• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用檢測紅色糖多孢菌胞內(nèi)中間代謝物同位素豐度

    2017-10-16 07:33:22牟翰洪銘劉曉云李敏超黃明志儲炬莊英萍張嗣良
    分析化學 2017年9期
    關鍵詞:類物質(zhì)輔酶代謝物

    牟翰+洪銘+劉曉云+李敏超+黃明志+儲炬+莊英萍+張嗣良

    摘要采用超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(LCMS/MS),建立了能精確檢測紅色糖多孢菌胞內(nèi)代謝物13C同位素豐度的方法。在優(yōu)化的超高效液相色譜的條件及三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的離子傳輸電壓和碰撞池電壓下,篩選出各胞內(nèi)代謝物的最佳離子對。根據(jù)物質(zhì)在LCMS/MS中生成的母離子和子離子碳鏈長短及子離子是否含有13C等特性,建立了“一對一”法、“一對多”法和單級質(zhì)譜SIM法等同位素豐度檢測方法。利用這些方法,檢測了自然標記標準品和13C標記實驗樣品,根據(jù)實驗值與理論值的接近程度篩選出最優(yōu)方法。結(jié)果表明,對于以磷酸糖類為代表的子離子不含有13C的代謝物,“一對一”法最有效; 對于以有機酸類為代表的母離子和子離子都含有13C的短碳鏈代謝物,“一對多”法更有優(yōu)勢; 對于以輔酶A類為代表的母離子和子離子都含有13C且碳鏈較長的代謝物,單級質(zhì)譜SIM法才能發(fā)揮作用。建立的同位素豐度檢測方法具有較好的準確度,可應用于紅色糖多孢菌胞內(nèi)代謝物同位素豐度的檢測,為后續(xù)研究菌體的代謝機理,實現(xiàn)紅霉素的高效表達奠定了基礎。

    關鍵詞紅色糖多孢菌; 胞內(nèi)代謝物; 13C同位素豐度; 超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜

    1引 言

    紅色糖多孢菌是工業(yè)化生產(chǎn)紅霉素的主要菌種,生產(chǎn)工藝優(yōu)化是提高紅霉素生產(chǎn)水平的重要方法。13C代謝分析是一種檢測細胞生理代謝狀態(tài)的有效方法,在工藝優(yōu)化研究中有著廣泛應用[1~4]。紅霉素屬于次級代謝產(chǎn)物,紅色糖多孢菌合成紅霉素時細胞已經(jīng)處于不生長的穩(wěn)定期,這期間細胞新合成蛋白的量不大,使目前廣泛使用的基于菌體蛋白氨基酸同位素豐度信息的13C代謝分析方法不適用于紅霉素生產(chǎn)過程的研究。與菌體蛋白不同,紅霉素合成需要胞內(nèi)中間代謝物持續(xù)不斷的供應,胞內(nèi)中間代謝物同位素豐度的變化能及時反映細胞的代謝狀態(tài)。因此,精確檢測胞內(nèi)中間代謝物的同位素豐度,是進行紅霉素生產(chǎn)過程代謝流分析的前提條件,對理解紅色糖多孢菌胞內(nèi)代謝調(diào)控機理,指導發(fā)酵工藝優(yōu)化具有重要意義[5~9]。

    胞內(nèi)中間代謝物的種類有多種,大致可分為氨基酸、有機酸、磷酸糖和輔酶A類物質(zhì)等。胞內(nèi)代謝物具有周轉(zhuǎn)快、濃度低的特點,色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得以廣泛應用[10]。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將定性與定量分析有機地結(jié)合在一起[11,12],具有高靈敏度、準確度。目前氨基酸的同位素豐度在GCMS上已有較好的檢測方法[13],其它的幾類物質(zhì)由于難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定性等特點,需采用LCMS/MS進行檢測。

    采用LCMS/MS檢測中間代謝物的同位素豐度時,最直接的方法是“一對一”法,即將一個母離子和一個子離子形成離子對,檢測所有可能形成的離子對。引入13C同位素后,在母離子和子離子中都可能含有13C,一種中間代謝物可能形成的離子對數(shù)量較多,加上中間代謝物的濃度很低,造成檢測信號弱、檢測結(jié)果準確度不高等問題[14]。為解決這個問題,Ruhl等[15]提出了一種方法,即“一對多”法,在Q3上一次掃描多個子離子,這樣需要檢測的離子對數(shù)量降低,準確度有可能得到提高。

    為實現(xiàn)紅霉素發(fā)酵過程中胞內(nèi)中間代謝物同位素豐度的精確檢測,本研究分別考察了磷酸糖、有機酸和輔酶A類物質(zhì)的適用檢測方法。這3類物質(zhì)分別代表了用LCMS/MS檢測中間代謝物同位素豐度時常見的典型情況。其中,磷酸糖類物質(zhì)生成的子離子固定為H2PO

    Symbolm@@ 4(m/z 97)或PO3

    Symbolm@@ 3(m/z 79),母離子含有13C,子離子不含13C,子離子的質(zhì)荷比不會隨13C的引入發(fā)生變化,理論上只存在“一對一”法。對于有機酸類物質(zhì),母離子和子離子都含有13C,理論上“一對一”法和“一對多”法將有性能差異,本研究比較了兩種方法的性能差異。對于輔酶A類物質(zhì),母離子和子離子都含有13C,且碳鏈很長,“一對一”法和“一對多”法都不適用,因此選用了單級質(zhì)譜選擇離子模式(SIM)方法。本研究利用各個方法分別檢測各類胞內(nèi)代謝物的自然標記同位素豐度并與理論值作對比,再用所建立的方法測定專門設計的13C標記實驗的實際樣品,對檢測結(jié)果與理論值進行比較,以說明方法的實際應用性能[13]。本研究根據(jù)代謝物在LCMS/MS中母離子和子離子碳鏈的長短及子離子是否含有13C等特性,針對不同種類代謝物,開發(fā)了特異性強、準確度高的同位素分析方法,對其它類似代謝物的同位素豐度檢測具有借鑒推廣意義。

    2實驗部分

    2.1儀器與試劑

    超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(Thermo Fisher公司); ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm,Waters公司); 振蕩器(Thermo Fisher公司);移液器(GILSON公司); 纖維濾膜(Millipore公司); 注射器濾膜(RephiLe公司); 快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(LABCONCO公司); 標準品(Sigma公司); 流動相乙腈、超純水(Fisher Chemical公司); 離子對試劑二丁胺乙酸鹽濃縮液(Sigma公司); [U13C]葡萄糖(Cambridge Isotope Laboratories公司)。

    2.2菌株、培養(yǎng)基和培養(yǎng)過程

    取適量紅色糖多孢菌E3菌株。培養(yǎng)基組成為葡萄糖(20% [U13C]和80%自然標記葡萄糖)10 g/L,(NH4)2SO4 5 g/L,KH2PO4 5 g/L,MgSO4·7H2O 0.9 g/L,NaCl 2 g/L。微量元素溶液(30:1000,V/V),其中微量元素: MnSO4·H2O 0.2 g/L,CoCl2·6H2O 0.25 g/L,ZnSO4·7H2O 0.2 g/L, FeSO4·7H2O 0.03 g/L,Na2MoO4·2H2O 0.02 g/L,CaCl2 0.1g/L,CuSO4·5H2O 0.01 g/L。培養(yǎng)條件: 接種量3%; 采用250 mL微型反應器,裝液量150 mL; 過程控制的溫度為34℃,pH 7.0,溶氧保持在30%以上。endprint

    2.3樣品處理

    標準品配制成50 μmol/L水溶液500 μL,準備進樣。標記實驗取樣量5 mL,取樣后立即抽濾,并用5ml去離子水沖洗3遍,將帶有菌體的濾膜泡入液氮中滅活,然后將樣品在冷凍抽干機中凍干,向樣品中加入20 mL

    Symbolm@@ 27℃預冷好的60%甲醇溶液,浸泡在液氮中使其凝固,然后將樣品轉(zhuǎn)入

    Symbolm@@ 27℃冷凍槽內(nèi)使其完全融化,每次融化后需要在振蕩器上振蕩30 s,重復凍融3次,

    Symbolm@@ 10℃ 8000 r/min離心5 min,取上清液,注射器濾膜過濾,過濾后的液體用快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至0.5 mL,于

    Symbolm@@ 80℃保存待測。

    2.4色譜條件和質(zhì)譜條件

    2.4.1色譜條件采用ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm),柱溫: 25℃。流動相A: 5% 乙腈,5 mmol/L二丁胺乙酸鹽溶液; 流動相B: 84%乙腈,5 mmol/L二丁胺乙酸鹽溶液; 流速: 0.2 mL/min。

    各物質(zhì)的洗脫梯度為有機酸類: 0~20 min,0%~20% A; 20~22 min,20%~0% A; 22~27 min,0% A。磷酸糖類: 0~10 min,5%~15% A; 10~15 min,15% A; 15~20 min,15%~5% A; 20~25 min,5% A。輔酶A類0~15 min,10%~22% A; 15~20 min,22%~40% A; 20~23 min,40% A; 23~25 min,40%~10%; 25~30 min,10% A。

    2.4.2質(zhì)譜條件有機酸、磷酸糖、輔酶A類物質(zhì)都采用負離子模式: 噴霧電壓

    Symbolm@@ 3.0 kV,氣化溫度200℃,鞘氣壓15 psi,離子掃描氣壓0 psi,輔助氣壓10 psi,毛細管溫度270℃。

    2.5同位素豐度檢測方法的設置

    2.5.1“一對一”法“一對一”法的原理如圖1,以帶4個碳原子的母離子經(jīng)碰撞形成帶2個碳原子的子離子為例[15],當母離子帶2個13C為M+2時,形成的子離子可能是m+0、m+1、m+2,分別對M+2/m+0、M+2/m+1、M+2/m+2進行檢測,得到3個信號的和為M+2的信號。用“一對一”法檢測帶4個碳原子的母離子,所需檢測的離子對有9個,等于所有可能子離子的數(shù)量?!耙粚σ弧狈ǖ脑O置如附錄1,掃描模式是選擇反應模式(SRM),負離子模式。

    2.5.2“一對多”法“一對多”法的原理如圖2,同樣以帶4個碳原子的母離子碰撞形成帶2個碳原子的子離子為例,當母離子為M+2時,子離子可能是m+0、m+1、m+2,子離子的設定值為三者的中間值,降低Q3的分辨率,也就是增大Q3檢測的半高峰寬(FWHM),擴大了Q3的檢測范圍,將3種情況一次性檢測出來。檢測帶4個碳原子的母離子需要的離子對有5個,等于母離子碳原子數(shù)加1,較“一對一”法有大幅度的減少?!耙粚Χ唷狈ǖ脑O置如附錄2,掃描模式為SRM,負離子模式。由于MAL的母離子與子離子所含的碳原子數(shù)一樣,故母離子與子離子所帶的標記信息一致,MAL不存在“一對多”法。

    2.5.3單級質(zhì)譜SIM方法單級質(zhì)譜SIM方法的設置如附錄3,F(xiàn)WHM設為0.3 amu。

    2.6同位素豐度檢測方法的驗證

    用Isopro軟件來計算胞內(nèi)代謝物自然標記同位素豐度理論值,然后用建好的方法,進樣標準品,得到實測值,將理論值與實測值對比,差距用殘差平方和(SSR)表示。

    在進行標記實驗時,底物中標記的葡萄糖經(jīng)過菌體代謝,會將13C轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)代謝物的碳骨架上,當同位素穩(wěn)態(tài)時,胞內(nèi)代謝物的FL值固定,將理論的FL值與實測的FL值對比,對方法進行評估。

    FL=∑ni=0i·Min·∑ni=0Mi

    其中: n是母離子碳原子的數(shù)量,Mi是含有i個13C的離子占總體的比例。檢測標記實驗樣品得到的數(shù)據(jù)通過Matlab MS Correction Tool來校正自然標記同位素豐度[16]。

    3結(jié)果與討論

    3.1色譜操作條件的優(yōu)化

    胞內(nèi)磷酸糖、有機酸和輔酶A類物質(zhì)由于極性較大,給色譜分離帶來一定困難。本研究根據(jù)3類物質(zhì)的性質(zhì),利用SRM模式對色譜方法進行了優(yōu)化。在流動相中添加離子對試劑,增加了物質(zhì)在色譜柱上的保留能力。優(yōu)化不同的流動相洗脫梯度后,可較好地分離出磷酸糖、有機酸和輔酶A類等20種物質(zhì)[17],如圖3、圖4和圖5。對各物質(zhì)的有效分離為后續(xù)準確檢測代謝物的同位素豐度奠定了基礎。

    3.2質(zhì)譜操作條件優(yōu)化

    用標準品對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化,檢測模式為SRM,負離子模式,獲得了各物質(zhì)最佳的離子對以及最優(yōu)的操作條件,結(jié)果如表1所示。

    3.3自然同位素豐度檢測性能考察

    分別檢測磷酸糖、有機酸和輔酶A類物質(zhì)標準品的自然標記同位素豐度,并比較連續(xù)3次檢測的

    結(jié)果。準確度: 實測值與理論值對比,差距用殘差平方和(SSR)表示。如圖6A所示,測量磷酸糖類物質(zhì),“一對一”法比單級質(zhì)譜SIM方法,平均準確度高了2.2倍; 如圖7A所示,測量有機酸類物質(zhì)時,

    “一對多”法比“一對一”法平均準確度高了4.6倍; 如圖8A所示,測量輔酶A類物質(zhì),“一對多”法比單級質(zhì)譜SIM方法,平均準確度高了3.6倍。

    信號強度: 檢測相同濃度的標準品,測量磷酸糖類物質(zhì)時,如圖6B所示,單級質(zhì)譜SIM方法比“一對一”法信號強度高了4.6倍; 測量有機酸類物質(zhì)時,如圖7B所示,“一對多”法比“一對一”法平均信號強度高了2.4倍; 測量輔酶A類物質(zhì)時,如圖8B所示,單級質(zhì)譜SIM方法比“一對多”法信號強度高了17.8倍。endprint

    3.413C標記實驗樣品分析

    13C標記實驗樣品的理論FL值為99.7%×20%+1.07%×80%=20.05%。磷酸糖類的檢測結(jié)果如圖9A所示,“一對一”法比單級質(zhì)譜SIM法的實測FL值更加接近理論值,說明對于以磷酸糖類為代表的子離子不含13C的代謝物,“一對一”法的檢測更加準確; 有機酸類的檢測結(jié)果如圖9B所示,對于以有機酸類為代表的母離子和子離子都含有13C的短碳鏈代謝物,“一對多”法的檢測更加準確; 如圖9C所示,單級質(zhì)譜SIM方法比“一對多”法的實測FL值更加接近理論值。雖然在檢測自然標記同位素豐度時,“一對多”法具有準確度高的優(yōu)勢,但引入了較多13C后,“一對多”法在Q3部分的設置不足以一次性檢測所有子離子,所以對于以輔酶A類為代表的母離子和子離子都含有13C且碳鏈較長的代謝物,單級質(zhì)譜SIM方法效果更好。同時也要注意到,SIM模式也存在不足之處: 其只用一級質(zhì)譜對物質(zhì)進行掃描,容易受到質(zhì)荷比相同的物質(zhì)干擾,因此需要注意優(yōu)化液相方法,提高對不同代謝物的分離效果。

    4結(jié) 論

    本研究根據(jù)各胞內(nèi)中間代謝物在LCMS/MS中母離子和子離子碳鏈長短及子離子是否含有13C原子等特性的不同,建立了相應的同位素豐度檢測方法。結(jié)果表明,對于以磷酸糖類為代表的子離子不含有13C的代謝物,常規(guī)的“一對一”法就能滿足要求; 對于以有機酸類為代表的母離子和子離子都含有13C的短碳鏈代謝物,“一對多”法比“一對一”法更有優(yōu)勢; 對于以輔酶A類為代表的母離子和子離子都含有13C且碳鏈較長的代謝物,單級質(zhì)譜SIM方法才能發(fā)揮作用。本方法不僅適合于磷酸糖、有機酸和輔酶A類物質(zhì)同位素豐度的檢測,對具有與以上三類物質(zhì)相似性質(zhì)的代謝物,具有借鑒推廣意義。

    References

    1Wiechert W. Metab. Eng., 2001, 3(3): 195-206

    2Ahn W S, Antoniewicz M R. Metab. Eng., 2011, 13(5): 598-609

    3Zamboni N, Fischer E, Muffler A, Wyss M, Hohmann H P, Sauer U. Biotechnol. Bioeng., 2005, 89(2): 219-232

    4Ruhl M, Le Coq D, Aymerich S, Sauer U. J. Biol. Chem., 2012, 287(33): 27959-27970

    5Hong M, Huang M Z, Chu J, Zhuang Y P, Zhang S L.J. Biotechnol., 2016, 231: 1-8

    6Yang Y T, Aristidou A A, San K Y, Bennett G N.Metab. Eng., 1999, 1(1): 26-34

    7Ahn W S, Antoniewicz M R.Metab. Eng., 2011, 13(5): 598-609

    8Zamboni N, Fischer E, Muffler A, Wyss M, Hohmann H P, Sauer U.Biotechnol. Bioeng., 2005, 89(2): 219-232

    9Crown S B, Antoniewicz M R. Metab. Eng., 2013, 16(1): 21-32

    10GUO MengLei, LIU XiaoYun, HUANG MingZhi, LI MinChao, CHU Ju, ZHUANG YingPing,ZHANG SiLiang. Chinese J. Anal. Chem., 2016, 44(2): 232-240

    郭孟磊, 劉曉云, 黃明志, 李敏超, 儲炬, 莊英萍, 張嗣良. 分析化學, 2016, 44(2): 232-240

    11Buchholz A, Takors R, Wandrey C. Anal. Biochem., 2001, 295(2): 129-137

    12Lu W, Bennett B D, Rabinowitz J D. J. Chromatogr. B, 2008, 871(2): 236-242

    13LI MinChao, HUANG MinZhi, LIU YuWei, CHU Ju, ZHUANG YingPing, ZHANG SiLiang. Chinese J. Anal. Chem., 2014, 42(10): 1408-1413

    李敏超, 黃明志, 劉玉偉, 儲炬, 莊英萍, 張嗣良. 分析化學, 2014, 42(10): 1408-1413

    14Kiefer P, Nicolas C, Letisse F, Portais J C. Anal. Biochem., 2007, 360(2): 182-188

    15Ruhl M, Rupp B, Noh K, Wiechert W, Sauer U, Zamboni N. Biotechnol. Bioeng., 2012, 109(3): 763-771

    16Wahl S A, Dauner M, Wiechert W. Biotechnol. Bioeng., 2004, 85(3): 259-268

    17Seifar R M, Ras C, Deshmukh A T, Bekers K M, SuarezMendez C A, da Cruz A L B, van Gulik W M, Heijnen J J. J. Chromatogr. A, 2013, 1311(18): 115-120endprint

    Accurate Detemination of Isotopic Abundance of

    Intracellular Metabolites of Saccharopolysporaerythraea Based on

    Ultra Performance Liquid ChromatographyTriple

    Quadrupole Mass Spectrometry

    MOU Han, HONG Ming, LIU XiaoYun, LI MinChao, HUANG MingZhi*,

    CHU Ju, ZHUANG YingPing, ZHANG SiLiang

    (State Key Laboratory of Bioreactor Engnieering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

    AbstractA method for measuring 13C isotopic abundance of intracellular metabolites of Saccharopolysporaerythraea by ultrahigh performance liquid chromatography (UPLC)triple quadrupole mass spectrometry was established. First, the chromatographic conditions of UPLC were optimized, and then the MS conditions such as unique tube lens voltage, collision energy, and ion pair were optimized. On the bases of length of the parent and daughter ions carbon chains and whether the daughter ions contain 13C atoms, the onetoone method, onetomany method and SIM method were established for measuring 13C isotopic abundance. Then these methods were used to measure naturally labeled intracellular metabolite standards and 13C labeled samples, and according to the gap between the experimental value and the theoretical value, the best method was established for each metabolite of different characteristics. The results showed that onetoone method was most effective for measuring the metabolites of daughter ions not containing 13C atoms represented by sugar phosphates, onetomany method was the best for measuring the metabolites of both parent and daughter ions containing 13C short carbon chains represented by carboxylic acids, SIM method could play a role in measuring the metabolites of both parent and daughter ions containing 13C long carbon chains represented by coenzyme A. This method had a good measurement precision and could be applied to the measurement of Saccharopolysporaerythraea intracellular metabolites, which contributed to the consequent study of metabolic mechanism and the efficient expression of erythromycin.

    KeywordsSaccharopolysporaerythraea; Intracellular metabolites; 13C isotopic abundance; Ultrahigh performance liquid chromatographytriple quadrupole mass spectrometry

    (Received 30 March 2017; accepted 12 June 2017)

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 21276081).endprint

    猜你喜歡
    類物質(zhì)輔酶代謝物
    阿爾茨海默病血清代謝物的核磁共振氫譜技術(shù)分析
    國家藥監(jiān)局關于修訂輔酶Q10注射劑說明書的公告(2022年第11號)
    中老年保健(2022年4期)2022-08-22 02:58:30
    柱前衍生化結(jié)合LC-MSn分析人尿中茶堿及其代謝物
    在線富集-膠束電動毛細管色譜用于烷基酚類物質(zhì)的檢測
    前列地爾聯(lián)合復合輔酶治療急性腎損傷的療效探討
    HPLC-MS/MS法分析乙酰甲喹在海參中的主要代謝物
    益腎活血湯聯(lián)合輔酶Q10膠囊治療弱精子癥50例
    輔酶Q10,還原型的更好
    健康之家(2013年6期)2013-04-29 00:44:03
    槲皮素及其代謝物抑制氧化應激與炎癥
    食品科學(2013年15期)2013-03-11 18:25:48
    煙草潛香類物質(zhì)果糖嗪的合成
    波野结衣二区三区在线| 日韩制服骚丝袜av| 97超视频在线观看视频| 一区二区三区乱码不卡18| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久久午夜欧美精品| 免费观看无遮挡的男女| 精品久久久久久久久亚洲| 精品一区二区三卡| 嫩草影院入口| 国产色婷婷99| 熟女人妻精品中文字幕| 成人国产av品久久久| 如何舔出高潮| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产老妇伦熟女老妇高清| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲av免费在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 国产成年人精品一区二区| 国产伦在线观看视频一区| 国产91av在线免费观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产乱人视频| 欧美潮喷喷水| 丝袜美腿在线中文| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲国产最新在线播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 丝瓜视频免费看黄片| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美成人精品欧美一级黄| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲欧美精品自产自拍| 一本一本综合久久| 久久精品人妻少妇| 99热这里只有是精品50| 亚洲国产欧美人成| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产黄片美女视频| 高清在线视频一区二区三区| 国产一级毛片在线| 视频中文字幕在线观看| 人妻 亚洲 视频| 亚洲精品日本国产第一区| 国产有黄有色有爽视频| 女人被狂操c到高潮| 国产成人免费无遮挡视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 中文天堂在线官网| 99久久精品一区二区三区| 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品综合一区二区三区| 色5月婷婷丁香| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美bdsm另类| av在线老鸭窝| 韩国高清视频一区二区三区| 一级片'在线观看视频| 青春草视频在线免费观看| 日韩制服骚丝袜av| 九九爱精品视频在线观看| 国产av码专区亚洲av| 成人二区视频| 亚洲成人av在线免费| 国产av国产精品国产| 熟女电影av网| 嘟嘟电影网在线观看| av国产精品久久久久影院| 免费看a级黄色片| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产男女超爽视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 高清毛片免费看| 免费看av在线观看网站| 亚洲av.av天堂| 国产乱人视频| 国产又色又爽无遮挡免| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久国产网址| 日本av手机在线免费观看| 欧美潮喷喷水| 在线观看国产h片| 国产探花在线观看一区二区| 国产69精品久久久久777片| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲欧美一区二区三区国产| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 边亲边吃奶的免费视频| 国产永久视频网站| 中文字幕久久专区| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 在线精品无人区一区二区三 | 成人亚洲精品av一区二区| 观看美女的网站| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久a久久爽久久v久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产美女午夜福利| 2021少妇久久久久久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久精品94久久精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产精品一及| 免费观看a级毛片全部| 国产极品天堂在线| 国产av码专区亚洲av| 亚洲成人中文字幕在线播放| 超碰av人人做人人爽久久| 麻豆成人午夜福利视频| 国产成人a区在线观看| 人妻一区二区av| 亚洲电影在线观看av| 国产精品成人在线| 亚洲国产欧美人成| 在线免费十八禁| 亚洲人成网站在线播| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲天堂av无毛| 有码 亚洲区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产男女超爽视频在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲av免费高清在线观看| 女人被狂操c到高潮| 久久这里有精品视频免费| 欧美xxⅹ黑人| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产人妻一区二区三区在| 新久久久久国产一级毛片| 熟女av电影| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品综合一区二区三区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 我的老师免费观看完整版| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品女同一区二区软件| 日韩一区二区三区影片| 色5月婷婷丁香| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久99热这里只有精品18| 久久影院123| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人aa在线观看| 亚洲人成网站在线播| 日韩视频在线欧美| 大陆偷拍与自拍| 最新中文字幕久久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 三级经典国产精品| 色哟哟·www| 国产 精品1| 日本一本二区三区精品| 91久久精品电影网| 久久久久久久午夜电影| 久久人人爽人人片av| 欧美97在线视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 深夜a级毛片| 丰满乱子伦码专区| 在线免费十八禁| 婷婷色av中文字幕| 国产在线男女| 亚洲自拍偷在线| 青青草视频在线视频观看| 国产 精品1| 国产欧美日韩精品一区二区| av网站免费在线观看视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 免费观看性生交大片5| 国产乱来视频区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 精品少妇久久久久久888优播| 日日啪夜夜爽| 永久免费av网站大全| 亚洲精品久久午夜乱码| 一级毛片aaaaaa免费看小| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲欧美清纯卡通| 又爽又黄a免费视频| 日日啪夜夜爽| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 青青草视频在线视频观看| 国精品久久久久久国模美| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 啦啦啦啦在线视频资源| 新久久久久国产一级毛片| 国产探花在线观看一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久久久久久久久久免费av| 白带黄色成豆腐渣| 国产免费福利视频在线观看| 精品久久久久久电影网| 国产免费视频播放在线视频| 别揉我奶头 嗯啊视频| 黄色一级大片看看| 黄片wwwwww| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩一区二区三区影片| 在线精品无人区一区二区三 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 老司机影院毛片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 97热精品久久久久久| 高清毛片免费看| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲怡红院男人天堂| 一区二区三区四区激情视频| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲人成网站在线播| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品久久久久久久电影| 最近最新中文字幕免费大全7| 午夜老司机福利剧场| 国产69精品久久久久777片| 亚洲国产精品999| 只有这里有精品99| 91久久精品国产一区二区三区| 下体分泌物呈黄色| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲精品自拍成人| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品蜜桃在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 干丝袜人妻中文字幕| av福利片在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 深夜a级毛片| av卡一久久| 九九爱精品视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产黄频视频在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 免费少妇av软件| 日韩欧美 国产精品| 久久久精品欧美日韩精品| 女人被狂操c到高潮| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 如何舔出高潮| 国产探花极品一区二区| 亚洲av男天堂| 亚洲成人一二三区av| 三级经典国产精品| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品99久久99久久久不卡 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 看十八女毛片水多多多| 丰满人妻一区二区三区视频av| 高清欧美精品videossex| 国产成人精品福利久久| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美bdsm另类| 国产精品伦人一区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 午夜福利视频1000在线观看| 九九在线视频观看精品| 91久久精品国产一区二区成人| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久久国产a免费观看| 久久久a久久爽久久v久久| 日韩伦理黄色片| 少妇熟女欧美另类| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产在视频线精品| av天堂中文字幕网| 色播亚洲综合网| 国产成人一区二区在线| 麻豆国产97在线/欧美| 又爽又黄a免费视频| 看非洲黑人一级黄片| 久久99热6这里只有精品| 男的添女的下面高潮视频| 午夜老司机福利剧场| 国产毛片a区久久久久| 18禁在线播放成人免费| av在线亚洲专区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 观看免费一级毛片| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久99精品国语久久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 人体艺术视频欧美日本| 嫩草影院新地址| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲欧美精品专区久久| 高清欧美精品videossex| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 视频区图区小说| 国产片特级美女逼逼视频| 免费av不卡在线播放| 丰满乱子伦码专区| 亚洲不卡免费看| 三级国产精品欧美在线观看| 免费观看性生交大片5| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成人免费观看视频高清| 大码成人一级视频| 晚上一个人看的免费电影| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产日韩欧美在线精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久久网色| 三级经典国产精品| 国产成人精品婷婷| 热re99久久精品国产66热6| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久久久伊人网av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲国产日韩一区二区| 日韩av免费高清视频| 国产中年淑女户外野战色| 精品酒店卫生间| 在线观看三级黄色| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 美女xxoo啪啪120秒动态图| 夜夜爽夜夜爽视频| 日韩三级伦理在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 日本熟妇午夜| 欧美精品国产亚洲| 色婷婷久久久亚洲欧美| 搞女人的毛片| 黑人高潮一二区| 性色av一级| 久久女婷五月综合色啪小说 | 欧美另类一区| 中文字幕制服av| 日韩中字成人| 乱系列少妇在线播放| 国产高潮美女av| 精品一区二区三区视频在线| 免费观看av网站的网址| 大香蕉97超碰在线| 永久网站在线| 国产精品嫩草影院av在线观看| av福利片在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产黄频视频在线观看| 国产一级毛片在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 男人狂女人下面高潮的视频| av免费观看日本| 欧美成人精品欧美一级黄| 免费观看a级毛片全部| 嘟嘟电影网在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产乱来视频区| 亚洲精品,欧美精品| 国产乱来视频区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲精品第二区| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧美3d第一页| 最新中文字幕久久久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 草草在线视频免费看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产精品一及| 联通29元200g的流量卡| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美一区二区亚洲| 大香蕉久久网| 一区二区三区乱码不卡18| 国产精品久久久久久久电影| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品久久久久久精品古装| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产中年淑女户外野战色| 国产极品天堂在线| 国产v大片淫在线免费观看| 久久精品国产自在天天线| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产成人91sexporn| 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩三级伦理在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 青青草视频在线视频观看| 免费看光身美女| 国产免费视频播放在线视频| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品一区www在线观看| 男人舔奶头视频| 久久久久性生活片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 性色av一级| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产爽快片一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 五月玫瑰六月丁香| 日韩欧美一区视频在线观看 | 九色成人免费人妻av| 一级爰片在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 久久精品国产亚洲网站| 国产成人freesex在线| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 在线播放无遮挡| 国产精品三级大全| 免费少妇av软件| 国产精品一及| 九九爱精品视频在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 日韩免费高清中文字幕av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久99热这里只频精品6学生| tube8黄色片| av国产免费在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 在线播放无遮挡| av又黄又爽大尺度在线免费看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美日韩精品成人综合77777| 日本黄色片子视频| 国产精品福利在线免费观看| 少妇 在线观看| 亚洲精品自拍成人| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 男女啪啪激烈高潮av片| 男男h啪啪无遮挡| 黄色配什么色好看| 久久99热这里只频精品6学生| 色5月婷婷丁香| 日韩强制内射视频| 精品久久久噜噜| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 高清毛片免费看| 亚洲国产av新网站| 中文字幕免费在线视频6| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日韩亚洲欧美综合| 白带黄色成豆腐渣| 久久综合国产亚洲精品| 成人综合一区亚洲| 精品久久久久久久久亚洲| 99热全是精品| 久久久亚洲精品成人影院| 水蜜桃什么品种好| 国产老妇女一区| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产毛片在线视频| 色哟哟·www| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 成人黄色视频免费在线看| 51国产日韩欧美| 免费观看av网站的网址| videossex国产| 五月开心婷婷网| 亚洲色图综合在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品三级大全| 午夜免费观看性视频| 大片电影免费在线观看免费| 在线观看一区二区三区激情| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲人成网站在线播| 深夜a级毛片| 三级国产精品片| 国产极品天堂在线| 成年人午夜在线观看视频| 国产免费福利视频在线观看| 插阴视频在线观看视频| av在线亚洲专区| 18禁在线播放成人免费| 91狼人影院| 国产av国产精品国产| 伊人久久精品亚洲午夜| 有码 亚洲区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 69av精品久久久久久| 亚洲av日韩在线播放| 欧美丝袜亚洲另类| 久久99热这里只有精品18| 精品久久久噜噜| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产成人精品福利久久| av女优亚洲男人天堂| 街头女战士在线观看网站| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲av免费在线观看| 亚洲国产精品999| 免费观看无遮挡的男女| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品蜜桃在线观看| 久久久国产一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 我要看日韩黄色一级片| 99久久九九国产精品国产免费| 久久午夜福利片| 亚洲精品亚洲一区二区| 麻豆乱淫一区二区| 久久精品国产自在天天线| 国产成人a区在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产高清不卡午夜福利| 久久久久性生活片| 一级毛片 在线播放| 人人妻人人看人人澡| 久久午夜福利片| freevideosex欧美| av在线app专区| 国产精品精品国产色婷婷| 夫妻性生交免费视频一级片| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 超碰av人人做人人爽久久| 免费观看在线日韩| 美女视频免费永久观看网站| 免费av毛片视频| 日韩成人伦理影院| 高清欧美精品videossex| 国产精品无大码| 天堂网av新在线| av在线播放精品| 久久久久久九九精品二区国产| 成年av动漫网址| 成人特级av手机在线观看| .国产精品久久| 97精品久久久久久久久久精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 午夜视频国产福利| 嫩草影院入口| av在线观看视频网站免费| 免费黄频网站在线观看国产| 免费大片18禁| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲精品国产av蜜桃| 夫妻午夜视频| 欧美日韩综合久久久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 人妻 亚洲 视频| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品成人在线| 欧美97在线视频| 91精品伊人久久大香线蕉| freevideosex欧美| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品女同一区二区软件| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲精品国产色婷婷电影| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲人成网站在线播| av一本久久久久| 日本免费在线观看一区| 国产精品伦人一区二区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 校园人妻丝袜中文字幕| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲图色成人| 欧美一区二区亚洲| 成人毛片60女人毛片免费| 日本三级黄在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲av日韩在线播放| 欧美成人午夜免费资源| 成人漫画全彩无遮挡| 日本黄大片高清| 亚洲不卡免费看| 欧美一区二区亚洲| 边亲边吃奶的免费视频| 18禁动态无遮挡网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费观看av网站的网址| 久久久久久久国产电影| av一本久久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲人成网站在线播| 成人漫画全彩无遮挡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲国产精品国产精品| 黄色怎么调成土黄色| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线观看一区二区三区激情| 一个人观看的视频www高清免费观看| 中文天堂在线官网| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲,一卡二卡三卡|