟲性顯著下降。王留明等[16]對(duì)3個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因棉花品種的研究表明, 花鈴期田間漬澇顯著降低皮棉產(chǎn)量和棉株內(nèi)的Bt蛋白含量, 并且發(fā)現(xiàn)漬澇對(duì)生長(zhǎng)旺盛器官Bt蛋白合成的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于衰老器官。

雖然研究已表明澇漬對(duì) Bt棉抗蟲性有較大的影響, 但這些研究的取樣主要以葉片為主, 而棉鈴蟲危害取食的首選對(duì)象是蕾鈴等生殖器官, 長(zhǎng)江中下游地區(qū)澇害高發(fā)時(shí)期一般在盛蕾期, 因此研究盛蕾期澇漬對(duì)棉蕾殺蟲蛋白表達(dá)量的影響對(duì)于把握蕾期水分逆境下抗蟲性變化具有重要意義。本研究通過探討不同澇漬程度和不同澇漬持續(xù)時(shí)間對(duì) Bt棉殺蟲蛋白表達(dá)量和氮代謝相關(guān)物質(zhì)及關(guān)鍵酶的影響, 明確澇漬對(duì) Bt棉抗蟲性的影響程度及其相關(guān)生理機(jī)制, 為 Bt棉蕾期抗蟲性安全應(yīng)用提供理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2014—2015 年在揚(yáng)州大學(xué)江蘇省栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。盆缽直徑40 cm, 高50 cm, 每盆裝土20 kg過篩的沙壤土。以轉(zhuǎn)Bt基因棉常規(guī)品種泗抗1號(hào)和雜交品種泗抗3號(hào)為材料(分別以代號(hào)SK-1和SK-3表示), 4月3日營(yíng)養(yǎng)缽播種育苗, 5月15日移栽于盆缽。2年盆缽?fù)寥篮袡C(jī)質(zhì)1.88%、水解氮 134.7 mg kg–1、速效磷 22.5 mg kg–1和速效鉀81.3 mg kg–1。根據(jù)本地高產(chǎn)栽培技術(shù)要求進(jìn)行肥料與化控運(yùn)籌。

2014年盛蕾期設(shè)置 4個(gè)土壤澇漬處理, 即 Y1(土壤含水量為最大持水量的90%)、Y2 (土壤含水量為最大持水量)、Y3 (土壤淹水, 土表上方保持2 cm水層)、CK (土壤含水量為土壤最大持水量的75%)。所有水分逆境處理持續(xù)96 h。

在盛蕾期前10 d控制水分, 如遇下雨, 將處理盆缽移入防雨棚內(nèi)。使用 WET土壤三參數(shù)速測(cè)儀(HH2)監(jiān)測(cè)土壤水分, 根據(jù)土壤飽和含水量, 用稱重法調(diào)控土壤水分, 即當(dāng)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)土壤水分低于設(shè)計(jì)值時(shí), 于早、中、晚分別進(jìn)行定量補(bǔ)水, 保持土壤持水量在處理水平。

在2014年試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上, 2015年以土壤持水量為最大持水量 90%作為水漬試驗(yàn)處理, 探討水分脅迫持續(xù)時(shí)間對(duì)Bt棉棉蕾殺蟲蛋白表達(dá)影響。于盛蕾期設(shè)置土壤水漬持續(xù) 24、48、72、96和 120 h處理。同時(shí)設(shè)對(duì)照(CK, 土壤含水量為最大持水量的75%)。各處理土壤水分的調(diào)控方法與2014年試驗(yàn)相同。

試驗(yàn)脅迫處理完畢后, 取相同部位相15日齡的棉蕾, 液氮冷凍后貯存于–20℃低溫冰箱, 用于測(cè)定其Bt蛋白濃度、氮代謝主要物質(zhì)含量及關(guān)鍵酶活性。

1.2 主要測(cè)定項(xiàng)目

應(yīng)用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定Bt殺蟲蛋白含量,藥盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。應(yīng)用G-250考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定可溶性蛋白含量。應(yīng)用抗壞血酸茚三酮染色法測(cè)定游離氨基酸含量。谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性鮮樣經(jīng)Tris-HCl緩沖液研磨離心后, 用賴氏比色法測(cè)定提取液。分別用考馬斯亮藍(lán)法、茚三酮和抗壞血酸比色法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸含量, 計(jì)算蛋白酶和肽酶活性。采用磺胺比色法測(cè)定硝酸還原酶活性。參照文獻(xiàn)[17]測(cè)定谷氨酰胺合成酶(GS)活性和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性, 參照趙鵬等[18]和閆桂萍等[19]方法測(cè)定GOGAT活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Microsoft Excel、SPSS16.0等軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同澇漬程度和水漬持續(xù)期對(duì)棉蕾 Bt殺蟲蛋白含量的影響

圖 1-A表明, 隨著土壤澇漬程度加大, 棉蕾中Bt蛋白含量明顯下降, 且隨著土壤澇漬程度的加大,下降幅度越大。與對(duì)照比, 常規(guī)種SK-1在Y1、Y2和Y3處理下, 棉蕾中Bt蛋白含量分別下降36.5%、42.1%和51.4%; 雜交種SK-3分別下降19.2%、57.2%和 64.5%。多重比較表明, 在土壤持水量為 90%時(shí)(Y1處理)就已顯著低于對(duì)照。雜交種的下降速度大于常規(guī)種。

圖 1-B表明, 隨著土壤澇漬時(shí)間的延長(zhǎng), 棉蕾中殺蟲蛋白表達(dá)量呈下降趨勢(shì), 且持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)下降幅度越大。與對(duì)照比, 在脅迫96 h后Bt蛋白表達(dá)量顯著下降, 其中, 常規(guī)種 SK-1下降 20.8%, 雜交種 SK-3下降 17.6%。隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 雜交種SK-3下降幅度大于常規(guī)種SK-1。

圖1 不同澇漬程度(A)和澇漬持續(xù)時(shí)間(B)對(duì)2個(gè)品種棉蕾中Bt蛋白含量的影響Fig. 1 Effects of water logging on bud Bt protein content of cultivars in different levels (A) and different water logging stress (B)

2.2 對(duì)游離性氨基酸和可溶性蛋白含量的影響

圖2-A、B表明, 隨著土壤澇漬程度的加大, 棉蕾中游離性氨基酸含量顯著上升, 而可溶性蛋白含量顯著下降。與對(duì)照相比, 常規(guī)種SK-1在Y1、Y2和 Y3處理下游離性氨基酸含量分別增加 18.3%、30.1%和59.6%; 雜交種SK-3分別增加16.3%、31.7%和48.4%。隨土壤澇漬程度增加, 游離性氨基酸含量上升幅度加大, 且在土壤相對(duì)含水量為90% (Y1處理)時(shí), 棉蕾中氨基酸含量已顯著高于對(duì)照。

常規(guī)種SK-1在Y1、Y2和Y3處理下, 棉蕾中可溶性蛋白分別下降了16.9%、25.6%和 44.3%; 雜交種SK-3分別下降8.1%、28.6%和50.6%。隨土壤澇漬程度的增加, 可溶性蛋白含量下降幅度也增加,且同樣在土壤相對(duì)含水量為90% (Y1處理)時(shí), 棉蕾中可溶性蛋白含量已顯著低于對(duì)照。

圖2-C、D表明, 隨著土壤澇漬持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng),棉蕾中游離性氨基酸含量呈上升趨勢(shì), 而可溶性蛋白含量呈下降趨勢(shì)。游離性氨基酸含量在脅迫96 h后顯著增加, SK-1增加11.6%, SK-3增加10.7%, 且隨著持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)上升幅度越大。品種間表現(xiàn)為SK-3隨澇漬脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 增加幅度較SK-1大?？扇苄缘鞍自诔掷m(xù)脅迫96 h后顯著下降, SK-1下降20.7%, SK-3下降28.7%, 且隨脅迫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)下降的幅度也越大。品種間表現(xiàn)為隨脅迫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng), 雜交種SK-3下降幅度比常規(guī)種大。

2.3 對(duì)硝酸還原酶(NR)活性的影響

圖 3表明, 硝酸還原酶活性隨澇漬程度的增加或脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)都呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照相比, SK-1在 Y1、Y2和 Y3處理下硝酸還原酶活性分別下降30.0%、25.6%和44.3%; SK-3分別下降25.0%、35.6%和 56.3%。無論常規(guī)種還是雜交種在土壤相對(duì)持水量為90% (Y1處理)時(shí)硝酸還原酶活性就已經(jīng)顯著下降。90%相對(duì)持水量96 h后棉蕾硝酸還原酶活性開始顯著下降, SK-1下降22.7%, SK-3下降33.3%, 且隨持續(xù)脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)下降幅度越大。品種間表現(xiàn)為隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)SK-3下降速度較SK-1快。

2.4 對(duì)谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活性的影響

圖4-A、B表明, 隨著土壤澇漬程度的加大, 棉蕾中GPT和GOT含量均呈明顯下降趨勢(shì), 且隨土壤澇漬程度的增加下降幅度也越大。與對(duì)照相比, 常規(guī)種SK-1在Y1、Y2和Y3處理下棉蕾中GPT活性分別下降17.8%、27.3%和45.3%; 雜交種SK-3分別下降12.8%、22.5%和45.0%, 且在土壤持水量為90%時(shí)(Y1處理)就已與對(duì)照產(chǎn)生顯著差異。不同澇漬程度下棉蕾GOT活性變化表現(xiàn)相同的效應(yīng)。

圖2 不同澇漬程度(A, B)和澇漬持續(xù)時(shí)間(C, D)對(duì)2個(gè)品種棉蕾中游離性氨基酸和可溶性蛋白含量的影響Fig. 2 Effects of water logging level (A, B) and duration time (C, D) on free amino acids and soluble protein contents in bud of cultivars

圖3 不同澇漬程度(A)和澇漬持續(xù)時(shí)間(B)對(duì)2個(gè)品種棉蕾中硝酸還原酶活性的影響Fig. 3 Effects of water logging level (A) and duration time (B) on NR activity in bud of cultivars

圖4-C、D表明, 2個(gè)不同類型Bt棉品種盛蕾期90%土壤持水量持續(xù)脅迫 24～120 h, 棉蕾中 GPT、GOT活性都隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì), 且脅迫時(shí)間越長(zhǎng), 下降幅度越大。與對(duì)照(未脅迫)相比,GPT活性在脅迫96 h后顯著下降, SK-1下降21.3%,SK-3下降17.2%。品種間表現(xiàn)為隨著澇漬脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)SK-3下降速率較SK-1大。GOT同樣在脅迫96 h后顯著下降, SK-1下降 23.3%, SK-3下降21.2%。品種間表現(xiàn)為隨著澇漬持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng),SK-3下降速度較SK-1快。

圖4 不同澇漬程度(A, B)和澇漬持續(xù)時(shí)間(C, D)對(duì)2個(gè)品種棉蕾中GPT和GOT活性的影響Fig. 4 Effects of water logging level (A, B) and duration time (C, D) on GPT and GOT activities in bud of two cultivars

2.5 對(duì)谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性的影響

圖5-A、B表明, 隨著土壤澇漬程度的加大, 棉蕾中GS和GOGAT活性都呈顯著下降趨勢(shì), 且隨著土壤澇漬程度的加大, 下降幅度也越大。與對(duì)照相比, 常規(guī)種SK-1 Y1、Y2和Y3處理下, GS活性分別下降26.1%、31.1%和71.5%, 雜交種SK-3分別下降30.1%、34.2%和63.0%, 且在土壤持水量為90%時(shí)(Y1處理)就已與對(duì)照產(chǎn)生顯著差異。不同澇漬程度下棉蕾GOGAT活性變化表現(xiàn)相同的效應(yīng)。

圖5-C、D表明, 2個(gè)不同類型的Bt棉品種在土壤水漬持續(xù)脅迫24～120 h條件下, 盛蕾期棉蕾中GS和 GOGAT活性隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)都呈下降趨勢(shì),且脅迫時(shí)間越長(zhǎng), 下降幅度越大。與對(duì)照(未脅迫)相比, 盛蕾期棉蕾在脅迫96 h后GS活性顯著下降,SK-1下降28.5%, SK-3下降16.3%。隨著水漬脅迫時(shí)間的延長(zhǎng) SK-3下降速率較 SK-1增大。棉蕾中GOGAT活性表現(xiàn)為同樣的趨勢(shì)。

2.6 對(duì)蛋白酶和肽酶活性的影響

圖6-A、B表明, 隨著土壤澇漬程度的增加, 棉蕾中蛋白酶和肽酶活性都呈明顯的增加趨勢(shì), 且隨著土壤澇漬程度的加大, 增加幅度也越大。與對(duì)照相比, 常規(guī)種 SK-1在Y1、Y2和Y3處理下, 棉蕾中蛋白酶活性分別上升 103.2%、142.8%和 184.7%;雜交種SK-3分別上升44.3%、73.5%和142.7%, 且在土壤相對(duì)持水量90% (處理Y1)時(shí)就已顯著增加。在不同澇漬程度下棉蕾肽酶活性變化表現(xiàn)相同的效應(yīng)。

圖6-C、D表明, 對(duì)2個(gè)不同類型的Bt棉品種,土壤水漬持續(xù)脅迫24～120 h使盛蕾期棉蕾中蛋白酶和肽酶活性隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì), 且脅迫時(shí)間越長(zhǎng), 增加幅度越大。與對(duì)照(未脅迫)相比, 棉蕾中蛋白酶活性在脅迫96 h后顯著增加, SK-1增加19.7%, SK-3增加22.5%。品種間相比表現(xiàn)為雜交種SK-3隨著水漬脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 上升速率較 SK-1大。肽酶活性同樣在脅迫96 h后顯著增加, SK-1增加30.2%, SK-3增加34.8%。品種間相比表現(xiàn)為雜交種 SK-3隨著水漬脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 上升速率較SK-1大。

2.7 澇漬脅迫逆境下棉蕾 Bt殺蟲蛋白表達(dá)量與氮代謝的關(guān)系

表1和表2表明, 無論是在不同澇漬程度, 還是持續(xù)脅迫條件下, 2個(gè)類型品種盛蕾期棉蕾中殺蟲蛋白含量均與可溶性蛋白含量, 硝酸還原酶、GOT、GPT、GS和GOGAT活性呈顯著正相關(guān); 與游離性氨基酸含量, 肽酶、蛋白酶活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。澇漬逆境下可溶性蛋白含量、硝酸還原酶、GOT、GPT、GS和GOGAT活性下降, 游離性氨基酸含量,肽酶、蛋白酶活性增加進(jìn)一步說明澇漬逆境下, 棉蕾蛋白質(zhì)合成能力下降、分解能力增強(qiáng), 導(dǎo)致Bt殺蟲蛋白表達(dá)量下降, 從而抗蟲能力下降。

圖5 不同澇漬程度(A和B)和澇漬持續(xù)時(shí)間(C和D)對(duì)2個(gè)品種棉蕾中GS和GOGAT活性的影響Fig. 5 Effects of water logging level (A and B) and duration time (C and D) on GS and GOGAT activities in bud two cultivars

圖6 不同澇漬程度(A, B)和澇漬持續(xù)時(shí)間(C, D)對(duì)2個(gè)品種棉蕾中蛋白酶和肽酶活性的影響Fig. 6 Effects of water logging level (A, B) and duration time (C, D) on protease and peptidase activities in bud of cultivars

表1 不同澇漬程度條件下生殖器官Bt殺蟲蛋白含量與氮代謝相關(guān)物質(zhì)和關(guān)鍵酶活性的相關(guān)性分析Table 1 Correlation coefficients of insecticidal protein content with substances related to nitrogen metabolism and key enzyme activities under water logging

表2 水分澇漬持續(xù)脅迫下殺蟲蛋白含量與氮代謝相關(guān)物質(zhì)和關(guān)鍵酶活性相關(guān)性分析Table 2 Correlation coefficients of insecticidal protein content with substances related to nitrogen metabolism and key enzyme activities under waterlogging stress

3 討論

3.1 土壤澇漬程度和持續(xù)時(shí)間影響棉蕾的抗蟲性

國(guó)內(nèi)外研究已表明土壤淹水對(duì)Bt棉抗蟲性有明顯的抑制作用, 但當(dāng)澇漬解除后, Bt棉的抗蟲性仍可得到恢復(fù)[20-21]。王永慧等[22]研究指出同一生育期,高溫高濕度下葉片Bt蛋白含量降幅最小, 脅迫解除后恢復(fù)能力最強(qiáng); 低溫低濕度下葉片Bt蛋白含量降幅最大, 恢復(fù)能力最弱。束春娥等[23]研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)2日以上50 mm暴雨就能降低葉片40%～50% Bt蛋白表達(dá)量, 但上述研究主要集中于水分對(duì)葉片抗蟲性影響。本研究表明, 土壤水分由最大持水量的 90%至淹水2 cm的澇漬逆境脅迫4 d時(shí), 無論常規(guī)種還是雜交種, 棉蕾的 Bt蛋白含量顯著下降, 且隨著土壤澇漬程度的加大, 下降幅度也越大, 在土壤持水量為最大持水量的 90%時(shí)就已與對(duì)照產(chǎn)生顯著差異。而在土壤持水量為最大持水量的 90%的水漬逆境脅迫下, 棉蕾的Bt蛋白含量在脅迫至96 h后就顯著下降。這表明, Bt棉棉蕾發(fā)育階段短時(shí)間輕度的澇漬都可能影響棉蕾中Bt殺蟲蛋白的表達(dá)量, 從而影響抗蟲性。因此在棉花盛蕾期要及時(shí)排水, 避免3 d及以上的澇漬影響B(tài)t棉蕾的抗蟲性。

此外, 本文中雜交種的 Bt蛋白含量和其他氮代謝的本底水平(即對(duì)照處理的含量)均高于常規(guī)種, 且兩個(gè)類型品種間 Bt蛋白表達(dá)量也具顯著差異, 這可能與雜種優(yōu)勢(shì)有關(guān)。正常情況下, 具有雜種優(yōu)勢(shì)的雜交種抗逆性更強(qiáng)。但是, 在澇漬脅迫條件下, 雜交種Bt蛋白含量下降速度比常規(guī)種更快, 這可能與雜交種外來基因的翻譯過程更易受外界環(huán)境影響有關(guān)[24]。

3.2 棉蕾蛋白合成能力下降, 分解能力增強(qiáng)是Bt殺蟲蛋白下降的主要生理原因

在環(huán)境影響B(tài)t棉抗蟲性下降機(jī)理上, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者有較多的研究[25-29], 陳德華等[30]研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下Bt棉殺蟲蛋白表達(dá)量的變化與氮代謝有著密切關(guān)系, 高溫引起葉片Bt蛋白含量的下降是蛋白質(zhì)合成能力下降, 分解能力增強(qiáng)的結(jié)果。呂春花等[31]研究也表明, 高溫逆境下Bt棉生殖器官蕾鈴中氮代謝合成關(guān)鍵酶 GPT、GOT活性及可溶性蛋白含量與Bt殺蟲蛋白含量成顯著正相關(guān); 氮代謝分解關(guān)鍵酶蛋白酶活性、氨基酸含量與Bt殺蟲蛋白含量成顯著負(fù)相關(guān)。本研究同樣表明, 水漬逆境下, Bt棉棉蕾中Bt殺蟲蛋白表達(dá)量同樣與氮代謝生理密切相關(guān)。在土壤不同程度澇漬脅迫4 d及持水量90%持續(xù)脅迫逆境下, 盛蕾期棉蕾的可溶性蛋白含量、NR、GPT、GOT、GS、GOGAT活性下降, 而氨基酸含量、肽酶、蛋白酶活性增加, 且隨澇漬程度加大或脅迫時(shí)間延長(zhǎng), 增加或下降的幅度越大。由此可見, 水漬逆境使Bt棉蕾的蛋白質(zhì)合成能力下降, 分解能力增強(qiáng), 從而導(dǎo)致Bt殺蟲蛋白表達(dá)量下降。因此, 在澇漬逆境下通過外部手段促進(jìn)棉蕾中與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的酶活性, 降低與分解相關(guān)的酶活性可能會(huì)有利于增加棉蕾Bt殺蟲蛋白含量, 增強(qiáng)其抗蟲性。

4 結(jié)論

土壤不同程度澇漬均能導(dǎo)致棉蕾Bt蛋白含量下降, 且隨著澇漬程度的加深下降幅度增大。土壤持水量為最大持水量的90%、100%和漬水2 cm處理脅迫后, 常規(guī)種泗抗1號(hào)棉蕾中Bt蛋白含量分別下降了36.5%、42.1%和51.4%, 雜交種泗抗3號(hào)分別下降了19.2%、57.2%和 64.5%。90%的土壤持水量持續(xù)脅迫96 h使棉蕾Bt蛋白含量開始顯著下降, 泗抗1號(hào)和泗抗3號(hào)分別下降20.8%和17.6%。隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)下降幅度增大。不同程度澇漬或水漬持續(xù)脅迫條件下, 棉蕾中可溶性蛋白含量, 硝酸還原酶、GOT、GPT、GS、GOGAT活性下降, 游離性氨基酸含量, 肽酶、蛋白酶活性增加。這些氮代謝相關(guān)物質(zhì)和關(guān)鍵酶的變化與Bt殺蟲蛋白含量具有顯著的相關(guān)性。

[1]鄭繼有. 對(duì)我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種選育的思考和建議. 中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2007年年會(huì)論文匯編, 2007. pp 13–14 Zheng J Y. Consideration and suggestion on breeding of transgenic Bt cotton varieties in China. In: Proceedings of the 2007 Annual Conference of China Cotton Association, 2007. pp 13–14 (in Chinese)

[2]James C. Preview: global status of commercialized biotech/GM crops. ISAAA Briefs, 2004, 32: 1–12

[3]郭香墨, 范術(shù)麗, 王紅梅, 嚴(yán)根土. 我國(guó)棉花育種技術(shù)的創(chuàng)新與成就. 棉花學(xué)報(bào), 2007, 19: 323–330 Guo X M, Fan S L, Wang H M, Yan G T. Achievements of technical innovation about cotton genetics and breeding in China.Cotton Sci, 2007, 19: 323–330 (in Chinese with English abstract)

[4]夏敬源, 鄒奎, 馬志強(qiáng), 夏文省, 柏長(zhǎng)青. 國(guó)產(chǎn)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉技術(shù)集成創(chuàng)新與推廣應(yīng)用. 中國(guó)棉花, 2006, 33(10): 2–5 Xia J Y, Zou K, Ma Z Q, Xia W S, Bai C Q. Domestic transgenic cotton technology integration innovation and application. China Cotton, 2006, 33(10): 2–5 (in Chinese)

[5]魏艷麗, 黃玉杰, 李紅梅, 孫紅星, 楊合同. 棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究. 山東科學(xué), 2008, 21(3): 38–41 Wei Y L, Huang Y J, Li H M, Sun H X, Yang H T. A survey of cotton transgene technology. Shandong Sci, 2008, 21(3): 38–41(in Chinese with English abstract)

[6]李悅有, 翟黎芳, 盧川. 河北棉區(qū)的棉花生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展策略分析. 棉花學(xué)報(bào), 2016, 38: 8–13 Li Y Y, Zhai L F, Lu C. Analysis of cotton production situation and development strategy in Hebei cotton area. Cotton Sci, 2016,38: 8–13 (in Chinese with English abstract)

[7]James C. Global biotechnology / GM crops commercialization development trend in 2015. China Biotechnol, 2016, 36: 1–11

[8]鄭志明, 黃磊, 袁連卿, 孫玉德. 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的特性及病蟲草害綜合防治技術(shù). 北京: 中國(guó)社會(huì)出版社, 2005. pp 231–235 Zheng Z M, Huang L, Yuan L Q, Sun Y D. The Characteristics of Transgenic Insect-resistant Cotton and Pests Integrated Control Techniques. Beijing: China Society Press, 2005. pp 231–235 (in Chinese)

[9]張社梅. 國(guó)產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花科研與應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文, 北京, 2007 Zhang S M. Economic Analysis on Chinese Domestic Genetically Modified Cotton R&D Investment and Application. PhD Dissertation of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijng,China, 2007 (in Chinese with English abstract)

[10]溫四民, 董合忠, 辛呈松. Bt棉抗蟲性差異表達(dá)的研究進(jìn)展.河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, (1): 9–12 Wen S M, Dong H Z, Xin C S. Research progress on the differential expression of insect resistance of Bt cotton. J Henan Agric Sci, 2007, (1): 9–12 (in Chinese)

[11]Jagger R. The company view. Aust Cotton Grower, 1997, (1): 26[12]Kaiser J. Pest overwhelm Bt cotton crop. Science, 1996, 273: 423

[13]王永慧, 陳建平, 蔡立旺, 張萼, 戚永奎. 氣象因子對(duì) Bt棉抗蟲性表達(dá)影響的研究進(jìn)展. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39:20530–20531 Wang Y H, Chen J P, Cai L W, Zhang E, Qi Y K. Research progress in effects of meteorological factors on pest resistance expression of Bt cotton. J Anhui Agric Sci, 2011, 39: 20530–20531(in Chinese with English abstract)

[14]王家寶, 王留明, 沈法富, 張學(xué)坤, 楊靜, 劉任重. 環(huán)境因素對(duì)轉(zhuǎn) Bt基因棉 Bt殺蟲蛋白表達(dá)量的影響. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2000, (6): 4–6Wang J B, Wang L M, Shen F F, Zhang X K, Yang J, Liu R Z.Effect of environment elements on Bt-protein content in transgenic Bt cotton. Shandong Agric Sci, 2000, (6): 4–6 (in Chinese with English abstract)

[15]吳敬音, 何小蘭, 束春娥, 陳松, 傅春霞, 黃駿麒. 土壤淹水對(duì) Bt棉抗棉鈴蟲能力的影響. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1997, 13(4):231–233 Wu J Y, He X L, Su C E, Chen S, Fu C X, Huang J Q. Influence of waterlogging on the bollworm resistance of Bt cotton. Jiangsu J Agric Sci, 1997, 13(4): 231–233 (in Chinese with English abstract)

[16]王留明, 王家寶, 沈法富, 張學(xué)坤, 劉任重. 漬澇與干旱對(duì)不同轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉的影響. 棉花學(xué)報(bào), 2001, 13: 87–90 Wang L M, Wang J B, Shen F F, Zhang X K, Liu R Z. Influences of waterlogging and drought on different transgenic Bt cotton cultivars. Cotton Sci, 2001, 13: 87–90 (in Chinese with English abstract)

[17]Mifin B J, Lea P J. The Biochemistry of Plants. New York: Academic Press, 1980. pp 169–202

[18]趙鵬, 何建國(guó), 熊淑萍, 馬新明. 氮素形態(tài)對(duì)專用小麥旗葉酶活性及籽粒蛋白質(zhì)和產(chǎn)量的影響. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010,15(3): 29–34 Zhao P, He J G, Xiong S P, Ma X M. Studies on the effects of different nitrogen forms on enzyme activity in flag leaves in wheat and protein and yield of grain for specialized end-uses. J China Agric Univ, 2010, 15(3): 29–34 (in Chinese with English abstract)

[19]閻桂萍, 馬鳳鳴, 李文華. 甜菜氨同化途徑的研究. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 30(4): 318–323 Yan G P, Ma F M, Li W H. Studies on the way of ammonia assimilation in sugar beet. J Northeast Agric Univ, 1999, 30(4):318–323 (in Chinese)

[20]Hallikeri S S, Halemani H L, Katageri I S, Patil B C, Patil V C,Palled Y B. Influence of sowing time and moisture regimes on cry protein concentration and related parameters of Bt-cotton.Karnataka J Agric Sci, 2009, 22: 995–1000

[21]Ian J R. Effect of genotype, edaphic, environmental conditions,and agronomic practices on CryIAc protein expression in transgenic cotton. J Cotton Sci, 2006, 10: 252–262

[22]王永慧, 陳建平, 蔡立旺, 張祥, 陳源, 陳德華. 溫濕度處理對(duì)Bt棉殺蟲蛋白表達(dá)的影響. 棉花學(xué)報(bào), 2013, 25: 63–67 Wang Y H, Chen J P, Cai L W, Zhang X, Chen Y, Chen D H.Effect of combination stress of temperature and humidity on insecticidal protein expression of Bt transgenic cotton. Cotton Sci,2013, 25: 63–67 (in Chinese with English abstract)

[23]束春娥, 孫洪武, 孫以文, 柏立新, 黃駿麒, 李勝. 轉(zhuǎn)基因棉Bt毒性表達(dá)的時(shí)空動(dòng)態(tài)及對(duì)棉鈴蟲生存、繁殖的影響. 棉花學(xué)報(bào), 1998, 10: 131–135 Shu C E, Sun H W, Sun Y W, Bai L X, Huang J Q, Li S. Toxic response of cotton bollworm to various parts of Bt-transgenic cotton in different growing stages. Acta Gossypii Sin, 1998, 10:131–135 (in Chinese with English abstract)

[24]Chen D H, Ye G Y, Yang C Q, Chen Y, Wu Y K. Effect of introducing Bacillus thuringiensis gene on nitrogen metabolism in cotton. Field Crops Res, 2004, 87: 1–9

[25]Stam M, Mol J N M, Kooter J M. The silence of genes in transgenic plants. Ann Bot, 1997, 79: 3–12

[26]Finnegan E J, Liewellyn D J, Fitt G P. What’s happening to the expression of the insect protection in field-grown ingard cotton?In: 11th Australian Cotton Conference, 2002. pp 291–297

[27]Helen E H. Season-long monitoring of transgenic cotton plants development of an assay for the quantification of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein. In: 10th Australian Cotton Conference, 2000. pp 331–335

[28]Chen D H, Ye G Y, Yang C Q, Chen Y, Wu Y K. The effect of high temperature on the insecticidal properties of Bt cotton. Environ Exp Bot, 2005, 53: 333–342

[29]Zhang X, Ye G Y, Zhang L, Wang Y H, Chen Y, Chen D H. The impact of introducing the Bacillus thuringiensis gene into cotton on boll nitrogen metabolism. Environ Exp Bot, 2007, 61: 175–180

[30]陳德華, 楊長(zhǎng)琴, 陳源, 聶安全, 吳云康. 高溫脅迫對(duì) Bt棉葉片殺蟲蛋白表達(dá)量和氮代謝影響的研究. 棉花學(xué)報(bào), 2003, 15:288–292 Chen D H, Yang C Q, Chen Y, Nie A Q, Wu Y K. The effects of the high temperature stress on the leaf Bt protein content and nitrogen metabolism of Bt cotton. Cotton Sci, 2003, 15: 288–292(in Chinese with English abstract)

[31]呂春花. 高溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因棉生殖器官Bt殺蟲蛋白表達(dá)量及氮代謝的影響. 揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文, 江蘇揚(yáng)州, 2013 Lyu C H. The Effect of High Temperature on the Insecticidal Properties and Nitrogen Metabolism of Bt Cotton Reproductive Organ. MS Thesis of Yangzhou University, Yangzhou, China,2013 (in Chinese with English abstract)

Effects of Waterlogging on Bt Protein Content and Nitrogen Metabolism in Square of Bt Cotton

LDIe -YHuuaan11,*, LI Ya-Bing2, HU Da-Peng1, WANG Jun1, HENG Li1, ZHANG Xiang1, CHEN Yuan1, and CHEN
1Jiangsu Provincial Key Laboratory of Crops Genetics and Physiology / Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;2State Key Laboratory of Cotton Biology / Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Anyang 455000, China

10.3724/SP.J.1006.2017.01658

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471435, 31301263, 31671613), 江蘇省三新工程項(xiàng)目[SXGC(2014)317, (2016)320], 江蘇省高等教育優(yōu)勢(shì)學(xué)科發(fā)展計(jì)劃(PAPD)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所植棉技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化研究與示范團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2016PCTS-1)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31471435, 31301263, 31671613), Jiangsu “Threeinnovation” Agricultural Project [SXGC(2014)317, (2016)320], the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), and the Project of Planting Cotton Technology Standardization Research and Demonstration.

*通訊作者(Corresponding author): 陳德華, E-mail: cdh@yzu.edu.cn

聯(lián)系方式: E-mail: 1448781259@qq.com

): 2017-02-22; Accepted(接受日期): 2017-07-23; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-08-09.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170809.1645.002.html