海帶內(nèi)生真菌的分離鑒定及其抑制乙酰膽堿酯酶活性的發(fā)酵工藝優(yōu)化

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(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109;2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，浙江杭州 310018；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109)

海帶內(nèi)生真菌的分離鑒定及其抑制乙酰膽堿酯酶活性的發(fā)酵工藝優(yōu)化

田淑娟1,闕斐2，侯竹美3,李飛1,王鳳舞1,*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島266109;2.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系，浙江杭州310018；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島266109)

本文以青島海域的海帶為原料,對其進行內(nèi)生真菌的分離純化,共得到7株內(nèi)生真菌,采用改良Ellman法對其乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制活性進行篩選,并對其中一株活性最高內(nèi)生真菌ML-X進行形態(tài)學(xué)和18S rDNA 分子生物學(xué)鑒定,通過單因素實驗和正交實驗篩選出最適合該菌進行液體生長發(fā)酵的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明,分離獲得的菌株ML-X為白地霉屬,序列號為KY977411,與遺傳距離最近的Galactomycesgeotrichumstrain LMA-21株(JQ668739)同源性達99%。最佳發(fā)酵條件為:PS培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的初始pH6.0,接種量5%,裝瓶量150 mL/500 mL,培養(yǎng)溫度31 ℃,發(fā)酵8 d,當(dāng)發(fā)酵液粗浸膏為5 mg/mL時,對乙酰膽堿酯酶的抑制率可達28.91%±0.25%。

內(nèi)生真菌,鑒定,乙酰膽堿酯酶,抑制活性，條件優(yōu)化

Abstract:In this study,Laminariajaponicafrom Qingdao sea area was used to isolate and purify endophytic fungus. A total of seven strains of endophytic fungi were isolated. Using modified Ellman method to determine the inhibitory rate of AChE and active strains were identified. Strain ML-X showed the highest AChE inhibitory activity and was identified,by physiological-biochemical characteristics and molecular biological techniques of 18S rDNA sequencing. Based on single factor and orthogonal test,the culture conditions of liquid fermentation of the endophytic fungi were screened out. The results showed that the strain ML-X was confirmed asGeotrichumcandidum,and the optimal fermentation conditions were as follows:PS medium was the suitable medium for the strain at pH6.0,incubated with 5% inoculum and 150 mL/500 mL culture volume at 31 ℃ for 8 days. Under these conditions,the strain ML-X exhibited a higher AChE inhibitory activity,the inhibition ratio of AchE was 28.91%±0.25% when the concentration of crude extract from fermentation broth was 5 mg/mL.

Keywords:endophytic fungi;strain identification;acetylcholinesterase;inhibitory activity;conditions optimization

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種常見的老年性腦神經(jīng)退行性病變,已成為現(xiàn)代社會嚴(yán)重威脅老年人生命的疾病之一[1]。關(guān)于AD的病理較為接受的為“膽堿能缺失學(xué)說”,認(rèn)為大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿的缺失是導(dǎo)致AD的關(guān)鍵原因[2],造成乙酰膽堿缺失的因素可能是β-淀粉樣斑塊內(nèi)及周圍的乙酰膽堿酯酶(AChE)活性增加,激活了其細(xì)胞毒性,或者是AChE糖基化異常及其各分子型表達水平的變化[3-4]。目前臨床治療主要是采用乙酰膽堿酯酶抑制劑,如他克林、加蘭他敏、石杉堿甲等,這些藥物可以提高患者體內(nèi)的乙酰膽堿的水平,具有一定的療效,但是化學(xué)藥物副作用比較明顯,不利于患者長期服用[5]。因此科學(xué)家們將研究的方向轉(zhuǎn)向了特境微生物次生代謝產(chǎn)物。

特境微生物作為新的藥物來源已經(jīng)顯示出巨大的開發(fā)潛力。作為一種特境微生物,植物內(nèi)生菌是指寄生于宿主體內(nèi)并且不引起宿主致病癥狀的一類微生物,在與宿主長期共進化的過程中進行“基因重組”,既有可能產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性成分,也有可能產(chǎn)生與宿主完全不同的活性成分[6-8]。

海帶(Laminariajaponica)是一種大型海生褐藻植物,在我國海域分布非常廣泛。海帶不僅能防止肥胖、膽結(jié)石、便秘、腸胃炎等代謝性疾病,還具有防癌抗癌、降血壓、降血糖、預(yù)防動脈硬化和血栓形成、排出體內(nèi)鉛毒等功效,素有“長壽菜”的美譽。而與海帶共生并可以產(chǎn)生如抗生素、毒素等物質(zhì)以利于海帶生長代謝或增強海帶的抵御能力的內(nèi)生真菌必然會產(chǎn)生可加以利用的功能活性成分。因此,本論文基于內(nèi)共生理論,從海帶內(nèi)生菌中尋找抗老年癡呆活性成分,發(fā)現(xiàn)活性成分的可能性極大。目前國內(nèi)外關(guān)于海帶內(nèi)生菌的研究報道僅見于海帶內(nèi)生菌DNN6蛋白對小黃魚的保鮮效果[9-10],DNN7蛋白的分離及抗腫瘤研究[11]以及HSN2胞外蛋白對粉紅單端孢霉的影響[12],未發(fā)現(xiàn)關(guān)于海帶內(nèi)生菌的抗老年癡呆相關(guān)活性報道。因此本文從青島海域海帶中分離純化出內(nèi)生菌,并對菌株進行體外AChE抑制活性的篩選,對活性菌株進行鑒定和發(fā)酵條件的優(yōu)化,以期獲得更多高活性的次生代謝產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶 采自青島海域,新鮮的海帶;Na2HPO4、NaH2PO4、二甲基亞砜(DMSO)、十二烷基磺酸鈉 均購自萊陽康德化工有限公司,分析純;乙酰膽堿酯酶(優(yōu)級純) 北京索萊寶科技有限公司;乙酰膽堿碘代物AchI、3,5-二硫二硝基苯甲酸(DTNB) 購自北京博奧拓達科技有限公司,分析純;他克林 Sigma公司;SK8229真菌基因組DNA快速抽提試劑盒 上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒 Omega 公司。

DU-800紫外/可見分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司;SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;DPH-9032電熱恒溫培養(yǎng)箱 龍口市先科儀器公司;YXQ-LSS全自動電熱壓力蒸汽滅鍋 上海博訊實業(yè)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;ISRDH1恒溫振蕩器 蘇州麥可旺志生物技術(shù)有限公司;電子分析天平 美國奧豪斯電子天平公司;移液槍 法國GILSON公司。

1.2 培養(yǎng)基

WA抗生素培養(yǎng)基(水+瓊脂+青霉素+鏈霉素),種子液培養(yǎng)基(PD),改良察氏培養(yǎng)基(CzapeK’s),馬鈴薯葡萄糖PD培養(yǎng)基,馬鈴薯蔗糖PS培養(yǎng)基,以上培養(yǎng)基配方見參考文獻[5]。

SP培養(yǎng)基:2%蔗糖,0.3% KH2PO4,0.15% MgSO4·7H2O,0.0005%維生素B1,土豆浸出液,蒸餾水溶解,分裝滅菌。

SP′培養(yǎng)基:2%蔗糖,0.3% KH2PO4,0.15% MgSO4·7H2O,0.0005%維生素B1,土豆浸出液,海水溶解,分裝滅菌。

1.3 實驗方法

1.3.1 海帶內(nèi)生菌的分離和純化 取海帶樣品,用自來水沖洗干凈表面的泥沙,將其順次置于75%的乙醇溶液、1%的NaClO溶液和75%的乙醇溶液進行表面消毒3、5和1 min,然后用無菌水沖洗2次,用消毒的手術(shù)剪和手術(shù)刀將其分割成1 cm×1 cm的小塊,將處理好的樣品置于加有青霉素和鏈霉素的WA培養(yǎng)基上,于28 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待平板中長出菌體時,采用菌絲尖端切割法對其進行分離純化;將獲得的純培養(yǎng)物置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹4]。

對照實驗:沖洗干凈的海帶樣品片段,按照上述步驟進行表面消毒,但不進行切割,完整置于分離培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)。對照如無真菌生長,說明表面消毒徹底。

1.3.2 液體發(fā)酵培養(yǎng) 將分離得到的菌株在無菌的條件下接種到PD液體培養(yǎng)基中,于28 ℃,140 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d,作為種子液。然后將其接種到SP培養(yǎng)基中,接種量為10%、培養(yǎng)溫度為28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)10 d。

1.3.3 發(fā)酵液浸提及乙酰膽堿酯酶抑制活性的測定 發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵液于離心機10000 r/min離心8～10 min,取上清液,用乙酸乙酯萃取3次,合并萃取相,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得浸提物。將浸提物用二甲基亞砜(DMSO)溶解,配制成濃度為5 mg/mL的溶液。AChE活性抑制率的測定參照改良過的Ellman法[13]。

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 參考《真菌鑒定手冊》對該真菌菌株進行形態(tài)學(xué)鑒定,主要觀察該真菌菌落的形狀、顏色、大小、質(zhì)地、表面光澤、是否隆起等[14]。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

1.4.2.1 真菌基因組DNA的提取 采用改良的CTAB[15]法對真菌的基因組DNA進行提取:取200 mg菌體,加液氮研磨3～4次,迅速用藥匙轉(zhuǎn)入裝有3 mL 3% CTAB提取緩沖液的5 mL離心管中(65 ℃預(yù)熱),65 ℃水浴45 min,并不時輕輕轉(zhuǎn)動離心管,室溫4000 r/min離心20 min;取上清液轉(zhuǎn)入新離心管中,加入4 μL 10 mg/L蛋白酶K,37 ℃水浴1 h;加入800 μL Tris飽和酚,搖勻,12000 r/min離心10 min取上清,加入等體積氯仿/異戊醇,搖勻,12000 r/min離心10 min;取上清,加入2 μL 10 mg/L核糖核酸酶RNase溶液,37 ℃水浴1 h,加入800 μL氯仿/異戊醇,搖勻,12000 r/min離心10 min;取上清,加入2倍體積的乙醇或0.7倍體積的異丙醇(-20 ℃預(yù)冷),-20 ℃沉淀30 min,12000 r/min離心15 min,回收DNA沉淀;棄上清取沉淀,用70%乙醇清洗兩次,超凈工作臺中吹干,將收集得到的DNA溶于滅菌超純水或者0.1×Tris-EDTA緩沖液(TE)中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2.2 18S rDNA的擴增 PCR反應(yīng)體系的建立:DNA模版2 μL,正、反向引物各10 pmol,dTNP 1 μL,Taq DNA聚合酶5 U,10×PCR buffer 5 μL,ddH2O補足至50 μL。

PCR程序的設(shè)定：98 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性35 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸40 s,共進行30個循環(huán);72 ℃修復(fù)延伸8 min,回收產(chǎn)物。

PCR產(chǎn)物檢測:用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,確定為單一條帶后,切下DNA目的條帶送往上海生工進行測序。

1.4.2.3 基于18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將測序得到的DNA序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫,通過BLAST與已有的序列進行比對,從而確定菌株的種屬。同時,利用MEGA 6軟件將與菌株序列相關(guān)性最高的菌株序列進行類比,并構(gòu)建其系統(tǒng)進化樹。

1.5 海帶內(nèi)生真菌發(fā)酵流程

接種針挑取小塊菌株→轉(zhuǎn)接至500 mL錐形瓶(150 mL培養(yǎng)基)→搖床發(fā)酵3 d(28 ℃)→轉(zhuǎn)到1 L的錐形瓶(400 mL培養(yǎng)基)繼續(xù)搖床發(fā)酵10 d→過濾→乙酸乙酯萃取發(fā)酵液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得粗浸膏。

1.6 單因素實驗

1.6.1 培養(yǎng)基的篩選 分別選取CzapeK’s培養(yǎng)基、PD培養(yǎng)基、SP培養(yǎng)基、PS培養(yǎng)基、SP′培養(yǎng)基作為該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基。其他條件:接種量為10%,培養(yǎng)溫度為28 ℃,500 mL三角瓶裝液量為150 mL,發(fā)酵時間為10 d,每組實驗設(shè)定3個平行實驗。采用1.3.3中的方法測定AChE抑制率。

1.6.2 溫度的篩選 以PS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度分別為22、25、28、31、34 ℃,500 mL三角瓶裝液量為150 mL,接種量為10%,發(fā)酵時間為10 d,每組設(shè)定3個平行實驗,采用1.3.3中的方法測定AChE抑制率。

1.6.3 初始pH的篩選 以PS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,將培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,培養(yǎng)溫度為28 ℃,500 mL三角瓶裝液量為150 mL,接種量為10%,發(fā)酵時間為10 d,每組實驗設(shè)定3個平行,采用1.3.3中的方法測定AChE抑制率。

1.6.4 接種量的篩選 以PS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,pH為6.0,培養(yǎng)溫度為28 ℃,500 mL三角瓶裝液量為150 mL,接種量分別為1%、5%、10%、15%和20%,發(fā)酵時間為10 d,每組設(shè)定3個平行實驗,采用1.3.3中的方法測定AChE抑制率。

1.6.5 發(fā)酵時間的篩選 以PS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度為28 ℃,pH為6.0,500 mL三角瓶裝液量為150 mL,接種量為10%,發(fā)酵時間分別為6、8、10、12、14 d,每組設(shè)定3個平行實驗,采用1.3.3中的方法測定AChE抑制率。

1.6.6 裝液量的篩選 以PS培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度為28 ℃,接種量為10%,培養(yǎng)基初始pH為6.0,500 mL三角瓶裝液量分別為50、100、150、200 mL和250 mL,發(fā)酵時間為10 d,每組設(shè)定3個平行實驗,采用1.3.3中的方法測定AChE抑制率。

1.7 正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇接種量、溫度、初始pH和時間四個因素進行四因素三水平的正交實驗,因素水平見表1。

表1 菌株發(fā)酵條件正交因素水平Table 1 Factors and levels of fermentation conditions of orthogonal

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個處理重復(fù)三次,采用正交助手軟件對四個單因素進行分析,并采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)的顯著性分析,應(yīng)用GraphPad Prism 4.0軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶內(nèi)生菌的分離純化

從海帶中共分離得到7株內(nèi)生真菌,并對分離得到的菌株進行了體外抑制AChE活性的篩選。結(jié)果顯示:菌株ML-X發(fā)酵液萃取的乙酸乙酯相AChE抑制率達25%以上,其他6株菌株發(fā)酵液乙酸乙酯萃取相的AChE抑制率均低于10%(表2),因此,本實驗選擇真菌菌株ML-X進行進一步的研究。

表2 7株菌的AChE抑制率Table 2 The inhibition ratio of AChE of 7 strains

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株ML-X為絲狀白色真菌,生長快速。菌絲為有橫隔的真菌絲,有的分支。在PDA培養(yǎng)基平板中,該菌落呈平面擴散,生長快,扁平且規(guī)則,不透明白色,短絨狀或近于粉狀(圖1)。

圖1 菌株的培養(yǎng)形態(tài)Fig.1 Morphogenesis of strains

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

圖3 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains

2.2.2.1 PCR擴增結(jié)果 通過圖2可以看出,菌株的PCR產(chǎn)物的片段長度在1000～3000 bp之間。電泳圖示條帶清晰,沒有雜質(zhì),可用于菌株18S rDNA的分析。

圖2 菌株P(guān)CR凝膠電泳圖Fig.2 PCR gel electrophoresis of strain注:1-樣品,M-mark。

2.2.2.2 菌株的18S rDNA基因序列 將菌株ML-X的18S rDNA(1401bp)基因序列提交到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫,獲得序列號KY977411。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast同源比對,序列比對采用Clustal X軟件,MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹采用鄰連接法,系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建進行重復(fù)設(shè)定為1000次的自檢(Bootstrap)。菌株ML-X,利用18S rDNA建立的系統(tǒng)進化樹見圖3。結(jié)果表明分離的菌株ML-X為白地霉屬,與遺傳距離最近的Galactomycesgeotrichumstrain LMA-21株(JQ668739)同源性達99%。

2.3 菌株ML-X液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基的確定 本實驗研究了5種發(fā)酵培養(yǎng)基對該海帶內(nèi)生菌株次生代謝產(chǎn)物乙酸乙酯萃取的浸提物AChE抑制率的影響,由圖4可知,采用5種發(fā)酵培養(yǎng)基所獲得的次生代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯相對AChE抑制率有著很明顯的差異。其中采用PS培養(yǎng)基的生長代謝產(chǎn)物的浸提物對AChE抑制率最高,達到了28.9%,其對AChE抑制率顯著大于SP、SP′和CzapeK’s(p<0.05),而與PD培養(yǎng)基中的菌株生長代謝產(chǎn)物的浸提物對AChE的抑制率差異不顯著(p>0.05)。SP培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基中的菌株生長代謝產(chǎn)物的浸提物對AChE的抑制率都比較低。因此,根據(jù)以上數(shù)據(jù)可知PS培養(yǎng)基是最適合該海帶內(nèi)生真菌菌株的生長和產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基,說明該菌株利用蔗糖比其他的碳源生長的更好。

圖4 不同培養(yǎng)基對菌株代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響Fig.4 Effect of different media on AChE inhibition rate of metabolic products注:不同字母代表不同培養(yǎng)基之間存在顯著性差異(p<0.05)。圖5～圖9同。

圖5 溫度對菌株代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響Fig.5 Effects of temperatures on AChE inhibition rate of metabolic products

2.3.2 溫度的確定 從圖5中的數(shù)據(jù)可以看出隨著培養(yǎng)溫度的升高浸提物對AChE的抑制率也不斷上升,從22 ℃開始到28 ℃時,AChE的抑制率不斷升高,而且升高的幅度比較大。當(dāng)培養(yǎng)溫度達到28 ℃左右時,菌株生長代謝產(chǎn)物的浸提物對AChE的抑制率達到最高,且與其他幾個溫度下AChE的抑制率存在顯著性差異(p<0.05)。當(dāng)培養(yǎng)溫度從28 ℃繼續(xù)升高時,菌株生長代謝產(chǎn)物的浸提物對AChE的抑制率開始下降但是下降幅度不大。說明28 ℃最適合該菌株分泌和合成具有抑制AChE活性的次生代謝產(chǎn)物。

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH的確定 培養(yǎng)基的初始pH對于菌株的生長代謝會產(chǎn)生直接的影響,合適的初始pH會使菌株快速生長。在圖6的曲線中可以看出初始pH對于菌株代謝產(chǎn)物浸提物AChE的抑制率影響比較大。在培養(yǎng)基初始pH=4時,AChE的抑制率比較低,隨著培養(yǎng)基的初始pH的不斷升高,AChE的抑制率開始不斷升高,最后在培養(yǎng)基初始pH=6左右時,AChE的抑制率達到最高值,且與其他pH下AChE的抑制率存在顯著性差異(p<0.05)。在pH=6之后,隨著培養(yǎng)基初始pH的不斷升高,AChE的抑制率開始下降,這說明過酸或者過堿的培養(yǎng)環(huán)境都會對菌株的生長代謝浸提物產(chǎn)生抑制。而pH=5時AChE的抑制率與pH=8時AChE的抑制率差異不顯著(p>0.05)。

圖6 初始pH對菌株代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響Fig.6 Effect of initial pH on AChE inhibition rate of metabolic products

2.3.4 適宜接種量的確定 由圖7可以看出當(dāng)接種量處于1%到10%區(qū)間時,隨著接種量的增加,該菌株的生長代謝產(chǎn)物的浸提物對AChE的抑制率隨之增強。當(dāng)接種量達到10%時,AChE的抑制率達到最高,為23%±0.45%,且與其他幾個接種量下AChE的抑制率存在顯著性差異(p<0.05)。從10%接種量后隨著接種量的繼續(xù)增加,菌株發(fā)酵液產(chǎn)生的乙酸乙酯對AChE的抑制率出現(xiàn)下降趨勢,可能因為接種量過大,導(dǎo)致菌絲體在發(fā)酵前期生長過于旺盛,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被大量的消耗,致使后期的生長空間和資源相對匱乏,進而影響到菌株發(fā)酵后期生長代謝產(chǎn)物的形成和分泌。

圖7 接種量對菌株代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響Fig.7 Effect of inoculation on AChE inhibition rate of metabolic products

2.3.5 適宜發(fā)酵時間的確定 在菌株的液體發(fā)酵過程中,生長分為不同的階段,因此其次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的時間會有所不同。由圖8可以看出,在發(fā)酵初期,隨著發(fā)酵時間的延長,菌株具有抑制AChE活性的代謝產(chǎn)物逐漸增多。第10 d時,代謝產(chǎn)物量達到最大值,此時AChE的抑制率為25.6%±1.35%,且與其他發(fā)酵時間下AChE的抑制率存在顯著差異(p<0.05)。此后,隨著發(fā)酵時間的延長,菌株次生代謝產(chǎn)物對AChE的抑制率開始明顯下降,而14 d與6 d的AChE抑制率差異不顯著(p>0.05)。這主要是因為在發(fā)酵初期菌絲體以初級代謝為主,次生代謝為輔,在初期進行大量的生長繁殖,產(chǎn)生少量次生代謝產(chǎn)物并且沒有及時排出到胞外;到了發(fā)酵的中后期是以次級代謝為主,產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物并且排到胞外;到了后期,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗殆盡,有一部分菌絲體發(fā)生自溶,并且培養(yǎng)基的粘度增大,影響了氧氣傳遞速率,從而影響到次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生或者次生代謝的途徑[5,16]。

圖8 發(fā)酵時間對菌株次生代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響Fig.8 Effect of time on ACh inhibition rate of metabolic products

圖9 裝液量對菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物AChE抑制率的影響Fig.9 Effect of liquid volume on AChE inhibition rate of metabolic products

2.3.6 適宜裝液量的確定 由圖9可以看出,隨著裝液量的增加,菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物AChE抑制率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。裝液量50～150 mL/500 mL時,代謝產(chǎn)物的浸提物對AChE的抑制率升高,但是差異不顯著。當(dāng)裝液量為150 mL/500 mL時,發(fā)酵液的提取物對AChE的抑制率達到最大值,與200、250 mL下AChE的抑制率存在顯著性差異(p<0.05)；裝液量150 mL以后,隨著裝液量的增加,AChE的抑制率開始下降,而且下降幅度比上升幅度大,這說明該菌株的發(fā)酵為需氧型發(fā)酵,但在本實驗范圍內(nèi),裝液量不會影響菌株的正常發(fā)酵。

2.3.7 正交實驗結(jié)果 結(jié)果見表2。由K值可得最優(yōu)組合為A2B3C1D1,即培養(yǎng)基的初始pH=6,培養(yǎng)溫度為31 ℃,接種量為5%,發(fā)酵時間為8 d。3次驗證實驗表明,在該發(fā)酵條件下菌株發(fā)酵次級代謝產(chǎn)物浸提物對AChE的抑制率可達28.91%±0.25%。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

3 結(jié)論

從海帶里共分離純化出7株內(nèi)生真菌,其中菌株ML-X發(fā)酵液的乙酸乙酯相對AChE的抑制率較高,被選作進一步的研究對象。結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定,可確定菌株ML-X為白地霉屬。通過正交實驗確定海帶內(nèi)生菌ML-X液體發(fā)酵的最佳條件:PS培養(yǎng)基、接種量5%、裝液量為150 mL/500 mL、培養(yǎng)基初始pH為6.0,在31 ℃,培養(yǎng)8 d。在上述條件下,該菌株發(fā)酵液乙酸乙酯相的AChE抑制率達到28.91%±0.25%。

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Isolation,identificationandfermentationprocessoptimizationofacetylcholinesteraseinhibitoryactivityofendophyticfungusfromLaminariajaponica

TIANShu-juan1,QUEFei2,HOUZhu-mei3,LIFei1,WANGFeng-wu1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China;2.The Department of Applied Technology, Zhejiang Economic & Trade Polytechnic, Hangzhou 310018,China;3.College of Marine Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

TS201.3

A

1002-0306(2017)18-0111-06

2017-03-20

田淑娟(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物分離，E-mail:376211311@qq.com。

*通訊作者:王鳳舞(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物分離，E-mail:wangfengwude@126.com。

山東省自然科學(xué)基金面上項目(ZR2015BM016)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.022