慢性丙型肝炎患者中醫(yī)證型與白細(xì)胞介素-28B基因多態(tài)性的關(guān)系*

趙友云 董瑞銀 李 波 劉 玲 韓豎霞 陶軍秀 王業(yè)富 孫莉軍

1.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科 (湖北 武漢, 430061) 2.武漢大學(xué)病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3.武漢百泰基因工程有限公司 4.湖北省中醫(yī)院肝病研究所 5.湖北省臨床檢驗(yàn)中心

·臨床論著·

慢性丙型肝炎患者中醫(yī)證型與白細(xì)胞介素-28B基因多態(tài)性的關(guān)系*

趙友云1,2董瑞銀3李 波1劉 玲1韓豎霞1陶軍秀4王業(yè)富2孫莉軍5△

1.湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科 (湖北 武漢, 430061) 2.武漢大學(xué)病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 3.武漢百泰基因工程有限公司 4.湖北省中醫(yī)院肝病研究所 5.湖北省臨床檢驗(yàn)中心

目的：研究CHC患者中醫(yī)證型與白細(xì)胞介素28B(IL-28B) 單核苷酸多態(tài)性(SNP)的關(guān)系，探討中醫(yī)證候的分子學(xué)機(jī)理。方法通過回顧性研究，收集245例住院CHC患者的一般臨床資料、中醫(yī)證型和肝功能指標(biāo)(ALT、AST、GGT、DBil、TBil、ALP和Alb)、HCV RNA含量，采用DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)CHC患者IL28B SNPs(rs12980275、rsl2979860、rs8099917和rs10853728)基因型，并與235例健康對(duì)照組比較。用SPSS 20.0 軟件分析各數(shù)據(jù)與中醫(yī)證型的相關(guān)性。結(jié)果245例CHC患者中醫(yī)證型分布規(guī)律為肝郁脾虛證最多(177例，72.2%)，其余證型分別為瘀血阻絡(luò)證(38例，15.5%)、肝腎陰虛證(22例，9.0%)、肝膽濕熱證(7例，2.9%)和脾腎陽虛證(1例，0.4%)；肝郁脾虛證患者在年齡、AST、DBil、TBil、ALP和HCV RNA含量與其他證型比較，差異有顯著性意義(P<0.01)，且多見于年輕的、肝功能損傷程度較輕和HCV RNA含量較低的患者；肝郁脾虛證CHC患者的rs12980275 AA基因型和rs8099917 TT基因型和rsl2979860 CC基因型均顯著高于其他證型(P<0.05,P<0.01)，IL-28B 5NP與健康對(duì)照組比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。結(jié)論CHC患者中醫(yī)證型以肝郁脾虛證最多；年齡和肝功能某些指標(biāo)在不同中醫(yī)證型之間存在差異，CHC患者中醫(yī)證型與IL-28B基因某些位點(diǎn)的多態(tài)性相關(guān)，值得深入研究。

肝炎，慢性，丙型; 中醫(yī)證型; IL-28B; 單核苷酸多態(tài)性

AbstractObjective: To investigate the relationship between syndrome types of traditional Chinese medicine (TCM) and IL28B gene polymorphisms in patients with chronic hepatitis C.Methods: A total of 245 patients were enrolled retrospectively.The general characteristics, TCM syndromes, data of liver function (ALT, AST, GGT, DBIL, TBIL, ALP, and ALB) and HCV RNA were collected. IL28B single nuclear polymorphisms (SNPs) (rs12980275, rsl2979860, rs8099917, and rs10853728) of all patients and 235 health control were detected by DNA sequencing. The correlations between TCM syndromes and data were analyzed using the SPSS 20.0.Results:Among 245 patients in the study, the pattern of liver-depression and spleen-deficiency was maximum (177 cases, 72.2%), the rest of patients were obstruction of collaterals by blood stasis type (38 cases, 15.5%), yin deficiency of liver and kidney type (22 cases, 9.0%), damp-heat blocking in liver and gallbladder (7 cases, 2.9%) and yang deficiency of spleen and kidney (1 case, 0.4%) respectively. For age, AST, DBIL, TBIL, ALP and HCV RNA, the difference were significant between liver-depression and spleen-deficiency type and other TCM syndromes (P<0.01). The majority patients of liver-depression and spleen-deficiency type were younger, milder liver damage, and lower load of HCV RNA. There was no statistical difference in the IL28B SNP between the patients of liver-depression and spleen-deficiency type and health group (P>0.05). Rs12980275 genotype AA and rs8099917 TT in the patients of liver-depression and spleen-deficiency type were significantly higher than that in other TCM syndromes (P<0.01), while for rsl2979860 genotype CC, there was no statistical difference in two groups (P>0.05).Conclusion:There were some relationship between TCM symptoms and objective indexes such as age, biochemical markers of liver and IL28B SNP in patients with CHC, which were worth further study.

KeyWordschronic hepatitis C; traditional Chinese medicine syndrome; IL28B; SNP

慢性丙型肝炎(CHC)是造成肝硬化及肝癌的重要原因之一[1]，聚乙二醇化干擾素聯(lián)合利巴韋林是治療CHC的主要抗病毒方案,但仍然存在有持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率(SVR)偏低、副作用大、病毒反彈和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)偏重的影響因素[2,3]。中醫(yī)以整體觀和辨證施治的方式治療CHC，在消除患者癥狀、改善肝臟功能、抑制病毒復(fù)制、提高生存率等方面效果顯著[4]。

中醫(yī)證型是中醫(yī)認(rèn)識(shí)疾病、診斷疾病，據(jù)此遣方治療和觀察療效的關(guān)鍵。然而目前臨床的中醫(yī)辨證分型主要依據(jù)四診結(jié)果分析和綜合判斷，存在一定的主觀性和隨意性。為尋找準(zhǔn)確可靠、可重復(fù)的分子學(xué)標(biāo)志物以揭示中醫(yī)證型的內(nèi)涵，我們采用DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)CHC患者白細(xì)胞介素-28B(IL-28B) 4個(gè)位點(diǎn)(rs12980275、rsl2979860、rs8099917和rs10853728)進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型檢測(cè)，分析CHC患者中醫(yī)證型與患者基本情況、肝臟功能、HCV RNA含量和IL-28B SNP的相關(guān)性?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 245例為2015年1月至2016 年6月在湖北省中醫(yī)院住院的CHC患者，男123例，年齡20～80歲，平均56.73歲；女122例，年齡26～75歲，平均57.17歲；235例為此期間體檢健康人員，為對(duì)照組，其性別和年齡與CHC患者比較，差異無顯著性意義。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) CHC診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《丙型肝炎防治指南》[5]；中醫(yī)證型(肝膽溫?zé)嶙C、肝郁脾虛證、肝腎陰虛證、淤血阻絡(luò)證和脾腎陽虛證)的診斷參考《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)》[6]，由兩位主治醫(yī)師共同判斷，并由一位主任醫(yī)師審核確定。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合上述CHC的診斷標(biāo)準(zhǔn)且符合中醫(yī)證型之一者；年齡在12～80歲者；簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并HIV 和( 或) 其他嗜肝病毒感染者；伴有心、腎、肺、內(nèi)分泌、血液、代謝及胃腸道嚴(yán)重原發(fā)病者；不能合作者、或精神病患者；哺乳、妊娠或正準(zhǔn)備妊娠的婦女。1.5 常規(guī)檢測(cè)指標(biāo) 采用羅氏module P800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST、GGT、ALP、DBil、TBil和Alb；采用ABI Dx全自動(dòng)熒光定量PCR儀檢測(cè)HCV RNA。

1.6 人類基因組DNA提取及IL-28B基因分型 取患者外周EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)抗凝血500ul，采用離心柱方法(北京天根，中國)提取全基因組DNA，按照說明書進(jìn)行操作。采用紫外分光光度儀(Eppendorf公司，德國)檢測(cè)DNA濃度。運(yùn)用PCR的方法對(duì)全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究的候選基因位點(diǎn)rs12980275、rsl2979860、rs8099917和rs10853728擴(kuò)增后用3730測(cè)序儀測(cè)序并分型(上海生工生物工程有限公司)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃復(fù)性35s，72℃延伸40s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。4個(gè)位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)應(yīng)用PubMed Primer blast設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗(yàn)分析。計(jì)數(shù)資料如基因型和等位基因型分布差異，采用卡方檢驗(yàn)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHC患者中醫(yī)證型的分布規(guī)律 見表2。

2.2 肝郁脾虛證與其他4證患者基本情況 見表3。

表3 肝郁脾虛證與其他4證患者基本情況比較

表4 IL-28SNP在3組人員中檢測(cè)結(jié)果比較 [n(%)]

a為肝膽濕熱證、肝腎陰虛證、瘀血阻絡(luò)證和脾腎陽虛證中任一證型；b肝郁脾虛組與健康對(duì)照組比較；c為其他證型組與健康對(duì)照組比較；d為肝郁脾虛組與其他證型組比較

表3顯示,肝郁脾虛證與其他證型相比，在年齡、AST、DBil、TBil、HCV RNA、ALP方面比較，差異有顯著性意義(P<0.05,orP<0.01,orP<0.001)，而性別、ALT、GGT和Alb方面比較差異無顯著性意義(P>0.05)

2.3 肝郁脾虛證和其他證型患者健康對(duì)照人員IL-28B SNPs基因型檢測(cè)情況 見表4。

由表4可見，rs12980275、rsl2979860、rs8099917和rs10853728的基因型和等位基因在肝郁脾虛組與健康對(duì)照組比較，差異無顯著性意義(P>0.05)；其他證型組與健康對(duì)照組相比，rs12980275 AA基因型和A等位基因、rsl2979860 CC基因型和C等位基因、rs8099917 TT基因型和T等位基因的比率差異有顯著性意義(P<0.01)，rs10853728 CC基因型和C等位基因的比率差異無顯著性意義(P>0.05)；肝郁脾虛患者的rs12980275 AA基因型和A等位基因、rs8099917 TT基因型和T等位基因的比率顯著高于其他證型組(P<0.01)，rsl2979860 CC基因型的檢出率高于其他證型組，有顯著性意義(P<0.05)，而rsl2979860的C等位基因雖高于其他證型組，但差異無顯著性意義(P>0.05)。

3 討論

本研究中245例CHC患者中醫(yī)證型分布規(guī)律與陳建杰等報(bào)道[7]的不一致[氣虛邪戀型(42.5%)、肝郁脾虛型(22.8%)、濕熱中阻型(10.9%)、脾腎陽虛型(9.9%)、肝腎虧虛型(7.9%)、瘀血阻絡(luò)型(6.0%)]，原因在于陳教授的研究，是按照多中心、大樣本、廣覆蓋點(diǎn)的調(diào)查方式，對(duì)全國10個(gè)省18研究中心的1241例CHC患者的中醫(yī)證型進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查。本研究所選患者僅為本院的住院患者，均為有癥狀者，且存在地區(qū)差異。

為探索中醫(yī)證型的微觀變化，胡志軍等[8]分析了CHC患者各個(gè)證型的肝功能(ALT、AST、Alb)和HCV RNA等微觀指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)CHC患者中醫(yī)證型與肝功能異常、HCV RNA含量關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示CHC肝郁脾虛證患者的年齡、AST、DBil、TBil和HCV RNA含量均小于或低于其他證型，提示CHC中醫(yī)證型間存在肝臟功能指標(biāo)和病毒載量的差異。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為HCV的感染多由濕熱疫毒所致，然濕熱疫毒進(jìn)入人體后，其轉(zhuǎn)歸和結(jié)局差別很大，正氣虛弱者造成發(fā)病且纏綿難愈；而脾胃功能健旺者，則外邪不另侵入，即使侵入亦或不發(fā)病，或發(fā)病后呈良性轉(zhuǎn)歸?？梢?，濕熱毒邪侵入人體后發(fā)展為慢性肝炎或更嚴(yán)重的肝硬化、肝癌，實(shí)為人體正氣已虛之故[9,10]，與機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)的觀點(diǎn)相一致。王靈臺(tái)[11]在研究CHC的中醫(yī)證型中發(fā)現(xiàn)丙型肝炎是進(jìn)展型疾病，早期為濕熱雍盛，中期見肝郁脾虛，最終累及腎、絡(luò)，可呈腎虛血瘀。我們的研究顯示CHC肝郁脾虛證患者rs12980275 A等位基因和rs8099917 T等位基因的頻率高于其他4證，與健康者比較，差異無顯著性意義。有研究表明[12]，肝郁脾虛證患者經(jīng)疏肝健脾、涼血解毒、活血化瘀治療后可恢復(fù)肝臟功能，實(shí)現(xiàn)抗HCV和HCV RNA 陰轉(zhuǎn)，可能與肝郁脾虛證患者的IL28B基因型有關(guān)，近年來(GWAS研究)發(fā)現(xiàn)IL-28B 的基因多態(tài)性與HCV感染者的病毒自發(fā)清除和療效應(yīng)答高度相關(guān)[13]，由此推斷rs12980275 A等位基因和rs8099917 T等位基因可能是不同中醫(yī)證型的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，我們?cè)贑HC中醫(yī)證型的分子分型研究中，發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛證最多，且多見于年輕、肝臟功能損傷較輕、病毒含量較低者，與健康人群的IL-28B基因型和等位基因頻率比較，差異無顯著性意義，但與其他證型比較，差異有顯著性意義。鑒于其他證型的病例偏少，為避免統(tǒng)計(jì)偏移誤差，未逐一比較分析。未來會(huì)加大其他證型病例的收集和分型研究，以探索中醫(yī)證型的分子學(xué)機(jī)理。

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RelationshipbetweenSyndromeTypesofTraditionalChineseMedicineandIL28BGenePolymorphismsinpatientswithchronichepatitisC

ZHAOYou-yun1,2,DONGYin-rui3,LIBo1,SunLi-jun5△,etal. 1.DepartmentofClinicalLaboratory,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine

(WuhanHubei,430061)China

，2016-11-16 編輯：黃育華)

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.01.002

國家科技部重大專項(xiàng)(No.2012ZX10005004-003)，病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(No.2015KF006)；△通訊作者