響應面法優(yōu)化金櫻子多糖微波輔助提取工藝

曾慶華+孫小凡+樊琛+齊鑫+李燕+葉勇+劉軍海+曾慶梅

摘要：為了優(yōu)化金櫻子（Rosa laevigata Michx.）多糖的提取工藝，采用微波輔助提取方法，以去離子水為溶劑提取金櫻子中多糖成分，并以多糖成分提取率為考察指標，通過單因素試驗和響應面試驗來探討和優(yōu)化金櫻子多糖的提取工藝，得到金櫻子多糖的最佳提取工藝條件為微波時間3.5 min，微波功率438 W，料液比為1∶27（g∶mL），浸提1次。在此提取工藝條件下，金櫻子多糖實際提取率可達52.0%。

關(guān)鍵詞：金櫻子（Rosa laevigata Michx.）；多糖；微波輔助法；單因素試驗；響應面試驗

中圖分類號：TS207.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）17-3314-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.032

Optimization of Polysaccharide from Rosa laevigata Michx. Extraction Using Microwave Extraction by Response Surface Methodology

ZENG Qing-hua1，2，SUN Xiao-fan1，F(xiàn)AN Chen1，QI Xin1，LI Yan1，YE Yong2，LIU Jun-hai1，ZENG Qing-mei2

（1.Department of Food Science and Engineering，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China；

2.School of Food Science and Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

Abstract： In order to optimize the extraction process of polysaccharide from Rosa laevigata Michx.，the method of microwave-assisted extraction technology was adopted by using distilled water as the solvent and the extraction rate of polysaccharide as the index. Microwave time，microwave power， ratio of material to liquid and microwave extraction times were studied. Based on the single factor experiment，the extraction process of polysaccharide from Rosa laevigata Michx. polysaccharide was optimized by using the central combination experiment design. The influence factor of the process was determined by regression analysis，and the extraction rate of polysaccharide was determined by the factor of 3. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：the ratio of material to liquid of 1∶27（g∶mL），microwave time of 3.5 min，microwave power of 438 W，extraction of 1 time，the actual extraction rate of polysaccharide was 52.0%.

Key words： Rosa laevigata Michx.；polysaccharide；microwave-assisted extraction；single factor experiments；response surface methodology

金櫻子（Rosa laevigata Michx.），又名糖罐子、白玉帶、黃茶瓶、刺頭、倒掛金鉤等，是薔薇科薔薇屬的一種野生常綠蔓性灌木。其適宜生長環(huán)境對土壤要求不嚴，陽坡為宜，喜歡溫暖濕潤和陽光充足的環(huán)境，主要分布在中國華東、華中、華南及西南等地[1]，貴州最為豐富。其果實可以入藥，具有補腎、利尿的作用，2015年版第一部《中國藥典》[2]將金櫻子果實收錄其中；其葉有消腫、解毒的作用；根藥用可以活血散瘀、拔毒驅(qū)濕。《本草綱目》記載金櫻子“性酸、澀、平，無毒；主治脾瀉下痢、止小便利、澀精氣；久服，令人耐寒輕身，補血益精有奇效”[3]。在醫(yī)學上，金櫻子可以用于治療神經(jīng)衰弱、抑菌消毒、腹瀉、高血壓病、慢性腎炎、抗動脈粥樣硬化、皮膚癌、早期宮頸癌等病癥[4-7]。研究表明，金櫻子的活性成分可以促進心肌細胞生成，對治療心肌梗死有良好效果[8]，其提取物對痤瘡丙酸桿菌和脂多糖誘導的急性肝損傷也有顯著作用[9]。2002年，中國衛(wèi)生部又公布金櫻子為可用于保健食品的原料[10]。另外還有研究證明，金櫻子的果實中含有豐富的黃酮、金櫻子多糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)不但可以起到明顯的清除自由基、抗炎的作用，而且可以提高機體免疫力。所以金櫻子被廣泛應用于保健食品和醫(yī)藥領域，具有廣闊的市場前景。

多糖是金櫻子的重要營養(yǎng)成分之一，對于金櫻子多糖的研究越來越多，也證明了其活性和作用。張庭廷等[11]研究證明了金櫻子多糖對于常見細菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有很強的抗菌活性，且對二甲苯引起小鼠的毛細血管通透性增強等炎癥有顯著的抑制作用。研究還發(fā)現(xiàn)金櫻子多糖具有調(diào)節(jié)血脂、降血膽固醇、抗氧化、抗病毒等作用，臨床上對普通感冒、燙傷燒傷、直腸壁下移及各種婦科疾病等取得較好的治療效果[12，13]。目前，國內(nèi)外學者對金櫻子多糖的藥理作用、化學成分研究的比較深入，而對于其提取純化工藝的研究還處于初級階段，提取工藝仍有很多不足，如提取效率較低、操作成本較高、控制條件嚴苛等。因此，優(yōu)化金櫻子多糖提取工藝，降低成本、簡化操作，同時保證金櫻子多糖的質(zhì)量，是目前研究金櫻子多糖提取工藝的目標。endprint

金櫻子多糖為大分子化合物，易溶于水，通常采用水提醇沉法[14]、堿提取法[15]、酸提取法[16]，但前者所用時間較長，提取率也不高；而后兩者由于多糖不耐酸堿，會使部分多糖分解，所以也存在一定的不足?，F(xiàn)發(fā)展出用超聲波和微波輔助多糖提取法，微波輔助提取法節(jié)省溶劑、用時短、提取率高[17，18]。文全泰等[19]利用纖維素酶提取金櫻子多糖，正交設計優(yōu)化的酶解法在一定程度上提高了多糖的提取率，但成本太高，對于溫度的控制要求也嚴格。潘廷啟等[20]利用超聲波輔助提取金櫻子多糖，不僅增加了提取率、縮短了提取時間，還避免了高溫對提取成分的影響。試驗證明，超聲波輔助法用于提取多糖能夠明顯提高多糖的提取率，提取時間短，可以簡化提取流程、減少雜質(zhì)、節(jié)約成本，在實際操作中具有很大的優(yōu)點。本研究采用響應面試驗確定微波輔助法浸漬提取工藝中各因素的最佳參數(shù)，旨在為大規(guī)模工業(yè)化提取金櫻子多糖提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金櫻子：產(chǎn)地山東，購于山東聊城市利民大藥店；苯酚、硫酸、甲醇等試劑均為分析純；葡萄糖；去離子水。

1.2 儀器與設備

微波合成/萃取工作站（上海新儀微波化學科技有限公司）、TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、電子天平（奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司）、超聲波清洗器、循環(huán)水式多用真空泵、100 mL微波儀專用三頸燒瓶、10 mL容量瓶、100 mL容量瓶。

1.3 試驗方法

1.3.1 金櫻子多糖成分的提取方法

1）金櫻子多糖提取工藝流程：干燥的金櫻子→粉碎后過20目篩→用去離子水浸泡提取→微波提取→抽濾→濾液進行定容→測定吸光度[21]。

2）金櫻子多糖提取操作要點：將干燥的金櫻子樣品用中藥粉碎機進行粉碎，然后過20目篩。稱取粉碎過篩后的樣品2.000 0 g，加入100 mL微波儀專用燒瓶中，最后加入一定料液比的去離子水，浸泡12 h后，在設定參數(shù)下進行微波提取，提取后進行抽濾，得到的濾液用去離子水定容到100 mL容量瓶中，搖勻。取上述溶液0.1 mL加入10 mL刻度試管中，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度到99 ℃，將試管放入水浴鍋中將水分蒸干，加甲醇1 mL溶解備用。

1.3.2 定量分析

1）標準曲線制備：葡萄糖于105 ℃下干燥至恒重，并準確稱取36.6 mg，于100 mL容量瓶中，去離子水溶解并定容、搖勻，得到葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，然后分別加入去離子水補至2 mL，然后再分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，在40 ℃水浴鍋中水浴15 min，然后用冷水冷卻10 min，同時以2.0 mL去離子水為空白，用分光光度計測定標準溶液在波長480 nm下的吸光度并記錄，得到標準曲線方程C=19.800A-0.857 3，相關(guān)系數(shù)r=0.992[22]。

2）金櫻子多糖提取液的測定：采用苯酚-硫酸法，精密吸取樣品溶液1.0 mL置于100 mL容量瓶中，并加水稀釋定容，再吸取1 mL到另一100 mL容量瓶中。然后精密量取1 mL置于10 mL容量瓶中，加去離子水補至2 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，在40 ℃水浴鍋中水浴15 min，然后用冷水冷卻10 min，同時以2.0 mL去離子水為空白，用分光光度計測定標準溶液在波長480 nm下的吸光度并記錄，多糖提取率用以下公式計算：

1.3.3 單因素試驗

1）微波時間對金櫻子多糖提取率的影響。準確稱取2.00 g金櫻子粉末置于100 mL微波儀專用三頸燒瓶中，固定微波功率為400 W，料液比為1∶20（g∶mL，下同），提取次數(shù)為1次。在微波中加熱回流，微波時間分別為1、2、3、4、5、6 min。按照上述條件和步驟分別提取。

2）微波功率對金櫻子多糖提取率的影響。準確稱取2.00 g金櫻子粉末置于100 mL微波儀專用三頸燒瓶中，固定微波時間為3 min，料液比為1∶20，提取次數(shù)為1次。在微波中加熱回流，微波功率分別為100、200、300、400、500、600、700 W。按照上述條件和步驟分別提取。

3）料液比對金櫻子多糖提取率的影響。準確稱取2.00 g金櫻子粉末置于100 mL微波儀專用三頸燒瓶中，固定微波時間為3 min，微波功率為400 W，提取次數(shù)為1次。在微波中加熱回流，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。按照上述條件和步驟分別提取。

4）提取次數(shù)對金櫻子多糖提取率的影響。準確稱取2.00 g金櫻子粉末置于100 mL微波儀專用三頸燒瓶中，固定微波時間為3 min，微波功率為400 W，料液比為1∶20。在微波中加熱回流，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次。按照上述條件和步驟分別提取。

1.3.4 響應面試驗 根據(jù)單因素試驗和金櫻子多糖常規(guī)提取方法選定微波時間、料液比、微波功率作為考察的因素，固定提取次數(shù)為1次，以單因素試驗為基礎，采用三因素三水平響應面法（表1），對金櫻子多糖的微波提取進行分析優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助法提取金櫻子多糖的單因素試驗

2.1.1 微波時間對金櫻子多糖提取率的影響 由圖1可以看出，起初延長加熱時間可以促進多糖的溶解，4 min左右多糖提取率達到最高值，繼續(xù)加熱，由于易發(fā)生多糖水解，導致提取率下降，從節(jié)約能源、保證金櫻子多糖質(zhì)量方面考慮，微波時間在4 min左右為宜。

2.1.2 微波功率對金櫻子多糖提取率的影響 由圖2可以看出，在微波功率為400 W時多糖的提取率最大。由于多糖在提取過程中可以發(fā)生水解反應，且微波容易破壞生物質(zhì)，從而改變多糖的性質(zhì)，因此試驗功率在400 W左右，可得到提取率較高的多糖。endprint

2.1.3 料液比對金櫻子多糖提取率的影響 由圖3可以看出，料液比對金櫻子多糖提取率具有明顯影響，隨著料液比增加，多糖擴散溶解速度加快，但料液比過大會導致后續(xù)蒸發(fā)時間過長。由圖3可知，隨著料液比的增大，提取率緩慢增加，但到達1∶25時基本達到最大，繼續(xù)增加則提取率變化不穩(wěn)定，所以料液比以1∶25左右為宜。

2.1.4 提取次數(shù)對金櫻子多糖提取率的影響 由圖4可以看出，隨著提取次數(shù)的增多能增加金櫻子多糖的提取總量，在提取兩次后，提取率已接近一常數(shù)，但從節(jié)省能耗、簡化操作以及減少提取時間等方面考慮，提取次數(shù)取1次為宜[23，24]。

2.2 微波輔助法提取金櫻子多糖的響應面試驗

由以上單因素試驗影響結(jié)果分析，固定提取次數(shù)為1次，選取微波時間、料液比和微波功率為影響金櫻子多糖提取率的3個因素，根據(jù)Box.Benhnken的中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上進行三因素三水平響應面試驗。

對微波時間、料液比、微波功率作如下變換X1=（t-4）/1，X2=（z-25）/5，X3=（w-400）/100，在試驗設計與結(jié)果中，其中析因試驗為1～12，中心試驗為13～15，以校正試驗結(jié)果、減少試驗誤差。式中t、z、w分別表示微波時間、料液比、微波功率的真實值，采用SAS RSREG程序進行響應面分析試驗，試驗設計與結(jié)果如表2所示。

使用The SAS System 8.0程序?qū)憫蹬c各因素進行回歸擬合，分析試驗結(jié)果得到其響應面與等高線，見圖5～圖7。

由圖5可知，當微波功率一定時，提取率隨微波時間與料液比的變化趨勢明顯，先升高后降低，達到最高點后明顯下降。

由圖6可知，當料液比一定時，提取率隨微波時間與微波功率的變化趨勢明顯，先升高后降低，達到最高點后明顯下降。

由圖7可知，當微波時間一定時，提取率隨料液比與微波功率的變化趨勢明顯，先升高后降低，達到最高點后明顯下降。

由表3可知，回歸模型也是顯著的。該模型相關(guān)系數(shù)R2=98.32%，說明該模型與實際試驗擬合度較高。因此，回歸方程可以較好地描述料液比、微波時間和微波功率對多糖提取率的實際影響，可利用回歸方程確定最佳工藝條件。

回歸方程：Y1=0.521-0.024 375X1+0.038 5X2+0.077 875X3-0.037 5X12-0.002 25X1X2-0.023 5X1X3-0.056 25X22+0.037 25X2X3-0.141X32。對回歸方程取一階偏導數(shù)等于零，整理可得如下三式：

0=-0.024 375-2×0.037 5X1-0.002 25X2-0.023 5X3

（1）

0=0.038 5-0.002 25X1-2×0.056 25X2+0.037 25X3

（2）

0=0.077 875-0.023 5X1+0.037 25X2-2×0.141X3

（3）

式（1）、（2）、（3）聯(lián)立方程組，解得X1=-0.457 49，X2=0.476 263，X3=0.377 187，代入前述的變換公式得到，微波時間t=3.542 5 min，料液比z=1∶27.381 3，微波功率w=437.718 7 W，將所得值修正即得多糖提取工藝最佳條件為料液比1∶27，微波功率438 W，微波時間提取3.5 min，提取1次。在此修正條件下，實際測得提取率為52.0%。

2.3 驗證試驗

由響應面試驗結(jié)果分析可以得到，微波輔助法提取金櫻子多糖成分的最佳工藝條件為料液比 1∶27，微波功率438 W，微波時間提取3.5 min，提取1次。為進一步精確試驗結(jié)果進行驗證試驗，獲得吸光度，按照公式計算得到，在此條件下金櫻子多糖成分的3次平均提取率為51.9%。

3 結(jié)論

采用微波輔助提取方法，用去離子水為溶劑提取金櫻子中多糖成分，并以多糖成分提取率為考察指標，通過單因素試驗和響應面試驗來探討和優(yōu)化金櫻子多糖的提取工藝，最后得出金櫻子多糖的最佳提取工藝條件為微波時間3.5 min，微波功率438 W，料液比為1∶27，浸提1次。在此提取工藝條件下，金櫻子多糖實際一次提取率可達52.0%。但其含量測定方法是用的紫外分光光度計法，因試驗試劑欠缺，此方法測定含量結(jié)果偏低，不過在一定程度上能反映多糖的含量[26]。

參考文獻：

[1] 劉學貴，李佳駱，高品一，等.藥食兩用金櫻子的研究進展[J].食品科學，2013，34（11）：392-398.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3] 李時珍.本草綱目（下冊）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1978.

[4] 江蘇新醫(yī)學院.中藥大字典（上冊）[M].上海：上海人民出版社，1977.

[5] 陳 泰，趙 鳳.野生植物金櫻子的生物學特性及開發(fā)利用[J].生物學雜志，1996（5）：26-27.

[6] 顧志平，張曙明，劉 東.金櫻子資源的開發(fā)利用[J].中國野生植物資源，1994（4）：30-33.

[7] 王進義，張國林，程東亮，等.中藥金櫻子的化學成分[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，13（1）：21-22.

[8] QU H Y，F(xiàn)ENG Z，LI Z Y，et al. Induction of substantial myocardial regeneration by an active fraction of the Chinese herb Rosa laevigata Michx.[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine，2015，15（1）：1-11.endprint

[9] HE R R，YAO X S，YAO N，et al. Protective effects of radix Rosa laevigata against propionibacterium acnes and lipopolysaccharide-induced liver injury[J].Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，2009，73（5）：1129-1136.

[10] 凌關(guān)庭.保健食品原料手冊[M].第二版.北京：化學工業(yè)出版社，2006.

[11] 張庭廷，潘繼紅，聶劉旺，等.金櫻子多糖的抑菌和抗炎作用研究[J].生物學雜，2005，22（2）：41-42.

[12] 張庭延，聶劉旺，劉愛民，等.金櫻子多糖的免疫活性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2005，11（4）：55-58.

[13] 趙云濤，國興明，李付振，等.金櫻子多糖的抗氧化作用[J].云南中醫(yī)藥雜志，2003，24（4）：35-37.

[14] 黃 森，查學強，羅建平，等.Box-Behnken法優(yōu)化提取霍山石斛活性多糖的研究[J].中藥材，2007，30（5）：591-594.

[15] 吳 瓊，鄭 成，寧正祥，等.堿溶性銀耳粗多糖的提取及其清除自由基作用的研究[J].食品科學，2007，28（6）：153-155.

[16] 劉貝貝，李小定，潭正林，等.菜籽餅粕中多糖的酸提取工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2006，22（11）：213-216.

[17] GUJAR J，WAGH S J，GAIKAR V G. Experimental and modeling studies on microwave-assisted extraction of thymol from seeds of Trachyspermum ammi（TA）[J].Separation and Purification Technology，2010，70：257-264.

[18] 王洪新，王遠輝.山藥多糖研究進展[J].食品與生物技術(shù)學報，2011，30（3）：321-327.

[19] 文全泰，潘廷啟，顏祖弟，等.正交設計優(yōu)化金櫻子多糖的酶提取工藝[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2012，9（11）：27-29.

[20] 潘廷啟，文全泰，肖林彬，等.正交設計優(yōu)化金櫻子多糖的超聲提取工藝[J].右江民族醫(yī)學院學報，2012（4）：465-467.

[21] 吳 艷，艾連中，STEVE W C，等.微波輔助提取胖大海多糖的工藝研究[J].食品工業(yè)，2007（1）：45-47.

[22] 薛 梅，王魯石，杜 華，等.金櫻子中總黃酮的提取及含量測定[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2003，17（5）：16.

[23] 曾慶華，樊 琛，孫小凡，等.響應面法優(yōu)化紅景天中紅景天苷超聲波-微波協(xié)同提取工藝[J].食品工業(yè)科技，2013，20（34）：270-274.

[24] 紀耀華，紀躍芝，馬愛民，等.微波法提取大黃多糖最佳工藝優(yōu)化研究[J].中藥材，2009，32（8）：1291-1293.

[25] 劉軍海，黃寶旭，許恩慶.桑葉多糖提取工藝研究[J].中國食品添加劑，2009（5）：90-95.

[26] 王 艷，張鐵軍.微波萃取技術(shù)在中藥有效成分提取中的應用[J].中草藥，2005，36（3）：470-473.endprint