海南羅非魚(yú)源維氏氣單胞菌的分離、毒力基因檢測(cè)及ERIC-PCR分型

張永政，李 聰，王世鋒，蔡 巖，周永燦，鄭 玉，朱薇薇

( 南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué) 海洋學(xué)院 海南 海口 570228 )

海南羅非魚(yú)源維氏氣單胞菌的分離、毒力基因檢測(cè)及ERIC-PCR分型

張永政，李 聰，王世鋒，蔡 巖，周永燦，鄭 玉，朱薇薇

( 南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué) 海洋學(xué)院 海南 ?？?570228 )

從海南羅非魚(yú)的體內(nèi)分離和鑒定出40株維氏氣單胞菌，并對(duì)這40株維氏氣單胞菌進(jìn)行了8種毒力基因檢測(cè)及ERIC-PCR分型分析.毒力基因檢測(cè)的結(jié)果表明：在這40株維氏氣單胞菌中，主要攜帶6種毒力基因，即act，alt，ast，fla，lip和hlyA基因，其攜帶率分別為35.0%，22.5%，27.5%，37.5%，5.0%和15%，未能檢測(cè)到TapA和aerA基因；根據(jù)不同菌株攜帶毒力基因的不同，這40株維氏氣單胞菌又可分為13種毒力基因型，攜帶2種以上毒的菌株有15株，占總數(shù)的37.5%，攜帶3種以上毒力基因的菌株有9株，占總數(shù)的22.5%，其中HNWC23攜帶5種毒力基因，其毒力基因型為act+alt+ast+hlyA+fla+.ERIC-PCR分型結(jié)果顯示：該40株維氏氣單胞菌可分為四個(gè)大簇，以遺傳相似度(96%)為界可將其分為18種ERIC型，每個(gè)簇中的ERIC型都呈現(xiàn)多樣性.

羅非魚(yú)； 維氏氣單胞菌； 毒力基因； ERIC-PCR

羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種，其養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量在世界羅非魚(yú)養(yǎng)殖中占有重要地位[1].近幾年，隨著集約化養(yǎng)殖規(guī)模的增加，各種疾病不斷出現(xiàn)，特別是細(xì)菌性疾病給我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失.海南作為我國(guó)羅非魚(yú)的主要養(yǎng)殖區(qū)域，每年關(guān)于其疾病爆發(fā)的報(bào)道越來(lái)越多.目前，已報(bào)道的羅非魚(yú)細(xì)菌性疾病主要包括：維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[1-2]、無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)[3]、愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)[4]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydropgila)[5-6]等.

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii) 也稱(chēng)為維羅納氣單胞菌、凡隆氣單胞菌和維隆氣單胞菌，是一類(lèi)革蘭氏陰性桿菌.國(guó)內(nèi)外的研究表明，維氏氣單胞菌廣泛分布于土壤、自然水體和養(yǎng)殖水體中，是一種典型的人-畜-魚(yú)共患病原菌[7-9].在維氏氣單胞菌感染人體后，該菌可引起嚴(yán)重的腹瀉、敗血癥和腦膜炎等，嚴(yán)重者甚至?xí)＜吧黐10].近年來(lái)，維氏氣單胞菌感染水產(chǎn)動(dòng)物的報(bào)道越來(lái)越多，包括羅非魚(yú)、鯽魚(yú)和草魚(yú)等20余種水產(chǎn)動(dòng)物[1].國(guó)內(nèi)外對(duì)維氏氣單胞菌進(jìn)行了諸多研究，包括耐藥性、分子分型等方面[1,11-12].并且有研究表明，維氏氣單胞菌的毒力具有增強(qiáng)的趨勢(shì)[13].2014年3—5月份，海南省羅非魚(yú)主養(yǎng)區(qū)的多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)均暴發(fā)疾病，李聰?shù)劝l(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌為此次疾病的主要致病菌，而且這是在海南首次發(fā)現(xiàn)關(guān)于維氏氣單胞菌感染水產(chǎn)動(dòng)物的報(bào)道[1].鑒于此，為進(jìn)一步了解海南維氏氣單胞菌的分布、分子分型和毒力基因攜帶等情況，本研究采用生理生化、16S rDNA和gyrB基因鑒定方法分別對(duì)海南養(yǎng)殖區(qū)域和野生區(qū)域的羅非魚(yú)進(jìn)行了維氏氣單胞菌的分離，并對(duì)所獲得的維氏氣單胞菌進(jìn)行了毒力基因檢測(cè)和ERIC-PCR分子分型，以此來(lái)研究維氏氣單胞菌的分布和潛在致病性等情況，旨在為今后該疾病的防治提供數(shù)據(jù)資料和理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物本試驗(yàn)所用的養(yǎng)殖羅非魚(yú)來(lái)自海南文昌、三江等羅非魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)以及?？诹_非魚(yú)銷(xiāo)售市場(chǎng)，所用的野生羅非魚(yú)來(lái)自天然湖泊和實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)，其中，養(yǎng)殖羅非魚(yú)體長(zhǎng)為28～32 cm，體重為(450±10)g，野生羅非魚(yú)體長(zhǎng)為12～16 cm，體重為(60±7)g，采集時(shí)間、地點(diǎn)及菌株編號(hào)見(jiàn)表1.

1.1.2 試驗(yàn)試劑氧化酶試紙購(gòu)自?？诜惫?jié)高生物有限公司；接觸酶、氧化發(fā)酵鑒定管購(gòu)自上海通善生物科技有限公司；DNA提取試劑盒和DNA純化試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；LB培養(yǎng)基、RS瓊脂選擇性培養(yǎng)基購(gòu)于青島日水公司；引物由上海美吉生物科技有限公司合成.

1.2維氏氣單胞菌分離與鑒定

1.2.1 細(xì)菌分離于無(wú)菌條件下從羅非魚(yú)的鰓、腦、腎臟、肝臟、脾臟等組織部位取樣，將采集到的樣品分別接種于RS瓊脂平板，并于30 ℃恒溫培養(yǎng)20～48 h，接著觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，然后分別挑取5～8個(gè)形態(tài)和大小一致的優(yōu)勢(shì)菌落，在LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜純培養(yǎng)，最后于4 ℃保存，備用.

表1 養(yǎng)殖羅非魚(yú)與野生羅非魚(yú)分離菌株的數(shù)量分布

注：編號(hào)為HKDM、HDNM、HNWC、HKSJ的菌株分離自養(yǎng)殖羅非魚(yú)；編號(hào)為HDDL和SYS的菌株分離自野生羅非魚(yú).

1.2.2 菌落形態(tài)和生理生化鑒定將分離得到的純化菌種接種于RS瓊脂培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)20～48 h，然后觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)特性和菌落形態(tài)，接著挑取單菌落進(jìn)行生理生化鑒定.參考周光等的實(shí)驗(yàn)方法選用氧化酶試紙、氧化發(fā)酵鑒定管和接觸酶，并將菌株鑒定到屬[14].其步驟如下：用滅菌牙簽刮取RS固體培養(yǎng)基單菌落于氧化酶試紙上，若試紙變紅則為陽(yáng)性；用滅菌牙簽刮取RS固體培養(yǎng)基單菌落于干凈濾紙上，加入1滴φ=3%的 H2O2，若立即出現(xiàn)大量氣泡，則為陽(yáng)性，無(wú)氣泡則為陰性；用滅菌牙簽刮取RS固體培養(yǎng)基單菌落于氧化發(fā)酵鑒定管中，在其中一管加入0.5 cm的無(wú)菌液體石蠟，另一管不加(作為開(kāi)放管)，于35 ℃孵育48 h，若加液體石蠟的管顏色不變，而不加液體石蠟的管變黃，則說(shuō)明為氧化型.若氧化酶試紙和接觸酶指標(biāo)為陽(yáng)性，且氧化發(fā)酵鑒定為氧化型，則可初步判斷菌株為氣單胞菌屬.

1.2.3 16S rDNA和gyrB基因的鑒定參照李聰?shù)鹊膶?shí)驗(yàn)方法對(duì)經(jīng)生理生化鑒定確認(rèn)的氣單胞菌進(jìn)行16S rDNA和gyrB基因的鑒定[1]，即取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，離心收集菌體，同時(shí)利用DNA提取試劑盒提取氣單胞菌DNA，并用16S rDNA通用引物和gyrB基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物長(zhǎng)度及片段長(zhǎng)度等見(jiàn)表2.PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2.5 μL 10×Buffer，2.5 μL dNTP，各1.0 μL上/下游引物，1 μL Taq DNA聚合酶，1μL DNA模板，其余用ddH2O補(bǔ)齊.PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min.PCR結(jié)束后，以w=1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并回收；PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，并送至上海美吉生物科技有限公司測(cè)序，最后將所得到的16S rDNA和gyrB基因的序列在Genbank中進(jìn)行Blast比對(duì)，以確定維氏氣單胞菌的數(shù)量.

1.3維氏氣單胞菌毒力基因的檢測(cè)對(duì)經(jīng)16S rDNA和gyrB基因序列分析確認(rèn)的維氏氣單胞菌，利用PCR來(lái)檢測(cè)其毒性腸毒素act[15]、熱不穩(wěn)定性腸毒素alt[15]、熱穩(wěn)定性腸毒素ast[15]、菌毛基因TapA[16]、氣溶素aerA[17]、酯酶lip[18]、鞭毛蛋白基因fla[18]和溶血素hlyA[19]等8種毒力基因的攜帶情況，引物及片段長(zhǎng)度等見(jiàn)表2，在對(duì)40株維氏氣單胞菌進(jìn)行毒力基因PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序.

表2 PCR引物序列、片段長(zhǎng)度和退火溫度

1.4維氏氣單胞菌的ERIC-PCR分型參照Rafiee等的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)分離得到的維氏氣單胞菌進(jìn)行ERIC-PCR分型[20].待菌株于30 ℃的生化培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)20 h后，離心收集菌體，然后利用DNA提取試劑盒提取維氏氣單胞菌DNA，并進(jìn)行ERIC-PCR基因的PCR擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增引物序列為：F(5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′)和R(5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′).PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTP，各1.0 μL上/下游引物，1 μL Taq DNA聚合酶，2 μL 2.5 mmol·L-1的MgCl2，2 μL模板，其余用ddH2O 補(bǔ)齊.PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；待PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳并檢測(cè).通過(guò)Quantity one軟件對(duì)ERIC-PCR電泳圖進(jìn)行分析，并利用NTSYS2.1軟件進(jìn)行ERIC聚類(lèi)分析.

2 結(jié) 果

2.1維氏氣單胞菌分離通過(guò)RS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果顯示，從羅非魚(yú)各組織部位均可分離到大量形態(tài)相似但顏色不同的菌落.根據(jù)顏色的不同，分別隨機(jī)挑取2～4個(gè)菌落，每個(gè)平板隨機(jī)挑取5～8個(gè)單菌落，從RS固體培養(yǎng)基中共分離出各類(lèi)菌株152株，其中，來(lái)自養(yǎng)殖羅非魚(yú)的疑似氣單胞菌有103株，來(lái)自野生羅非魚(yú)的疑似氣單胞菌有49株(見(jiàn)表1).

2.2維氏氣單胞菌鑒定

2.2.1 生理生化鑒定通過(guò)氧化酶試紙、氧化發(fā)酵鑒定管和接觸酶實(shí)驗(yàn)對(duì)RS瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的疑似氣單胞菌進(jìn)行生理生化鑒定，最終確定疑似氣單胞菌有136株(見(jiàn)表1)，占所有分離菌株的89%，其中來(lái)自養(yǎng)殖羅非魚(yú)的疑似氣單胞菌的陽(yáng)性率為87%，而來(lái)自野生羅非魚(yú)的疑似氣單胞菌株的陽(yáng)性率為94%.

2.2.2 分子鑒定在對(duì)生理生化鑒定得到的136株菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定后，結(jié)果顯示：在136株菌中有71株為氣單胞菌，陽(yáng)性率為52%(見(jiàn)表1).根據(jù)16S rDNA的鑒定結(jié)果，利用gyrB基因?qū)?1株氣單胞菌進(jìn)行鑒定，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序比對(duì)后，最終確定有40株為維氏氣單胞菌(見(jiàn)表1)，占?xì)鈫伟倲?shù)的56%.其中，來(lái)自養(yǎng)殖羅非魚(yú)的維氏氣單胞菌有26株，而來(lái)自野生羅非魚(yú)的維氏氣單胞菌有14株.

2.3維氏氣單胞菌毒力基因的檢測(cè)40株維氏氣單胞菌的8種毒力基因的攜帶率如圖1所示，所檢測(cè)的這40株維氏氣單胞菌僅攜帶6種毒力基因，分別為act、alt、ast、fla、lip、hlyA，攜帶率分別為35.0%，22.5%，27.5%，37.5%，5.0%和15%；未攜帶菌毛基因TapA和氣溶素基因aerA.8種毒力基因在不同菌株中的分布情況見(jiàn)表3，40株維氏氣單胞菌可分為13個(gè)毒力基因型，其中，有24株菌株攜帶1種以上的毒力基因，占總數(shù)的60%，有15株菌株攜帶2種以上的毒力基因，占總數(shù)的37.5%，有9株菌株攜帶3種以上的毒力基因，占總數(shù)的22.5%，而且HNWC23菌株攜帶了5種毒力基因，其毒力基因型為act+alt+ast+hlyA+fla+.

2.4維氏氣單胞菌ERIC-PCR分型40株維氏氣單胞菌的ERIC-PCR擴(kuò)增條帶如圖2所示，各菌株經(jīng)ERIC-PCR擴(kuò)增后可產(chǎn)生多條指紋條帶，條帶大小范圍為100～8 000 bp；ERIC-PCR分型結(jié)果如圖3顯示，各個(gè)菌株之間的相似系數(shù)在0.51～1.0之間，當(dāng)遺傳相似度為72%時(shí)，所有菌株可分為A、B、C、D四個(gè)大簇，其中，簇A共有2株菌，占總菌數(shù)的5%；簇B共有15株菌，占總菌數(shù)的37.5%；簇C共有3株菌，占總菌數(shù)的7.5%；簇D共有20株菌，占總菌數(shù)的50%.當(dāng)遺傳相似度為96%時(shí)，維氏氣單胞菌菌株可分為18種ERIC型，其中，ERIC-3型包含的菌株最多，共有15株菌，8株來(lái)自野生魚(yú)源，7株來(lái)自養(yǎng)殖魚(yú)源.

3 討 論

3.1維氏氣單胞菌的分離鑒定對(duì)于維氏氣單胞菌，一般采用生理生化和16S rDNA基因序列分析的方法來(lái)進(jìn)行鑒定.不過(guò)由于16S rDNA基因具有高度的保守性，因此，當(dāng)在某些親緣關(guān)系很近的類(lèi)群之間使用該方法鑒定時(shí)卻難以準(zhǔn)確地鑒定到種[21-22].gyrB基因是DNA促旋酶的B亞單位基因，其平均堿基替換率每百萬(wàn)年為0.7%～0.8%，遠(yuǎn)高于16S rDNA的每5 000萬(wàn)年1%的突變率，因此，它更適用于相似率較高的屬內(nèi)近緣種的鑒定[23].La Du等在對(duì)4種不同屬種的芽孢桿菌進(jìn)行比較和研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，基于gyrB序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可有效地對(duì)這四個(gè)屬進(jìn)行區(qū)分，而16S rDNA卻無(wú)法將它們區(qū)分開(kāi)來(lái)[24].在本研究中，作者利用RS培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行分離，同時(shí)利用生理生化鑒定和16S rDNA 基因序列分析的方法獲得了71株維氏氣單胞菌，不過(guò)當(dāng)使用gyrB基因序列進(jìn)行鑒定時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)其中的40株是維氏氣單胞菌，有31株存在疑問(wèn)，可見(jiàn),gyrB基因比16S rDNA序列分析能夠更有效地對(duì)維氏氣單胞菌進(jìn)行鑒定.

圖1 維氏氣單胞菌的毒力相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果

表3 毒力基因攜帶的分布情況

注：“+”代表陽(yáng)性；“-”代表陰性；編號(hào)為HKDM，HDNM，HNWC，HKSJ的菌株分離自養(yǎng)殖羅非魚(yú)； 編號(hào)為HDDL， SYS的菌株分離自野生羅非魚(yú).

圖2 維氏氣單胞菌ERIC鄄PCR 擴(kuò)增片段

( 注：編號(hào)為HKDM，HDNM，HNWC，HKSJ的菌株分離自養(yǎng)殖羅非魚(yú)，編號(hào)為HDDL，SYS的菌株分離自野生羅非魚(yú))

3.2維氏氣單胞菌毒力基因的分析維氏氣單胞菌的致病性通常與其毒力基因的攜帶情況有關(guān)[25].周光等發(fā)現(xiàn)在團(tuán)頭魴中alt和hly毒力基因的攜帶率分別為26.8%和48.2%[14]；Pablos等從腹瀉患者和飲用水中分離得到800株維氏氣單胞菌，并在進(jìn)行毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其毒力基因alt，hlyA和ast的攜帶率分別為71.9%，28.1%和18.8%[26].然而在本研究中，作者對(duì)所分離的40株維氏氣單胞菌進(jìn)行了8種毒力基因的檢測(cè)，檢測(cè)到了6種毒力基因，其中，act，alt，ast，fla毒力基因的攜帶率較高，分別達(dá)到35.0%，22.5%，27.5%，37.5%，攜帶三種或三種以上毒力基因的菌株也有9株，可見(jiàn)，在海南地區(qū)，羅非魚(yú)源維氏氣單胞菌攜帶有多種毒力基因.在40株維氏氣單胞菌中尚未發(fā)現(xiàn)tapA和aerA 2種毒力基因，這可能是由于羅非魚(yú)物種及分布區(qū)域不同而導(dǎo)致維氏氣單胞菌攜帶不同毒力基因的緣故.

圖3 40 株維氏氣單胞菌ERIC-PCR 分型分析圖

( 注：菌株編號(hào)HKDM、HDNM、HNWC、HKSJ分離自養(yǎng)殖羅非魚(yú)，HDDL、SYS分離自野生羅非魚(yú))

目前，對(duì)多種毒力因子的綜合分析是檢測(cè)潛在致病菌的重要手段之一[27].周光等發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶alt和hly毒力基因的維氏氣單胞菌株在感染團(tuán)頭魴48h后，團(tuán)頭魴的致死率為41.8%，明顯高于攜帶單一毒力基因的維氏氣單胞菌的致死率(29.2%)[14]；黃鈞等對(duì)從患白底板病的黃沙鱉中分離得到了13株氣單胞菌，在進(jìn)行毒力基因檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，對(duì)于攜帶溶血素基因hly的菌株，其致死速度要比缺乏溶血素基因的菌株快[28]；熊靜等的研究發(fā)現(xiàn)，ast和act基因在鰻鱺致病中起著重要作用，對(duì)于含有ast和act毒力基因的氣單胞菌，其人工感染的致死率為53%，高于不含ast和act基因的氣單胞菌的人工感染致死率[29]；符貴紅等發(fā)現(xiàn)毒力基因型為act+alt+hlyA+的嗜水氣單胞菌具有較強(qiáng)毒力[30]；Gavin等的研究發(fā)現(xiàn)，fla基因在病原菌的粘附過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用[31].而在本研究中，含有2種以上毒力基因的菌株有15株，其中，攜帶alt和hly毒力基因的菌株有3株，攜帶ast和act基因的菌株有5株，攜帶act，alt和hly毒力基因的菌株有1株，而且有一株同時(shí)攜帶act，alt，ast，fla和hly毒力基因，因此認(rèn)為，分離自海南地區(qū)的維氏氣單胞菌株具有較強(qiáng)的潛在致病性，但其具體致病能力尚需通過(guò)攻毒實(shí)驗(yàn)來(lái)做進(jìn)一步的研究.

3.3維氏氣單胞菌的ERIC-PCR分型ERIC序列作為一段非編碼的保守重復(fù)序列，其最初是在腸道細(xì)菌的基因組中被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)ERIC序列所建立的ERIC-PCR能準(zhǔn)確地和有效地顯示底物序列的差異性,因此它被廣泛應(yīng)用于氣單胞菌的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)分析[32].Szczuka等用ERIC-PCR基因分型的方法對(duì)臨床和自然環(huán)境中的氣單胞菌進(jìn)行了遺傳多樣性的分析，結(jié)果顯示，從不同地區(qū)分離得到的120株氣單胞菌在分型后可得到三個(gè)大簇，每個(gè)簇中的ERIC型都呈現(xiàn)多樣性[33]；Maitib等對(duì)來(lái)自臨床菌株和自然環(huán)境的42株維氏氣單胞菌進(jìn)行了ERIC-PCR基因分型，結(jié)果證明這兩種環(huán)境中的菌株具有遺傳多樣性[34].本研究中，ERIC-PCR可基于基因組上的特定重復(fù)序列快速地對(duì)40株來(lái)源不同的維氏氣單胞菌進(jìn)行區(qū)分和歸類(lèi)，以遺傳相似度(96%)為界， 它可將40株菌株分為A、B、C、D四個(gè)大簇和18種ERIC型，顯示出良好的分辨能力；大部分維氏氣單胞菌的ERIC型分布情況與毒力基因攜帶的分布情況類(lèi)似，來(lái)自同一分離區(qū)域的菌株含有不同的基因型，而每個(gè)簇中的菌株又來(lái)自不同的區(qū)域，可見(jiàn)，在海南地區(qū)羅非魚(yú)維氏氣單胞菌的ERIC-PCR基因型呈現(xiàn)出多樣性.

通過(guò)ERIC-PCR分型發(fā)現(xiàn)，來(lái)自不同區(qū)域的維氏氣單胞菌的電泳條帶相似度很高，如在ERIC-3和ERIC-17型中，維氏氣單胞菌的電泳條帶相似度很高，這表明來(lái)自不同區(qū)域的菌株之間具有一定的親緣關(guān)系，胡王等認(rèn)為這可能與羅非魚(yú)的來(lái)源以及水源的流動(dòng)有關(guān)[35].此外，在海南地區(qū)與廣東地區(qū)間羅非魚(yú)苗種及商品羅非魚(yú)一直存在著流通，如早在2011年，黎炯等就在廣東羅非魚(yú)養(yǎng)殖區(qū)分離得到了維氏氣單胞菌[2]，因此，對(duì)于羅非魚(yú)維氏氣單胞菌在不同地區(qū)的傳播、分布及起源等還有待做進(jìn)一步的研究.

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Abstract：In the study, 40 strains ofAeromonasveroniifrom Tilapia in Hainan Province were isolated and identified, and eight virulence genes and ERIC-PCR sub-typing were analyzed. The results of virulence gene detection indicated that 6 virulence genes were detected and the carrying rate of 6 virulence genes of act, alt, ast, fla, lip and hlyA was 35.0%, 22.5%, 27.5%, 37.5%, 5.0% and 15%, respectively. However, the virulence genes TapA and aerA were not detected. The results of virulence gene genotyping demonstrated that there were 13 different virulence genotypes in 40A.veroniistrains, and 15 strains carried two or more virulence genotypes, accounting for 60% of total 40 strains, 9 strains carried three or more virulence genotypes, accounting for 22.5% of total 40 strains. There were 5 virulence genes in HNWC23, whose virulence genotype was act+alt+ast+hlyA+fla+. The results of ERIC-PCR sub-typing suggested that 40 strains can be divided into four clusters, 18 genotypes with 96% genetic similarity.

Keywords：Tilapia;Aeromonasveronii; virulence gene; ERIC-PCR

Isolation,DetectionofVirulenceGenesandERIC-PCRSub-typingofAeromonasveroniifromTilapiainHainan

Zhang Yongzheng, Li Cong, Wang Shifeng, Cai Yan, Zhou Yongcan, Zheng Yu, Zhu Weiwei

(State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science, Hainan University, Haikou 570228, China)

S948

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0043

2017-04-17

基金項(xiàng)目：海南省科技興海專(zhuān)項(xiàng)(2015XH02)； 海洋藥源生物種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)項(xiàng)目(12PYY001SF08-HNDX-1)；海南省重點(diǎn)科 技計(jì)劃項(xiàng)目(ZDXM20120005)

張永政(1989-)，男，山東濰坊人，海南大學(xué)海洋學(xué)院2014級(jí)碩士研究生，E-mail: yz.zhangchn@foxmail.com

王世鋒(1977-)，男，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖與病害控制，E-mail: shifeng_15@ 163.com

1004-1729(2017)03-0273-09