改良大鼠離體肝臟灌注模型在供肝冷保存中的應(yīng)用研究*

施少軍 鄭建新 秦 天 李小康 薛 峰 夏 強(qiáng)&

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科1(200127) 日本國(guó)立兒童成長(zhǎng)與發(fā)育研究所2

·論 著·

改良大鼠離體肝臟灌注模型在供肝冷保存中的應(yīng)用研究*

施少軍1#鄭建新1秦 天1李小康2薛 峰1夏 強(qiáng)1&

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科1(200127)日本國(guó)立兒童成長(zhǎng)與發(fā)育研究所2

背景：供肝冷保存和缺血再灌注損傷是影響肝移植患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，建立穩(wěn)定的冷保存再灌注動(dòng)物模型是開(kāi)展相關(guān)研究的基礎(chǔ)。目的：建立適用于綜合評(píng)價(jià)供肝質(zhì)量的改良大鼠離體肝臟灌注模型，為供肝冷保存研究提供合適的離體再灌注模型。方法：12只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組正常獲取供肝后進(jìn)行離體灌注90 min，實(shí)驗(yàn)組供肝經(jīng)30 min熱缺血后獲取，冷保存24 h后再行離體灌注。離體灌注期間監(jiān)測(cè)灌注液轉(zhuǎn)氨酶水平、電解質(zhì)濃度和pH值；以壓力感受器監(jiān)測(cè)供肝門(mén)靜脈壓力；以超微自由基探針監(jiān)測(cè)肝組織過(guò)氧化氫(HPO)水平。灌注結(jié)束后記錄膽汁流出量，檢測(cè)供肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)水平及其組織病理學(xué)改變和肝細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組供肝AST、ALT水平、門(mén)靜脈壓力和HPO水平明顯增高，膽汁流出量顯著減少，肝組織Cu/Zn SOD水平顯著降低。對(duì)照組供肝組織病理學(xué)損傷和肝細(xì)胞凋亡相對(duì)較輕。結(jié)論：經(jīng)熱缺血和冷保存后，供肝的肝功能和抗氧化能力均明顯降低。本研究構(gòu)建的改良大鼠離體肝臟灌注模型可有效監(jiān)控和評(píng)估大鼠供肝冷保存再灌注損傷情況。

肝移植； 器官保存； 離體灌注； 再灌注損傷； 大鼠，Sprague-Dawley

Correspondenceto: XIA Qiang, Email: xiaqiang@shsmu.edu.cn

Background: Cold storage and ischemia-reperfusion injury of liver grafts are critical for the prognosis of patients undergoing liver transplantation. Establishing a stable cold storage and reperfusion animal model is a fundamental measure for related studies.Aims: To establish a modified isolated perfused rat liver model for comprehensive assessment of liver grafts in studies on preservation of liver grafts before transplantation.Methods: Twelve Sprague-Dawley rats were randomly allocated into two groups. Livers of rats in control group were retrieved and perfused immediately for 90 minutes without preservation. In experimental group, liver grafts underwent a 30-minute warm ischemia followed by 24-hour cold storage beforeexvivoperfusion. The perfusate was collected dynamically for monitoring the levels of transaminases, electrolytes and pH value; the portal vein pressure of liver grafts was measured by pressure sensor, and the hepatic hydrogen peroxide (HPO) level was assessed by microprobe for free radicals. The bile production was recorded after theexvivoperfusion; meanwhile, the levels of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (Cu/Zn SOD), the histopathological changes and apoptosis of hepatocytes of liver grafts were examined.Results: Compared with the control group, the levels of AST and ALT, the portal vein pressure and the HPO level of liver grafts in experimental group were obviously increased throughout the perfusion. Furthermore, the bile production and level of Cu/Zn SOD of liver grafts in experimental group were significantly decreased. The histopathological injury and hepatocytes apoptosis of liver grafts were milder in control group.Conclusions: The liver function and antioxidant effect were reduced in warm ischemic and cold preserved liver grafts. The modified isolated perfused rat liver model established in this study is useful for monitoring and evaluation of the cold storage and reperfusion injury in liver grafts.

KeywordsLiver Transplantation; Organ Preservation; Isolated Perfusion; Reperfusion Injury; Rats, Sprague-Dawley

肝移植術(shù)后出現(xiàn)原發(fā)性移植肝無(wú)功能和移植肝功能恢復(fù)延遲是目前肝移植領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一，而供肝冷保存和缺血再灌注損傷是導(dǎo)致上述問(wèn)題，進(jìn)而影響肝移植患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。大鼠離體肝臟灌注(isolated perfused rat liver, IPRL)模型是研究肝臟生理學(xué)和病理生理學(xué)改變的理想模型，在肝臟藥理毒理學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。本研究擬建立適用于綜合評(píng)價(jià)供肝質(zhì)量的改良大鼠離體肝臟灌注(modified IPRL, MIPRL)模型，以期為供肝冷保存研究提供合適的離體再灌注模型，從而有利于器官保存液的研發(fā)和篩選。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

近交系雄性Sprague-Dawley大鼠12只，體質(zhì)量(250±16) g，購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。Celsior器官保存液(Catalent, Inc.)；改良Krebs-Henseleit灌注液(Sigma-Aldrich Co. LLC.)；丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche公司)。水浴恒溫振蕩器(上海梅香儀器有限公司)；精密蠕動(dòng)泵(泵頭YZ1515x，蘭格恒流泵有限公司)；大鼠型膜式氧合器、大鼠型熱交換器(西安西京醫(yī)療用品有限公司)；YP200壓力換能器(北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司)，PowerLab 4/26數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(ADInstruments Ltd.)；超微自由基探針、氣體信號(hào)分子和生物自由基檢測(cè)儀(WPI公司)。

二、方法

1. 分組：將12只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組：正常獲取供肝后進(jìn)行離體灌注90 min；實(shí)驗(yàn)組：供肝經(jīng)30 min熱缺血后獲取，置于4 ℃ Celsior器官保存液中保存24 h，再行離體灌注90 min。

2. MIPRL模型建立：術(shù)前不禁食，戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉。正中十字切口開(kāi)腹，逐層解剖止血，游離肝臟周?chē)g帶；游離膽總管，插入直徑1 mm PE導(dǎo)管，結(jié)扎固定；經(jīng)股靜脈注射50 IU肝素；游離門(mén)靜脈，結(jié)扎側(cè)支靜脈，16G靜脈留置針插管，連接高度15 cm的灌注吊瓶。熱缺血時(shí)間為門(mén)靜脈插管起至離體灌注前。于右腎側(cè)上方結(jié)扎分離肝下下腔靜脈；打開(kāi)膈肌，肝上上腔靜脈處插管，經(jīng)吊瓶滴注4 ℃含肝素Ringer’s液50 mL；獲取供肝，稱取肝重(liver weight, LW)。對(duì)照組供肝立即行離體灌注，實(shí)驗(yàn)組供肝置于4 ℃Celsior器官保存液中密封保存24 h后再行離體灌注。

離體再灌注系統(tǒng)由置肝皿、存液瓶、水浴恒溫振蕩器(2個(gè))、蠕動(dòng)泵、膜式氧合器、熱交換器、壓力感受器、膽汁收集管、過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide, HPO)探針和管道組成(圖1)。灌注前將灌注液pH值調(diào)定至7.4，加溫至37 ℃。供肝離體再灌注循環(huán)由門(mén)靜脈流入，流速設(shè)定為3 mL·g-1·min-1，經(jīng)肝臟從上腔靜脈流出至置于37 ℃水浴中的存液瓶，再經(jīng)蠕動(dòng)泵抽取，泵入膜式氧合器氧合，通氧流量為1 L/min，入肝前經(jīng)熱交換器加溫，維持37 ℃的灌流溫度。

圖1 離體再灌注系統(tǒng)組成及其循環(huán)模式

3. 離體再灌注系統(tǒng)監(jiān)控指標(biāo)：監(jiān)控時(shí)間點(diǎn)為再灌注15、30、60、90 min。①灌注液AST、ALT水平、電解質(zhì)濃度和pH值；②門(mén)靜脈壓力(portal vein pressure, PVP)：以壓力感受器進(jìn)行監(jiān)測(cè)，數(shù)據(jù)以門(mén)靜脈壓指數(shù)(PVP/LW, mm Hg/g)呈現(xiàn)；③HPO電壓值(HPOv)：以HPO探針插入供肝固定位置(左外側(cè)葉)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，數(shù)據(jù)以HPOv/LW(mV/g)呈現(xiàn)； ④膽汁流出量：于灌注結(jié)束時(shí)測(cè)量。

4. MDA、Cu/Zn SOD檢測(cè)：灌注結(jié)束后切取少量供肝組織(左外側(cè)葉)，與0.9% NaCl溶液按 1∶9制備成10%組織勻漿0.1 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清。分別采用硫代巴比妥酸法和WST-8法檢測(cè)MDA和Cu/Zn SOD水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

5. 供肝組織病理學(xué)檢查：灌注結(jié)束后，切取大小為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的供肝組織(左外側(cè)葉)，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，8 μm厚切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

6. 肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)：供肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)流程操作。肝細(xì)胞出現(xiàn)調(diào)亡時(shí)，陽(yáng)性細(xì)胞核呈黃色或棕色，襯染細(xì)胞核呈藍(lán)色。隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野，計(jì)算細(xì)胞核中有棕黃色顆粒的凋亡細(xì)胞在同一視野下所有細(xì)胞中所占比例，即凋亡指數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、離體再灌注系統(tǒng)監(jiān)控指標(biāo)

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組供肝灌注液中的轉(zhuǎn)氨酶水平和電解質(zhì)濃度均隨灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步升高，pH值則隨灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步降低，其中實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)AST水平和30、60、90 min時(shí)的ALT水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖2A、2B)，兩組間各時(shí)間點(diǎn)Na+、K+濃度和pH值差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1、圖2C)；兩組供肝PVP/LW在灌注過(guò)程中基本平穩(wěn)，其中實(shí)驗(yàn)組30、60 min時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖2D)；兩組供肝組織HPOv/LW均隨灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步升高，其中實(shí)驗(yàn)組 30 min 時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖2E)。實(shí)驗(yàn)組供肝在再灌注過(guò)程中的膽汁流出量為(38.1±22.8) μL，顯著低于對(duì)照組的(98.4±56.3) μL(P<0.01)。

二、氧化應(yīng)激指標(biāo)

離體灌注結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組供肝組織MDA水平為(6.20±3.07) nmol/mg，雖然略高于對(duì)照組的(4.17±1.61) nmol/mg，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組Cu/Zn SOD水平為(36.76±13.85) U/mg，低于對(duì)照組的(83.34±9.79) U/mg，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三、供肝組織病理學(xué)表現(xiàn)和肝細(xì)胞凋亡情況

對(duì)照組離體灌注結(jié)束后供肝肉眼觀察呈均勻的土黃色，表面光滑，質(zhì)地柔軟；光學(xué)顯微鏡下肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞條索排列整齊， 未見(jiàn)明顯腫脹、變性、壞死(圖3A)，TUNEL染色鮮有陽(yáng)性細(xì)胞(圖3C)。實(shí)驗(yàn)組離體灌注結(jié)束后供肝肉眼觀察肝葉邊緣有散在的淤血灶，余均呈均勻的土黃色；光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)部分肝小葉破壞，肝細(xì)胞條索排列紊亂，部分肝細(xì)胞腫脹變性，但鮮有壞死灶(圖3B)，TUNEL染色可見(jiàn)較多陽(yáng)性細(xì)胞(圖3D)，凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖3E)。

兩組間比較，*P<0.05，**P<0.01

組別15min30min60min90min對(duì)照組 Na+94.2±3.5138.1±0.7140.1±1.9142.4±2.7 K+7.9±0.28.8±0.49.2±0.39.6±0.4實(shí)驗(yàn)組 Na+95.8±4.5139.8±1.3143.8±2.4144.8±1.9 K+8.3±0.38.9±0.39.3±0.210.1±0.9

討 論

肝移植是絕大部分終末期肝病患者惟一有效的治療方式。隨著手術(shù)技術(shù)、圍手術(shù)期護(hù)理以及免疫抑制治療的長(zhǎng)足進(jìn)展，接受肝移植患者的短期和長(zhǎng)期生存率都得到了很大的提升。盡管如此，隨訪數(shù)據(jù)表明移植肝原發(fā)性肝功能障礙、遲發(fā)性肝無(wú)功能、原發(fā)性肝無(wú)功能以及血管和膽管并發(fā)癥的發(fā)生率仍高達(dá)20%[1]。此外，供肝短缺仍是肝移植領(lǐng)域中最根本的問(wèn)題。有學(xué)者認(rèn)為“邊緣供肝”是解決目前供肝短缺困境的有效途徑之一，然而邊緣供肝往往來(lái)源于老齡、伴發(fā)脂肪肝以及無(wú)心跳供體(non-heart-beating donors, NHBD)，對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性較差，原發(fā)性移植肝無(wú)功能的發(fā)生率往往高于活體肝移植供體或腦死亡供體[2-3]。因此，對(duì)供肝冷保存和再灌注采取必要的保護(hù)性干預(yù)措施，從而減小損傷、改善供肝質(zhì)量是目前肝移植研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題之一。

在冷保存期間，供肝N+-K+-ATP酶活性受到抑制，引起N+、Cl-內(nèi)流增加、繼發(fā)性胞內(nèi)Ca2+失衡以及細(xì)胞水腫。同時(shí)，無(wú)氧代謝導(dǎo)致線粒體功能障礙和中性粒細(xì)胞激活，促使大量自由基產(chǎn)生并損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞[4]。由于肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)缺氧和低能量供應(yīng)非常敏感，供肝易發(fā)生結(jié)構(gòu)改變和損傷[5]。研究表明，供肝冷保存期間的肝血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是缺血再灌注損傷的起始因子，可直接引發(fā)血小板激活、血管收縮、中性粒細(xì)胞聚集、Kupffer細(xì)胞激活、氧化應(yīng)激等一系列病理生理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝功能障礙[6]。

隨著供肝的復(fù)流，“氧爆發(fā)”所致的自由基生成和炎癥反應(yīng)直接損傷肝組織，引發(fā)一系列細(xì)胞毒性反應(yīng)。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為，缺血再灌注損傷可分為早期和后期兩個(gè)階段[7]。供肝復(fù)流后2 h內(nèi)為早期階段，這一階段以氧化應(yīng)激損傷為主，過(guò)量生成的自由基可直接與胞內(nèi)大分子如DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等結(jié)合，從而損害細(xì)胞功能[8]。巨噬細(xì)胞激活是氧化應(yīng)激的主要機(jī)制，其能損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，并釋放大量細(xì)胞外來(lái)源的自由基和炎癥介質(zhì)[9]。此外，中性粒細(xì)胞激活[9]、線粒體功能障礙[10]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]均能促進(jìn)自由基生成以及細(xì)胞壞死或凋亡。缺血再灌注損傷的后期階段一般發(fā)生在供肝復(fù)流后6～24 h[12]?，F(xiàn)有研究表明，缺血再灌注后期階段的損傷主要是由胞外自由基介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)所引起，中性粒細(xì)胞激活、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、自由基、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)均為該過(guò)程中的關(guān)鍵因子[13]。

A、C：對(duì)照組供肝組織HE染色(×400)和TUNEL染色(×400)；B、D：實(shí)驗(yàn)組供肝組織HE染色(×400)和TUNEL染色(×400)；E：對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組凋亡指數(shù)比較

圖3對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組供肝組織病理學(xué)表現(xiàn)和肝細(xì)胞凋亡情況比較

綜上，供肝冷保存和缺血再灌注損傷是目前制約肝移植發(fā)展的一個(gè)主要因素，而氧化應(yīng)激損傷為其關(guān)鍵機(jī)制之一[14]。有效的抗氧化干預(yù)往往能緩解缺血再灌注損傷，提升供肝質(zhì)量[15-17]。器官保存液的研發(fā)和改良是實(shí)現(xiàn)抗氧化干預(yù)的有效途徑，而建立穩(wěn)定的冷保存再灌注動(dòng)物模型，從而有效評(píng)估供肝質(zhì)量和冷保存再灌注損傷程度是開(kāi)展相關(guān)研究的基礎(chǔ)。

IPRL模型是研究供肝生理學(xué)和病理生理學(xué)改變的模型，經(jīng)典IPRL模型系由Gores等[18]于1986年所構(gòu)建，其后經(jīng)諸多改良，目前在肝臟藥理毒理學(xué)研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，可在體外獨(dú)立體系中評(píng)估肝細(xì)胞損傷和肝功能。在肝移植研究領(lǐng)域，IPRL模型與大鼠肝移植模型相比具有操作簡(jiǎn)便、所需大鼠數(shù)量較少、標(biāo)準(zhǔn)化程度較高的優(yōu)勢(shì)，適用于需進(jìn)行大量篩選評(píng)估工作的器官保存液的研發(fā)和改良研究[19]。有鑒于此，本研究擬在經(jīng)典IPRL模型的基礎(chǔ)上根據(jù)本單位在抗氧化器官保存液研究方面的目的和要求，采取對(duì)應(yīng)的措施進(jìn)行改良，從而建立、穩(wěn)定可靠的改良模型(MIPRL)，以之對(duì)供肝質(zhì)量進(jìn)行全面、有效的評(píng)估。具體而言，本研究在經(jīng)典IPRL模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)雙水浴與熱交換器相結(jié)合以及優(yōu)化管道設(shè)計(jì)的方式，減少循環(huán)傳輸中的熱消耗，有效保證合理、恒定的入肝溫度。同時(shí)，門(mén)靜脈壓力感受器和HPO探針的加入能動(dòng)態(tài)觀察供肝的生化和氧化還原狀態(tài)。而對(duì)供肝灌注液轉(zhuǎn)氨酶、電解質(zhì)和酸堿狀況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)以有效保證供肝的生理活性，亦為該模型的一大優(yōu)勢(shì)。

從本研究結(jié)果可見(jiàn)，在90 min的再灌注過(guò)程中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組供肝灌注液中的轉(zhuǎn)氨酶水平均逐步升高，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)AST水平均顯著高于對(duì)照組，提示熱缺血和冷保存過(guò)程對(duì)肝臟生理和生化功能有較大影響。實(shí)驗(yàn)組膽汁流出量較對(duì)照組顯著減少，表明供肝膽汁生成能力受損。實(shí)驗(yàn)組30、60 min時(shí)的門(mén)靜脈壓指數(shù)PVP/LW顯著高于對(duì)照組，亦間接反映供肝損傷程度加重，與供肝組織中HPOv/LW隨灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步升高、30 min時(shí)實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組的變化趨勢(shì)相一致。盡管灌注結(jié)束后供肝組織MDA檢測(cè)顯示兩組間脂質(zhì)過(guò)氧化水平無(wú)明顯差異，但實(shí)驗(yàn)組Cu/Zn SOD水平顯著低于對(duì)照組，提示SOD消耗顯著多于對(duì)照組，可以認(rèn)為是由于熱缺血和冷保存過(guò)程中供肝抗氧化物質(zhì)大量消耗，導(dǎo)致其抗氧化能力明顯降低。結(jié)合灌注結(jié)束后供肝組織病理學(xué)表現(xiàn)和細(xì)胞凋亡情況可以發(fā)現(xiàn)，在未經(jīng)熱缺血和冷保存處理的情況下，MIPRL模型能保證離體供肝組織的基本形態(tài)和活性。

綜上所述，經(jīng)熱缺血和冷保存后，大鼠供肝的肝功能和抗氧化能力均明顯降低，而本研究構(gòu)建的MIPRL模型能直觀、實(shí)時(shí)、量化地反映供肝冷保存再灌注損傷情況，為后續(xù)抗氧化器官保存液的研發(fā)和改良提供了一種可靠的供肝系統(tǒng)評(píng)估工具，從而能對(duì)供肝進(jìn)行有效的監(jiān)控和評(píng)估，是研究供肝冷保存后再灌注的理想模型。

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(2017-03-29收稿；2017-04-10修回)

EstablishingAModifiedIsolatedPerfusedRatLiverModelforAppliedinStudyofColdStorageofLiverGrafts

SHIShaojun1,ZHENGJianxin1,QINTian1,LIXiaokang2,XUEFeng1,XIAQiang1.

1DepartmentofLiverSurgeryandLiverTransplantationCenter,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai(200127);2NationalResearchInstituteforChildHealthandDevelopment,Tokyo,Japan

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.09.002

國(guó)家自然科學(xué)基金(81470847, 81670602)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(TM201511)

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