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    超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測紅色糖多孢菌胞內(nèi)中間代謝物同位素豐度

    2017-10-16 07:33:22牟翰洪銘劉曉云李敏超黃明志儲炬莊英萍張嗣良
    分析化學 2017年9期
    關鍵詞:類物質(zhì)輔酶代謝物

    牟翰+洪銘+劉曉云+李敏超+黃明志+儲炬+莊英萍+張嗣良

    摘要采用超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(LCMS/MS),建立了能精確檢測紅色糖多孢菌胞內(nèi)代謝物13C同位素豐度的方法。在優(yōu)化的超高效液相色譜的條件及三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的離子傳輸電壓和碰撞池電壓下,篩選出各胞內(nèi)代謝物的最佳離子對。根據(jù)物質(zhì)在LCMS/MS中生成的母離子和子離子碳鏈長短及子離子是否含有13C等特性,建立了“一對一”法、“一對多”法和單級質(zhì)譜SIM法等同位素豐度檢測方法。利用這些方法,檢測了自然標記標準品和13C標記實驗樣品,根據(jù)實驗值與理論值的接近程度篩選出最優(yōu)方法。結(jié)果表明,對于以磷酸糖類為代表的子離子不含有13C的代謝物,“一對一”法最有效; 對于以有機酸類為代表的母離子和子離子都含有13C的短碳鏈代謝物,“一對多”法更有優(yōu)勢; 對于以輔酶A類為代表的母離子和子離子都含有13C且碳鏈較長的代謝物,單級質(zhì)譜SIM法才能發(fā)揮作用。建立的同位素豐度檢測方法具有較好的準確度,可應用于紅色糖多孢菌胞內(nèi)代謝物同位素豐度的檢測,為后續(xù)研究菌體的代謝機理,實現(xiàn)紅霉素的高效表達奠定了基礎。

    關鍵詞紅色糖多孢菌; 胞內(nèi)代謝物; 13C同位素豐度; 超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜

    1引 言

    紅色糖多孢菌是工業(yè)化生產(chǎn)紅霉素的主要菌種,生產(chǎn)工藝優(yōu)化是提高紅霉素生產(chǎn)水平的重要方法。13C代謝分析是一種檢測細胞生理代謝狀態(tài)的有效方法,在工藝優(yōu)化研究中有著廣泛應用[1~4]。紅霉素屬于次級代謝產(chǎn)物,紅色糖多孢菌合成紅霉素時細胞已經(jīng)處于不生長的穩(wěn)定期,這期間細胞新合成蛋白的量不大,使目前廣泛使用的基于菌體蛋白氨基酸同位素豐度信息的13C代謝分析方法不適用于紅霉素生產(chǎn)過程的研究。與菌體蛋白不同,紅霉素合成需要胞內(nèi)中間代謝物持續(xù)不斷的供應,胞內(nèi)中間代謝物同位素豐度的變化能及時反映細胞的代謝狀態(tài)。因此,精確檢測胞內(nèi)中間代謝物的同位素豐度,是進行紅霉素生產(chǎn)過程代謝流分析的前提條件,對理解紅色糖多孢菌胞內(nèi)代謝調(diào)控機理,指導發(fā)酵工藝優(yōu)化具有重要意義[5~9]。

    胞內(nèi)中間代謝物的種類有多種,大致可分為氨基酸、有機酸、磷酸糖和輔酶A類物質(zhì)等。胞內(nèi)代謝物具有周轉(zhuǎn)快、濃度低的特點,色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得以廣泛應用[10]。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將定性與定量分析有機地結(jié)合在一起[11,12],具有高靈敏度、準確度。目前氨基酸的同位素豐度在GCMS上已有較好的檢測方法[13],其它的幾類物質(zhì)由于難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定性等特點,需采用LCMS/MS進行檢測。

    采用LCMS/MS檢測中間代謝物的同位素豐度時,最直接的方法是“一對一”法,即將一個母離子和一個子離子形成離子對,檢測所有可能形成的離子對。引入13C同位素后,在母離子和子離子中都可能含有13C,一種中間代謝物可能形成的離子對數(shù)量較多,加上中間代謝物的濃度很低,造成檢測信號弱、檢測結(jié)果準確度不高等問題[14]。為解決這個問題,Ruhl等[15]提出了一種方法,即“一對多”法,在Q3上一次掃描多個子離子,這樣需要檢測的離子對數(shù)量降低,準確度有可能得到提高。

    為實現(xiàn)紅霉素發(fā)酵過程中胞內(nèi)中間代謝物同位素豐度的精確檢測,本研究分別考察了磷酸糖、有機酸和輔酶A類物質(zhì)的適用檢測方法。這3類物質(zhì)分別代表了用LCMS/MS檢測中間代謝物同位素豐度時常見的典型情況。其中,磷酸糖類物質(zhì)生成的子離子固定為H2PO

    Symbolm@@ 4(m/z 97)或PO3

    Symbolm@@ 3(m/z 79),母離子含有13C,子離子不含13C,子離子的質(zhì)荷比不會隨13C的引入發(fā)生變化,理論上只存在“一對一”法。對于有機酸類物質(zhì),母離子和子離子都含有13C,理論上“一對一”法和“一對多”法將有性能差異,本研究比較了兩種方法的性能差異。對于輔酶A類物質(zhì),母離子和子離子都含有13C,且碳鏈很長,“一對一”法和“一對多”法都不適用,因此選用了單級質(zhì)譜選擇離子模式(SIM)方法。本研究利用各個方法分別檢測各類胞內(nèi)代謝物的自然標記同位素豐度并與理論值作對比,再用所建立的方法測定專門設計的13C標記實驗的實際樣品,對檢測結(jié)果與理論值進行比較,以說明方法的實際應用性能[13]。本研究根據(jù)代謝物在LCMS/MS中母離子和子離子碳鏈的長短及子離子是否含有13C等特性,針對不同種類代謝物,開發(fā)了特異性強、準確度高的同位素分析方法,對其它類似代謝物的同位素豐度檢測具有借鑒推廣意義。

    2實驗部分

    2.1儀器與試劑

    超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(Thermo Fisher公司); ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm,Waters公司); 振蕩器(Thermo Fisher公司);移液器(GILSON公司); 纖維濾膜(Millipore公司); 注射器濾膜(RephiLe公司); 快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(LABCONCO公司); 標準品(Sigma公司); 流動相乙腈、超純水(Fisher Chemical公司); 離子對試劑二丁胺乙酸鹽濃縮液(Sigma公司); [U13C]葡萄糖(Cambridge Isotope Laboratories公司)。

    2.2菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)過程

    取適量紅色糖多孢菌E3菌株。培養(yǎng)基組成為葡萄糖(20% [U13C]和80%自然標記葡萄糖)10 g/L,(NH4)2SO4 5 g/L,KH2PO4 5 g/L,MgSO4·7H2O 0.9 g/L,NaCl 2 g/L。微量元素溶液(30:1000,V/V),其中微量元素: MnSO4·H2O 0.2 g/L,CoCl2·6H2O 0.25 g/L,ZnSO4·7H2O 0.2 g/L, FeSO4·7H2O 0.03 g/L,Na2MoO4·2H2O 0.02 g/L,CaCl2 0.1g/L,CuSO4·5H2O 0.01 g/L。培養(yǎng)條件: 接種量3%; 采用250 mL微型反應器,裝液量150 mL; 過程控制的溫度為34℃,pH 7.0,溶氧保持在30%以上。endprint

    2.3樣品處理

    標準品配制成50 μmol/L水溶液500 μL,準備進樣。標記實驗取樣量5 mL,取樣后立即抽濾,并用5ml去離子水沖洗3遍,將帶有菌體的濾膜泡入液氮中滅活,然后將樣品在冷凍抽干機中凍干,向樣品中加入20 mL

    Symbolm@@ 27℃預冷好的60%甲醇溶液,浸泡在液氮中使其凝固,然后將樣品轉(zhuǎn)入

    Symbolm@@ 27℃冷凍槽內(nèi)使其完全融化,每次融化后需要在振蕩器上振蕩30 s,重復凍融3次,

    Symbolm@@ 10℃ 8000 r/min離心5 min,取上清液,注射器濾膜過濾,過濾后的液體用快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至0.5 mL,于

    Symbolm@@ 80℃保存待測。

    2.4色譜條件和質(zhì)譜條件

    2.4.1色譜條件采用ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm),柱溫: 25℃。流動相A: 5% 乙腈,5 mmol/L二丁胺乙酸鹽溶液; 流動相B: 84%乙腈,5 mmol/L二丁胺乙酸鹽溶液; 流速: 0.2 mL/min。

    各物質(zhì)的洗脫梯度為有機酸類: 0~20 min,0%~20% A; 20~22 min,20%~0% A; 22~27 min,0% A。磷酸糖類: 0~10 min,5%~15% A; 10~15 min,15% A; 15~20 min,15%~5% A; 20~25 min,5% A。輔酶A類0~15 min,10%~22% A; 15~20 min,22%~40% A; 20~23 min,40% A; 23~25 min,40%~10%; 25~30 min,10% A。

    2.4.2質(zhì)譜條件有機酸、磷酸糖、輔酶A類物質(zhì)都采用負離子模式: 噴霧電壓

    Symbolm@@ 3.0 kV,氣化溫度200℃,鞘氣壓15 psi,離子掃描氣壓0 psi,輔助氣壓10 psi,毛細管溫度270℃。

    2.5同位素豐度檢測方法的設置

    2.5.1“一對一”法“一對一”法的原理如圖1,以帶4個碳原子的母離子經(jīng)碰撞形成帶2個碳原子的子離子為例[15],當母離子帶2個13C為M+2時,形成的子離子可能是m+0、m+1、m+2,分別對M+2/m+0、M+2/m+1、M+2/m+2進行檢測,得到3個信號的和為M+2的信號。用“一對一”法檢測帶4個碳原子的母離子,所需檢測的離子對有9個,等于所有可能子離子的數(shù)量?!耙粚σ弧狈ǖ脑O置如附錄1,掃描模式是選擇反應模式(SRM),負離子模式。

    2.5.2“一對多”法“一對多”法的原理如圖2,同樣以帶4個碳原子的母離子碰撞形成帶2個碳原子的子離子為例,當母離子為M+2時,子離子可能是m+0、m+1、m+2,子離子的設定值為三者的中間值,降低Q3的分辨率,也就是增大Q3檢測的半高峰寬(FWHM),擴大了Q3的檢測范圍,將3種情況一次性檢測出來。檢測帶4個碳原子的母離子需要的離子對有5個,等于母離子碳原子數(shù)加1,較“一對一”法有大幅度的減少?!耙粚Χ唷狈ǖ脑O置如附錄2,掃描模式為SRM,負離子模式。由于MAL的母離子與子離子所含的碳原子數(shù)一樣,故母離子與子離子所帶的標記信息一致,MAL不存在“一對多”法。

    2.5.3單級質(zhì)譜SIM方法單級質(zhì)譜SIM方法的設置如附錄3,F(xiàn)WHM設為0.3 amu。

    2.6同位素豐度檢測方法的驗證

    用Isopro軟件來計算胞內(nèi)代謝物自然標記同位素豐度理論值,然后用建好的方法,進樣標準品,得到實測值,將理論值與實測值對比,差距用殘差平方和(SSR)表示。

    在進行標記實驗時,底物中標記的葡萄糖經(jīng)過菌體代謝,會將13C轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)代謝物的碳骨架上,當同位素穩(wěn)態(tài)時,胞內(nèi)代謝物的FL值固定,將理論的FL值與實測的FL值對比,對方法進行評估。

    FL=∑ni=0i·Min·∑ni=0Mi

    其中: n是母離子碳原子的數(shù)量,Mi是含有i個13C的離子占總體的比例。檢測標記實驗樣品得到的數(shù)據(jù)通過Matlab MS Correction Tool來校正自然標記同位素豐度[16]。

    3結(jié)果與討論

    3.1色譜操作條件的優(yōu)化

    胞內(nèi)磷酸糖、有機酸和輔酶A類物質(zhì)由于極性較大,給色譜分離帶來一定困難。本研究根據(jù)3類物質(zhì)的性質(zhì),利用SRM模式對色譜方法進行了優(yōu)化。在流動相中添加離子對試劑,增加了物質(zhì)在色譜柱上的保留能力。優(yōu)化不同的流動相洗脫梯度后,可較好地分離出磷酸糖、有機酸和輔酶A類等20種物質(zhì)[17],如圖3、圖4和圖5。對各物質(zhì)的有效分離為后續(xù)準確檢測代謝物的同位素豐度奠定了基礎。

    3.2質(zhì)譜操作條件優(yōu)化

    用標準品對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化,檢測模式為SRM,負離子模式,獲得了各物質(zhì)最佳的離子對以及最優(yōu)的操作條件,結(jié)果如表1所示。

    3.3自然同位素豐度檢測性能考察

    分別檢測磷酸糖、有機酸和輔酶A類物質(zhì)標準品的自然標記同位素豐度,并比較連續(xù)3次檢測的

    結(jié)果。準確度: 實測值與理論值對比,差距用殘差平方和(SSR)表示。如圖6A所示,測量磷酸糖類物質(zhì),“一對一”法比單級質(zhì)譜SIM方法,平均準確度高了2.2倍; 如圖7A所示,測量有機酸類物質(zhì)時,

    “一對多”法比“一對一”法平均準確度高了4.6倍; 如圖8A所示,測量輔酶A類物質(zhì),“一對多”法比單級質(zhì)譜SIM方法,平均準確度高了3.6倍。

    信號強度: 檢測相同濃度的標準品,測量磷酸糖類物質(zhì)時,如圖6B所示,單級質(zhì)譜SIM方法比“一對一”法信號強度高了4.6倍; 測量有機酸類物質(zhì)時,如圖7B所示,“一對多”法比“一對一”法平均信號強度高了2.4倍; 測量輔酶A類物質(zhì)時,如圖8B所示,單級質(zhì)譜SIM方法比“一對多”法信號強度高了17.8倍。endprint

    3.413C標記實驗樣品分析

    13C標記實驗樣品的理論FL值為99.7%×20%+1.07%×80%=20.05%。磷酸糖類的檢測結(jié)果如圖9A所示,“一對一”法比單級質(zhì)譜SIM法的實測FL值更加接近理論值,說明對于以磷酸糖類為代表的子離子不含13C的代謝物,“一對一”法的檢測更加準確; 有機酸類的檢測結(jié)果如圖9B所示,對于以有機酸類為代表的母離子和子離子都含有13C的短碳鏈代謝物,“一對多”法的檢測更加準確; 如圖9C所示,單級質(zhì)譜SIM方法比“一對多”法的實測FL值更加接近理論值。雖然在檢測自然標記同位素豐度時,“一對多”法具有準確度高的優(yōu)勢,但引入了較多13C后,“一對多”法在Q3部分的設置不足以一次性檢測所有子離子,所以對于以輔酶A類為代表的母離子和子離子都含有13C且碳鏈較長的代謝物,單級質(zhì)譜SIM方法效果更好。同時也要注意到,SIM模式也存在不足之處: 其只用一級質(zhì)譜對物質(zhì)進行掃描,容易受到質(zhì)荷比相同的物質(zhì)干擾,因此需要注意優(yōu)化液相方法,提高對不同代謝物的分離效果。

    4結(jié) 論

    本研究根據(jù)各胞內(nèi)中間代謝物在LCMS/MS中母離子和子離子碳鏈長短及子離子是否含有13C原子等特性的不同,建立了相應的同位素豐度檢測方法。結(jié)果表明,對于以磷酸糖類為代表的子離子不含有13C的代謝物,常規(guī)的“一對一”法就能滿足要求; 對于以有機酸類為代表的母離子和子離子都含有13C的短碳鏈代謝物,“一對多”法比“一對一”法更有優(yōu)勢; 對于以輔酶A類為代表的母離子和子離子都含有13C且碳鏈較長的代謝物,單級質(zhì)譜SIM方法才能發(fā)揮作用。本方法不僅適合于磷酸糖、有機酸和輔酶A類物質(zhì)同位素豐度的檢測,對具有與以上三類物質(zhì)相似性質(zhì)的代謝物,具有借鑒推廣意義。

    References

    1Wiechert W. Metab. Eng., 2001, 3(3): 195-206

    2Ahn W S, Antoniewicz M R. Metab. Eng., 2011, 13(5): 598-609

    3Zamboni N, Fischer E, Muffler A, Wyss M, Hohmann H P, Sauer U. Biotechnol. Bioeng., 2005, 89(2): 219-232

    4Ruhl M, Le Coq D, Aymerich S, Sauer U. J. Biol. Chem., 2012, 287(33): 27959-27970

    5Hong M, Huang M Z, Chu J, Zhuang Y P, Zhang S L.J. Biotechnol., 2016, 231: 1-8

    6Yang Y T, Aristidou A A, San K Y, Bennett G N.Metab. Eng., 1999, 1(1): 26-34

    7Ahn W S, Antoniewicz M R.Metab. Eng., 2011, 13(5): 598-609

    8Zamboni N, Fischer E, Muffler A, Wyss M, Hohmann H P, Sauer U.Biotechnol. Bioeng., 2005, 89(2): 219-232

    9Crown S B, Antoniewicz M R. Metab. Eng., 2013, 16(1): 21-32

    10GUO MengLei, LIU XiaoYun, HUANG MingZhi, LI MinChao, CHU Ju, ZHUANG YingPing,ZHANG SiLiang. Chinese J. Anal. Chem., 2016, 44(2): 232-240

    郭孟磊, 劉曉云, 黃明志, 李敏超, 儲炬, 莊英萍, 張嗣良. 分析化學, 2016, 44(2): 232-240

    11Buchholz A, Takors R, Wandrey C. Anal. Biochem., 2001, 295(2): 129-137

    12Lu W, Bennett B D, Rabinowitz J D. J. Chromatogr. B, 2008, 871(2): 236-242

    13LI MinChao, HUANG MinZhi, LIU YuWei, CHU Ju, ZHUANG YingPing, ZHANG SiLiang. Chinese J. Anal. Chem., 2014, 42(10): 1408-1413

    李敏超, 黃明志, 劉玉偉, 儲炬, 莊英萍, 張嗣良. 分析化學, 2014, 42(10): 1408-1413

    14Kiefer P, Nicolas C, Letisse F, Portais J C. Anal. Biochem., 2007, 360(2): 182-188

    15Ruhl M, Rupp B, Noh K, Wiechert W, Sauer U, Zamboni N. Biotechnol. Bioeng., 2012, 109(3): 763-771

    16Wahl S A, Dauner M, Wiechert W. Biotechnol. Bioeng., 2004, 85(3): 259-268

    17Seifar R M, Ras C, Deshmukh A T, Bekers K M, SuarezMendez C A, da Cruz A L B, van Gulik W M, Heijnen J J. J. Chromatogr. A, 2013, 1311(18): 115-120endprint

    Accurate Detemination of Isotopic Abundance of

    Intracellular Metabolites of Saccharopolysporaerythraea Based on

    Ultra Performance Liquid ChromatographyTriple

    Quadrupole Mass Spectrometry

    MOU Han, HONG Ming, LIU XiaoYun, LI MinChao, HUANG MingZhi*,

    CHU Ju, ZHUANG YingPing, ZHANG SiLiang

    (State Key Laboratory of Bioreactor Engnieering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

    AbstractA method for measuring 13C isotopic abundance of intracellular metabolites of Saccharopolysporaerythraea by ultrahigh performance liquid chromatography (UPLC)triple quadrupole mass spectrometry was established. First, the chromatographic conditions of UPLC were optimized, and then the MS conditions such as unique tube lens voltage, collision energy, and ion pair were optimized. On the bases of length of the parent and daughter ions carbon chains and whether the daughter ions contain 13C atoms, the onetoone method, onetomany method and SIM method were established for measuring 13C isotopic abundance. Then these methods were used to measure naturally labeled intracellular metabolite standards and 13C labeled samples, and according to the gap between the experimental value and the theoretical value, the best method was established for each metabolite of different characteristics. The results showed that onetoone method was most effective for measuring the metabolites of daughter ions not containing 13C atoms represented by sugar phosphates, onetomany method was the best for measuring the metabolites of both parent and daughter ions containing 13C short carbon chains represented by carboxylic acids, SIM method could play a role in measuring the metabolites of both parent and daughter ions containing 13C long carbon chains represented by coenzyme A. This method had a good measurement precision and could be applied to the measurement of Saccharopolysporaerythraea intracellular metabolites, which contributed to the consequent study of metabolic mechanism and the efficient expression of erythromycin.

    KeywordsSaccharopolysporaerythraea; Intracellular metabolites; 13C isotopic abundance; Ultrahigh performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry

    (Received 30 March 2017; accepted 12 June 2017)

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 21276081).endprint

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