抑菌活性乳酸菌的篩選及其抑菌物質(zhì)的提取條件優(yōu)化

,,

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

抑菌活性乳酸菌的篩選及其抑菌物質(zhì)的提取條件優(yōu)化

雙全,折米娜,薄禮娟

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

從內(nèi)蒙古東部地區(qū)發(fā)酵酸菜中分離的乳酸菌為供試菌株,以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌進(jìn)行了抑菌活性篩選,并檢測其抑菌譜。通過單因素和L9(34)正交實(shí)驗(yàn)確定抑菌活性物質(zhì)的最佳提取條件,并應(yīng)用于市售牛飼料中檢測其抑菌效果。結(jié)果表明,在發(fā)酵酸菜中分離的14株供試乳酸菌中獲得了1株抑菌活性較強(qiáng)且穩(wěn)定的菌株S1-4,該菌株對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別達(dá)(19.69±0.71) mm和(20.59±0.26) mm,并呈現(xiàn)出較廣的抑菌譜。菌株S1-4產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的最佳提取條件:沉淀pH為5.0,乙醇濃度95%,沉淀時間8 h,料液比為1∶4 (v∶v),在此條件下,抑菌圈直徑為39.53 mm,提高了23.18%。菌株S1-4發(fā)酵液添加到牛飼料中,可抑制飼料中細(xì)菌和霉菌的生長,并且隨添加量的增加,抑菌效果明顯增加。

乳酸菌,抑菌活性,抑菌物質(zhì),提取,飼料

Abstract:Screening on lactic acid bacteria with antibacterial activity,isolated from fermented pickle in eastern Inner Mongolia,was tested forEscherichiacoliandStaphylococcusaureusas the indicator,and its antibacterial spectrum was tested. The optimum separation conditions of antibacterial substances were determined by single factor and L9(34)orthogonal test,and detected antibacterial effect in commercial cattle feed. The result showed that the strain S1-4 had strong and stable antibacterial activity in 14 strains of lactic acid bacteria,and the diameter of inhibition zone of strain S1-4 toEscherichiacoliandStaphylococcusaureuswas(19.69±0.71) mm and(20.59±0.26) mm,respectively,and showed broad antimicrobial spectrum. The optimal extraction conditions for the antibacterial substances from strain S1-4 were as follows:the precipitation of pH was 5,the concentration of ethanol was 95%,the settling time was 8 h,and the ratio of material to liquid was 1∶4 (v∶v). In these conditions,the diameter of the inhibition zone was 39.53 mm,and increased by 23.18%. The fermentation broth of strain S1-4 was added to the cattle feed,which could inhibit the growth of bacteria and mould in feed,and with the increase of the dosage,the inhibitory effect increased obviously.

Keywords:lactic acid bacteria;antibacterial activity;antimicrobial substances;extract;feed

乳酸菌是動物胃腸道的益生菌群,代謝可產(chǎn)生細(xì)菌素、有機(jī)酸、雙乙酰、過氧化氫等多種天然抑菌活性物質(zhì)[1-2]。這些抑菌物質(zhì)不但不會破壞食品的風(fēng)味和口味,而且可以抑制病原菌和腐敗菌的生長,延長保質(zhì)期和貨架期。其中,起主要作用的是乳酸菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素,具有一定的熱穩(wěn)定性,易被人體消化道的部分蛋白酶分解,而且不能在人和動物的體內(nèi)蓄積引發(fā)不良發(fā)應(yīng),能有效抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生長[3],被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然飼料添加劑和食品防腐劑[4]。

因乳酸菌細(xì)菌素是具有蛋白質(zhì)特性的一種蛋白質(zhì)類或是小分子的多肽類物質(zhì)。所以,可以采用分離蛋白質(zhì)方法對細(xì)菌素進(jìn)行提取分離[5]。常用的方法有:有機(jī)溶劑沉淀法、鹽析法、選擇性沉淀法[6-8]和pH吸附釋放法[9]。一般還可以采用硫酸銨逐級鹽析法[10],從而達(dá)到更好的分離效果。Enterocin P[11]、Bacteriocin L23[12]和Lacticin NK34[13]等細(xì)菌素都是以硫酸銨沉淀開始,最后得到成分較為均一的細(xì)菌素純品。李亞玲等[14]利用pH吸附方法對乳酸片球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素進(jìn)行了分離純化。Janes等[15]比較用吸附劑稻殼灰(RHA)和硅酸(SA)吸附包括nisin、leucocinBC2等細(xì)菌素的效果。

在國內(nèi)外關(guān)于細(xì)菌素特性研究的報道較多[16-19],但關(guān)于細(xì)菌素及其在飼料貯藏中的具體應(yīng)用研究實(shí)例報道較少見。陳秀金[20]等從自制酸奶、市售散裝腌菜和袋裝榨菜中分離篩選出5株具有較高抑菌活性的乳酸菌菌株,劉陽[21]等以泡菜為原材料,經(jīng)稀釋涂布平板法分離、平板劃線法純化、牛津杯法篩選得到4株有較好抑菌性能的乳酸菌。本文從內(nèi)蒙古東部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的乳酸菌為供試菌,篩選出具有抑菌活性的乳酸菌,并通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳提取條件。再探討該菌株在牛飼料貯藏中的抑菌效果,為今后天然防腐劑的開發(fā)拓寬思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株:14株乳酸菌 分離自內(nèi)蒙古東部地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜汁中[21];指示菌株:大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922,沙門氏菌(Salmonella)CMCC50115,鼠傷沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)NBRC12529,綠膿假單胞桿菌(Pesudomonasaeruginosa)NBRC3080,熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)CGMCC1.1802,腸沙門氏菌腸亞種(Salmonellaentericasubsp. enterica)CGMCC1.1859,枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HMO1,單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)54001,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)IID1677、IID3060,蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)AS1.1846,黑曲霉(Aspergillusniger),根霉(Rhizopus) 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存;牛飼料 采購于呼和浩特市蒙豐飼料有限責(zé)任公司,主要成分:秸稈生物飼料、食鹽、玉米粉、貝殼粉、麩皮、豆餅等;供試菌株培養(yǎng)基:脫脂乳培養(yǎng)基[22]、MRS液體培養(yǎng)基[23];指示菌培養(yǎng)基:LB液體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基[24];抑菌活性檢測培養(yǎng)基:水瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 配制方法見參考文獻(xiàn)[25]。

W-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺 蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司;HPS-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SX-500高壓滅菌鍋 德國Tomy公司;OHAUS EX623電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;PHS-25型數(shù)顯酸度計 杭州雷磁分析儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株發(fā)酵上清液及指示菌的制備 將各供試菌株按體積分?jǐn)?shù)2%接入MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃發(fā)酵24 h,離心(8000 r/min、10 min)取上清液,用0.22 μm微孔濾菌器過濾,得到菌株發(fā)酵上清液,4 ℃冷藏待用。

將作為指示菌的各細(xì)菌按體積分?jǐn)?shù)2%接種于LB肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)至二代,4 ℃冷藏待用。

將霉菌接種在PDA斜面培養(yǎng)基上,在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d后,加入一定量的無菌生理鹽水,刮取斜面上的孢子,振蕩,然后將含有霉菌孢子的無菌生理鹽水通過無菌紗布過濾以除去菌絲殘體,調(diào)節(jié)孢子懸液濃度在105孢子/mL左右,4 ℃冷藏待用[26]。

1.2.2 抑菌活性的測定 采用雙層瓊脂擴(kuò)散法[27],先以1%的無菌瓊脂水溶液在培養(yǎng)皿底層打底,待瓊脂凝固后均勻擺放牛津杯,再倒20 mL帶有指示菌的固體培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后取牛津杯,在其形成的孔內(nèi)加0.2 mL各供試菌發(fā)酵上清液,在37 ℃培養(yǎng)24 h后測其抑菌圈直徑。

1.2.3 菌株S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜 選用實(shí)驗(yàn)室保存的革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌及霉菌作為指示菌,采用雙層瓊脂擴(kuò)散法測定菌株S1-4對各指示菌的抑菌作用,以確定其抑菌譜。

1.2.4 菌株S1-4產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的提取 采用pH吸附釋放法、硫酸銨沉淀法、乙醇沉淀法,對菌株S1-4發(fā)酵所產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行提取。

1.2.4.1 pH吸附釋放法 參照乳酸菌細(xì)菌素分離粗提的文獻(xiàn)[28]方法,將吸附pH設(shè)定為5.0,解析pH設(shè)定為7.0。用NaOH(5 mol/L)溶液將菌株S1-4發(fā)酵液的pH調(diào)至為5.0,使細(xì)菌素吸附在菌體細(xì)胞上進(jìn)行吸附,離心收集菌體細(xì)胞(10 mL),用與吸附pH相同的磷酸鈉緩沖液洗細(xì)胞1～2次,重懸于20 mL的NaCl(0.1 mol/L)溶液中,用5%的磷酸調(diào)至pH為7.0,進(jìn)行振蕩解析,離心收集上清,用0.22 μm微孔濾菌器濾菌,分別收集解析液和沉淀物。

1.2.4.2 硫酸銨沉淀法 將菌株S1-4依照1.2.1中方法制備發(fā)酵上清液,緩慢加入硫酸銨細(xì)末于上清液中,使其達(dá)到60%的飽和度[29],置于4 ℃環(huán)境過夜,分別取離心上清液和沉淀物備用。

1.2.4.3 乙醇沉淀法 將菌株S1-4依照1.2.1中方法制備發(fā)酵上清液,將菌株發(fā)酵上清液在4 ℃下與料液比為1∶4的乙醇混合,沉淀4 h,離心取其上清液,沉淀物收集備用,上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉乙醇備用。

將以上三種方法所得上清液和沉淀物調(diào)pH至5.0,以大腸桿菌NBRC3301為指示菌,分別測定其抑菌圈直徑。

1.2.5 基于單因素實(shí)驗(yàn)的菌株S1-4產(chǎn)生抑菌物質(zhì)提取條件的優(yōu)化

1.2.5.1 不同沉淀pH對分離提取液抑菌活性的影響 采用乙醇沉淀法,將菌株S1-4發(fā)酵上清液pH分別調(diào)至4.0、5.0、4.5、5.0、5.5、6.0,以料液比為1∶4與95%乙醇于4 ℃環(huán)境下沉淀4 h,離心取其上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉乙醇,所得提取液以大腸桿菌NBRC3301作為指示菌,測量抑菌圈直徑,確定其抑菌能力。

1.2.5.2 不同乙醇濃度對分離提取液抑菌活性的影響 采用乙醇沉淀法,將菌株S1-4發(fā)酵上清液的pH調(diào)至5.0,以料液比為1∶4分別與濃度為20%、40%、60%、80%和95%的乙醇于4 ℃環(huán)境下沉淀4 h,離心取其上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉乙醇,所得提取液以大腸桿菌NBRC3301作為指示菌,測量抑菌圈直徑,確定其抑菌能力。

1.2.5.3 不同沉淀時間對分離提取液抑菌活性的影響 采用乙醇沉淀法,將菌株S1-4發(fā)酵上清液的pH調(diào)至5.0,以料液比為1∶4與95%的乙醇于4 ℃環(huán)境下沉淀2、4、6、8、10 h,離心取其上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉乙醇,所得提取液以大腸桿菌NBRC3301作為指示菌,測量抑菌圈直徑,確定其抑菌能力。

1.2.5.4 不同料液比對分離提取抑菌活性的影響 采用乙醇沉淀法,將菌株S1-4發(fā)酵上清液的pH調(diào)至5.0,與料液比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 (v∶v)的95%乙醇于4 ℃環(huán)境下沉淀4 h,離心取其上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉乙醇,所得提取液以大腸桿菌NBRC3301作為指示菌,測量抑菌圈直徑,確定其抑菌能力。

1.2.6 基于正交實(shí)驗(yàn)的菌株S1-4產(chǎn)生抑菌物質(zhì)提取條件的優(yōu)化 菌株S1-4的抑菌物質(zhì)活性以乙醇沉淀法為基礎(chǔ)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),通過對沉淀pH、乙醇濃度、料液比和沉淀時間進(jìn)行四因素三水平的L9(34)正交實(shí)驗(yàn),獲取最優(yōu)提取方法。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計Table 1 The factors and level of orthogonal experiment design

1.2.7 菌株S1-4在飼料中的應(yīng)用 將菌株S1-4發(fā)酵液按0%、2%、5%、7%和10%的比例添加到市售牛飼料中,對照組添加同體積MRS液體培養(yǎng)基,在室溫(18～25 ℃)條件下進(jìn)行貯藏,分別按GB13093-91《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定方法》和GB13092-91《飼料中霉菌檢驗(yàn)方法》測定各組飼料第0、3、7、14、21和30 d的細(xì)菌總數(shù)和霉菌總數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并作圖,應(yīng)用SPSS軟件對正交表進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的抑菌活性篩選

將14株乳酸菌作為供試菌株,以大腸桿菌NBRC3301和金黃色葡萄球菌IID1677為指示菌,初篩結(jié)果如表2所示。

表2 供試乳酸菌的抑菌活性篩選結(jié)果Table 2 Screening on antibacterial activity of lactic acid bacteria

注:-:抑菌圈直徑≤8 mm,表示沒有抑菌效果。

由表2可知,對大腸桿菌(Escherichiacoli)NBRC3301和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)IID1677指示菌均有抑菌活性的菌株有8株,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株S1-4發(fā)酵液的抑菌活性較強(qiáng)且穩(wěn)定,對指示菌的抑菌圈直徑分別達(dá)(19.69±0.71) mm和(20.59±0.26) mm。因此選擇S1-4作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)菌株。

2.2 菌株S1-4的抑菌譜

菌株S1-4的發(fā)酵液對各指示菌的抑菌能力,結(jié)果見表3。

由表3可知,空白實(shí)驗(yàn)組的MRS液體培養(yǎng)基抑菌圈直徑均小于8 mm,說明MRS液體培養(yǎng)基本身無抑菌作用。菌株S1-4發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)對所有供試指示菌的抑菌圈直徑均大于11 mm,不僅對枯草芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌有抑制作用,對大腸桿菌、沙門氏菌、鼠傷沙門氏菌、綠膿假單胞桿菌、熒光假單胞菌、腸沙門氏菌腸亞種等革蘭氏陰性菌及黑曲霉和根霉也有較明顯的抑菌效果。這與張艾青[30]等所研究的結(jié)果相接近。因此,認(rèn)為菌株S1-4發(fā)酵上清液中的抑菌活性物質(zhì)具有較廣的抑菌范圍,為將來的開發(fā)應(yīng)用提供了可能性。經(jīng)16S rDNA序列分析,菌株S1-4鑒定為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus,相似度99.7%)[19]。菌株S1-4發(fā)酵上清液中的抑菌活性物質(zhì)對大腸桿菌NBRC3301抑菌圈直徑最大,達(dá)(13.77±0.85) mm,故將大腸桿菌NBCR3011作為后期各項實(shí)驗(yàn)的指示菌。

2.3 菌株S1-4的抑菌活性物質(zhì)的提取

將三種提取方法所制得的上清液和沉淀溶解液進(jìn)行雙層瓊脂擴(kuò)散法抑菌實(shí)驗(yàn),其抑菌效果如表4所示。

表4 不同提取方法所得分離液的抑菌能力Table 4 Antibacterial ability of separation phase isolated by different extraction methods

表3 菌株S1-4的抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectra of strain S1-4

由表4可知,菌株S1-4的抑菌活性物質(zhì)經(jīng)pH吸附釋放法獲得的上清液與沉淀溶解物的抑菌圈直徑很小,可見此方法對該抑菌活性物質(zhì)的提取效果不好。硫酸銨沉淀法所得上清液與沉淀物中都具有一定的抑菌活性,二者的抑菌能力比較接近,可見硫酸銨沉淀法能夠提取出該抑菌活性物質(zhì),但對該抑菌活性物質(zhì)的提取效果不明顯。菌株S1-4發(fā)酵液經(jīng)乙醇沉淀法所得上清液的抑菌圈直徑為(32.09±0.20) mm,沉淀物的抑菌圈直徑為(8.34±0.53) mm,上清液和沉淀溶解液的抑菌圈直徑相差很大,這說明乙醇沉淀法能夠較好的提取出該抑菌活性物質(zhì)。因此,采用乙醇沉淀法對該抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行提取。

2.4 菌株S1-4的抑菌活性物質(zhì)提取條件的優(yōu)化

2.4.1 沉淀pH對分離提取液抑菌活性的影響 由圖1可知,當(dāng)沉淀pH為5.0時,該抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力較好。推測原因可能是沉淀pH為5.0時,細(xì)菌素能夠較好的吸附在細(xì)胞上,促進(jìn)了與靶細(xì)胞的結(jié)合,這可能與細(xì)菌素的抑菌機(jī)理有關(guān)[29,31]。菌株S1-4大部分抑菌活性物質(zhì)并沒有被沉淀出來,仍然溶解于乙醇溶劑中。故選定沉淀pH為5.0為菌株S1-4的抑菌活性物質(zhì)的最佳提取pH。

圖1 不同沉淀pH所得分離提取液的抑菌能力Fig.1 The inhibition ability of different extracts obtained under different precipitation pH

2.4.2 乙醇濃度對分離提取液抑菌活性的影響 由圖2可知,隨著乙醇濃度的增加,被分離提取出的抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力增強(qiáng),當(dāng)乙醇濃度為95%時,該抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力最強(qiáng)。這可能是由于隨著乙醇濃度的增加抑菌活性物質(zhì)的提取率提高,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到95%時,大部分的抑菌活性物質(zhì)被抽提在乙醇層中。故選定濃度為95%的乙醇為菌株S1-4的抑菌活性物質(zhì)的最佳提取乙醇濃度。

圖2 不同乙醇濃度所得分離提取液的抑菌能力Fig.2 The antibacterial ability of the extract under different ethanol concentration

2.4.3 沉淀時間對分離提取液抑菌活性的影響 由圖3可知,隨著沉淀時間的延長,該抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力逐漸增強(qiáng),而沉淀時間過長可能會破壞該抑菌活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。當(dāng)沉淀時間達(dá)到6 h后,大部分抑菌活性物質(zhì)仍然存在于乙醇溶劑中,且其結(jié)構(gòu)未被破壞,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇,達(dá)到提取目的。故選定沉淀6 h為菌株S1-4的抑菌活性物質(zhì)的最佳提取時間。

圖3 不同沉淀時間所得分離提取液的抑菌能力Fig.3 The antibacterial ability of the extract under different precipitation time

2.4.4 料液比對分離純化抑菌活性的影響 由圖4可知,當(dāng)料液比為1∶4時,被分離提取出的抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力較好。原因可能是隨著料液比的增大,提取液中除抑菌活性物質(zhì)外的其他物質(zhì)與乙醇充分相互作用被沉淀出,而大部分抑菌活性物質(zhì)未被沉淀仍然溶解于乙醇溶劑中,除去乙醇,達(dá)到提取目的。故選定料液比為1∶4作為菌株S1-4的抑菌活性物質(zhì)的最佳提取料液比。

表6 菌株S1-4抑菌物質(zhì)對飼料中細(xì)菌總數(shù)的影響Table 6 Effect of antibacterial substance of strain S1-4 on total bacterial count in feed

圖4 不同料液比所得分離提取液的抑菌能力Fig.4 The antibacterial activity of different extracts under different liquid to liquid ratio

2.4.5 正交實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5,極差R大小表明各因素對菌株S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)提取的影響程度,即沉淀pH>乙醇濃度>料液比>沉淀時間。菌株S1-4的抑菌物質(zhì)的乙醇沉淀法提取最佳條件是A2B3C3D2,即沉淀pH為5.0,乙醇濃度95%,沉淀時間8 h,料液比為1∶4。在此條件下,菌株S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌圈直徑為39.53 mm,比優(yōu)化前(32.09 mm)提高了23.18%。

表5 菌株S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的提取條件的正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for optimization of separation condition

2.5 菌株S1-4在飼料中的應(yīng)用

2.5.1 貯藏不同時間細(xì)菌總數(shù)變化 菌株S1-4發(fā)酵液按不同比例添加到市售牛飼料中,在室溫下貯藏不同時間的細(xì)菌總數(shù)的變化情況見表6。

由表6可知,添加MRS的飼料細(xì)菌總數(shù)大于添加菌株S1-4發(fā)酵液的飼料細(xì)菌總數(shù)。可能是因?yàn)樽⑷隡RS的飼料中營養(yǎng)物質(zhì)多,為微生物創(chuàng)造了適宜的生長環(huán)境,細(xì)菌總數(shù)隨著飼料貯藏時間的延長而逐漸增加,而添加菌株S1-4發(fā)酵液的飼料細(xì)菌總數(shù)增長緩慢,可能是菌株S1-4在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了具有抑制細(xì)菌生長的活性物質(zhì),并隨著添加菌株S1-4發(fā)酵液的比例增大,飼料中抑制細(xì)菌效果越明顯。

2.5.2 貯藏不同時間霉菌總數(shù)變化 菌株S1-4發(fā)酵液按不同比例添加到市售牛飼料中,在室溫下貯藏不同時間的霉菌總數(shù)的變化情況見表7。

由表7可知,隨著室溫貯藏時間的延長,對照組飼料由顆粒細(xì)小、顏色均勻、感官指標(biāo)較好逐漸變?yōu)轭伾儨\發(fā)白、結(jié)塊、長毛并且伴有發(fā)黑跡象。而添加不同濃度菌株S1-4發(fā)酵液的實(shí)驗(yàn)組,結(jié)塊和長毛現(xiàn)象出現(xiàn)的比對照組延緩,且添加濃度越大,出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象就相對越輕。這說明在飼料中添加菌株S1-4發(fā)酵液可抑制飼料中霉菌的生長,并且隨著菌株S1-4發(fā)酵液添加濃度的增加,抑菌效果也明顯。

表7 菌株S1-4抑菌物質(zhì)對飼料中霉菌總數(shù)的影響Table 7 Effect of antibacterial substance of strain S1-4 on mold count in feed

3 結(jié)論

從內(nèi)蒙古東部地區(qū)發(fā)酵酸菜中分離的14株乳酸菌中以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌檢測結(jié)果,對兩株菌均有抑菌活性的菌株有8株,其中菌株S1-4發(fā)酵液的抑菌活性較強(qiáng)且穩(wěn)定,其抑菌圈直徑分別達(dá)(19.69±0.71) mm和(20.59±0.26) mm。菌株S1-4發(fā)酵上清液的抑菌物質(zhì)對革蘭氏陽性菌和陰性菌均明顯的抑菌效果,呈現(xiàn)出較廣的抑菌譜。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,菌株S1-4產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的最佳提取條件為:沉淀pH為5.0,乙醇濃度95%,沉淀時間8 h,料液比為1∶4 (v∶v)。在此條件下,菌株S1-4產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌圈直徑為39.53 mm,比優(yōu)化前提高了23.18%。菌株S1-4發(fā)酵液按不同比例添加到飼料后,可抑制飼料中細(xì)菌和霉菌的生長,并且隨著菌株S1-4發(fā)酵液添加量的增加,抑菌效果明顯增加。

[1]曹國文,姜永康,戴榮國,等.豬源乳酸菌對致病性大腸桿菌的抑制實(shí)驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2005(12):70-71.

[2]楊菲菲,麻麗坤,王增敏,等.斷奶仔豬飼料中乳酸菌的應(yīng)用[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2006(5):60-61.

[3]蒲洪兵.乳酸菌素的檢測及應(yīng)用[J].食品工業(yè),2013(7):179-181.

[4]朱小喬,劉通訊.極具潛力的天然防腐劑[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2001,27(4):66-69.

[5]Demers Mathieu V,Gauthier S F,Britten M,et al. Inhibition ofListeriamonocytogenesgrowth in Cheddar cheese by an anionic peptides-enriched extract from whey proteins[J].International Dairy Journal,2013,32(1):6-12.

[6]Biscola V,Todorov S D,Capuano V S C,et al. Isolation and characterization of a nisin-like bacteriocin produced by aLactococcuslacticstrain isolated from charqui,a Brazilian fermented,salted and dried meat product[J].Meat Science,2013,93(3):607-613.

[7]Shin M S,Choi H J,Jeong K H,et al. Selection and Characterization of Bacteriocin-ProducingLactobacillusspAP 116 from the Intestine of Pig for Potential Probiotics[J].Korean Journal for Food Science of Animal Resources,2012,32(1):31-39.

[8]Adhikari M D,Mukherjee S,Saikia J,et al. Magnetic nanoparticles for selective capture and purification of an antimicrobial peptide secreted by food-grade Lactic acid bacteria[J].Journal of Materials Chemistry,2014(2):1432-1438.

[9]李琳,賈士儒,譚之磊,等.嗜熱鏈球菌CGMCC1.1864所產(chǎn)的一種新型細(xì)菌素ST9[J].微生物學(xué)通報,2010(3):349-354.

[10]Jena P K,Trivedi D,Chaudhary H,et al. Bacteriocin PJ4 active against enteric pathogen produced byLactobacillushelveticusPJ4 isolated from gut microflora of wistar rat(Rattusnorvegicus):partial purification and characterization of bacteriocin[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2013,169(7):2088-2100.

[11]Luis M C,Pilar C,Leiv S H,et al. Biochemical and Genetic Characterization of Enterocin P,a Novel sec-Dependent Bacteriocin fromEnterococcusfaeciumP13 with a Broad Antimicrobial Specturm[J].Applied and Environmental Microbiology,1997,63(11):4321-4330.

[12]Pascual L M,Daniele M B,Giordano W,et al. Purification and Partial Characterization of NovelBacteriocinL23 Produced byLactobacillusfermentumL23[J].Current Microbiology,2008,56(4):397-402.

[13]Lee N K,Park Y L,Kim H W,et al. Purification and Characterization of Lactic in NK34 Produced byLactococcuslacticNK34 against Bovine Mastitis[J].Korean J Food Sci An,2008,28(4):457-462.

[14]李亞玲,周志江,韓燁,等.乳酸片球菌細(xì)菌素的分離純化及理化性質(zhì)[J].食品工業(yè)科技,2007(8):94-97.

[15]Janes M E,Nannapaneni R,Proctor A,et al. Rice Hull Ash and Silicic Acid as Adsorbents for Concentration of Bacteriocins[J].Applied and Environmental Microbiology,1998,64(11):4403-4409.

[16]李偉棟.產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化及生物學(xué)特性的研究[D].密山:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),2016.

[17]崔建超.乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素的生物學(xué)特性及其在乳品中的應(yīng)用[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2002.

[18]王小娜,宋達(dá)峰,顧青.產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定及其特性研究[J].中國食品學(xué)報,2011(3):181-186.

[19]蘇日娜,吳青海,雙全.戊糖乳桿菌S1-4所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的生物學(xué)特性研究[J].食品工業(yè)科技,2015(13):171-174,179.

[20]陳秀金,馬麗蘋,曹力,等.地衣腌菜中產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選與鑒定[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2016(1):42-47.

[21]蘇日娜.抗菌活性乳酸菌的篩選、優(yōu)化及其抗菌物質(zhì)理化特性的研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[22]劉陽,何義國,趙興秀,等.泡菜中產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選及特性研究[J].中國調(diào)味品,2016(7):36-41.

[23]Kozaki M,Uchimura T,OKADA S. Experiment manual of lactic acid bacteria[M].Tokyo:Asakurasyoten,1992:60-82.

[24]凌代文,東秀株.乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999:8-108.

[25]丁浩,張帆,曹研,等.馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基制作方法的改進(jìn)[J].中國釀造,2012(4):141-144.

[26]沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第三版)[M].北京:高等教育出版社,1999:214-222.

[27]郭艷萍.抑黃曲霉乳酸菌的篩選及菌種鑒定[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[28]RIIHINEN K,JAAKLA L,KRENLAMPI S,et al. Organ specific distribution of phenolic compounds in bilberry(Vacciniummyrtillus)and ‘northblue’ blueberry(Vacciniumcorymbosumv. angustifolium)[J].Food Chemistry,2008,110:156-160.

[29]張金蘭,程萬鵬,暢曉淵,等.pH吸附法純化戊糖乳桿菌素31-1的研究[J].食品科學(xué),2007(12):350-354.

[30]張艾青,書亮,敖靈.產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選和鑒定[J].微生物學(xué)通報,2007(4):753-754.

[31]房春紅,劉杰,許修宏.乳酸菌素的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢[J].中國乳品工業(yè),2006(2):53-55.

Screeningoflacticacidbacteriawithantibacterialactivityandoptimizationofextractionconditionsofantimicrobialsubstances

SHUANGQuan,SHEMi-na,BOLi-juan

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

TS201.3

A

1002-0306(2017)18-0105-07

2017-02-27

雙全(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：shungquan688@126.com。

國家自然科學(xué)基金(31460443)；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2016MS0338)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.021