3種方法治療腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘大鼠對(duì)腸道菌群的影響

付 雯，劉興隆，張瓏瓊，高永翔

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 610075)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.007

3種方法治療腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘大鼠對(duì)腸道菌群的影響

付 雯，劉興隆，張瓏瓊，高永翔△

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 610075)

目的根據(jù)“肺與大腸相表里”的理論，為肺腸合治法治療腸道菌群失調(diào)并過敏性哮喘提供理論依據(jù)。方法實(shí)驗(yàn)共分了空白組、模型組、陽性組和3種中藥復(fù)方的給藥組；采用頭孢哌酮加白色念珠菌灌胃SD大鼠的方式復(fù)制腸道菌群失調(diào)，并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用卵清清蛋白注射致敏與霧化誘發(fā)哮喘，霧化同時(shí)分別給予加味升降散、桂枝加厚樸杏子湯和增液承氣湯藥液從肺腸合治、治肺和治腸進(jìn)行治療；采用Buxco全身體積描記系統(tǒng)分析呼吸功能，通過16SrDNA分析腸道菌群的變化。結(jié)果根據(jù)OTU值分析各組腸道菌群物種組成發(fā)現(xiàn)，各組對(duì)乳酸桿菌的恢復(fù)接近空白組且優(yōu)于陽性組，3個(gè)治療組均可促進(jìn)變形菌門和擬桿菌門菌群的恢復(fù)，但肺腸合治效果最佳，通過Alpha 多樣性分析發(fā)現(xiàn)腸道微生物菌群多樣性從高到低分別是治腸組、治肺組、肺腸合治組、模型組；呼吸頻率和氣道高反應(yīng)性模型組為260.56(1.28)，治療后肺腸合治組、治肺組和治腸組分別為141.79(0.93)、137.25(1.30)和203.16(0.84)，各治療組大鼠呼吸頻率均低于模型組，而氣道高反應(yīng)性只有肺腸合治組和治腸組低于模型組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論肺腸合治法治療腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘大鼠在肺功能和腸道菌群恢復(fù)上優(yōu)于單純治腸或治肺法。

哮喘；腸道菌群；中醫(yī)治療學(xué)

過敏性哮喘(allergic asthma)是由多種細(xì)胞特別是肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥[1]。大量研究表明哮喘患者的腸道菌群多樣性均發(fā)生變化，提示過敏性哮喘與腸道菌群的多樣性關(guān)系密切[2-3]；臨床研究也發(fā)現(xiàn)，在利用常規(guī)手段治療過敏性哮喘患者同時(shí)調(diào)節(jié)患者的腸道菌群，恢復(fù)腸道微生態(tài)，可提高過敏性哮喘的治療效果，而且復(fù)發(fā)率更低[4]。中醫(yī)認(rèn)為：“肺與大腸相表里，肺病及腸，腸病亦可及肺”[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明肺與腸關(guān)系密切，并且二者均參與了公共黏膜免疫系統(tǒng)的構(gòu)成。因此，本研究基于“肺與大腸相表里”的理論，筆者提出在治法上分別從肺腸合治、治肺、治腸治療腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘大鼠，研究3種治法對(duì)模型大鼠腸道菌群和呼吸功能的影響，為中醫(yī)治療腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，購于簡陽達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(M)2008-15(川)。SD大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)大鼠塑料籠中，動(dòng)物自由進(jìn)食及飲用生活飲用水。動(dòng)物房溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，空氣流通。

1.2儀器與試劑 頭孢哌酮(華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)PC5130301)；枯草芽孢桿菌二聯(lián)活菌(后簡稱媽咪愛，北京韓美藥品有限公司，批號(hào)20131250)；氨茶堿(西南藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20140302)；QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qtagen，批號(hào)145050844)；白色念珠菌(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)A0081B)；ELISA Kit for sIgA(上海一研生物科技有限公司，批號(hào)LOT201411)。

1.3各組處理方案及模型構(gòu)建方法

1.3.1空白組 適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，以無菌水代替生活飲用水，生理鹽水代替卵清清蛋白(OVA)進(jìn)行灌胃、注射致敏和霧化吸入。

1.3.2模型組 適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，給予SD大鼠0.5 g/L的頭孢哌酮水溶液，自由飲用，連續(xù)處理5 d。第6天將生活飲用水換成無菌水，同時(shí)單次灌胃109cfu/mL的白色念珠菌50 μL，使其定植腸道，以進(jìn)一步加重腸道菌群失調(diào)。將配制好的OVA凝膠致敏劑，分別于第0天和第7天于大鼠雙側(cè)胸部和腹股溝共4點(diǎn)皮下注射各0.15 mL，同時(shí)腹腔注射0.40 mL，共1.00 mL。第14天開始將大鼠置于10 cm×10 cm×20 cm有機(jī)玻璃盒內(nèi)，超聲霧化吸入1% OVA以誘發(fā)哮喘，每天1次，每次30 min，連續(xù)7 d。

1.3.3陽性組 造模后從激發(fā)當(dāng)天開始以媽咪愛+氨茶堿灌胃，連續(xù)7 d。

1.3.4給藥組 造模后，從激發(fā)當(dāng)天開始3種方藥根據(jù)成人每日中藥的服用量，依據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》人和鼠之間體積比換算系數(shù)進(jìn)行換算，以換算后的劑量灌胃大鼠，連續(xù)7 d。各組藥物具體灌胃方案見表1(人體質(zhì)量按60 kg計(jì)算)。

表1 各組處理方案

1.4藥物制備及給藥方法

1.4.1桂枝加厚樸杏子湯 治腸組采用桂枝加厚樸杏子湯，桂枝9 g，炙厚樸6 g，杏仁6 g，白芍9 g，炙甘草6 g，生姜9 g，大棗3枚。

1.4.2增液承氣湯 治肺組采用增液承氣湯，玄參30 g，麥冬(連心)24 g，細(xì)生地24 g，大黃9 g，芒硝4.5 g。

1.4.3加味升降散 肺腸合治組采用加味升降散，炒僵蠶10 g，蟬衣6 g，姜黃10 g，酒大黃10 g，炙麻黃6 g，苦杏仁10 g，黃芩10 g，厚樸10 g。以上藥物均購于成都市北京同仁堂藥房，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李敏教授鑒定為正品，熬制成每1 mL藥液含生藥1 g的濃縮液，高溫滅菌后冷藏備用。

1.5大鼠腸道16SrDNA的檢測 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，每組均取6只動(dòng)物，根據(jù)QIAamp DNA Stool Handbook操作說明提取糞便DNA，每個(gè)樣本DNA各取20 μL混合均勻。將提取的基因組DNA 送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司，分析3個(gè)樣本的腸道菌群的物種基因組成。

1.6大鼠呼吸功能測定 利用Buxco動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)進(jìn)行測定。

1.7肺組織標(biāo)本的病理切片分析 處死大鼠，迅速沿正中線打開胸腔，取下右肺下葉，固定好肺組織并用石蠟進(jìn)行包埋。最后進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色處理。

1.8支氣管肺泡灌洗液(BALF)、腸黏膜sIgA的檢測 提取BALF和腸黏膜黏液，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測sIgA水平。

2 結(jié) 果

2.1大鼠呼吸功能測定 模型組大鼠的呼吸頻率顯著高于空白組和陽性組(P<0.01)；但對(duì)于氣道高反應(yīng)性指標(biāo)而言，3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 大鼠呼吸頻率和氣道高反應(yīng)性比較

*：P<0.05，**：P<0.01，與空白組比較；▲▲：P<0.01，與陽性組比較

2.2BALF細(xì)胞的EOS計(jì)數(shù) 模型組BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞(3.36±0.43)顯著高于空白組(1.66±0.33)和陽性組(1.0±0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表3。

A：空白組；B：模型組；C：陽性組；編號(hào)1代表放大倍數(shù)100倍，編號(hào)2代表放大倍數(shù)400倍

圖1肺組織HE染色觀察

2.3肺組織HE染色觀察 空白組大鼠(圖1A)的肺組織未見明顯炎性細(xì)胞；模型組(圖1B)肺組織中可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤，同時(shí)氣管壁增厚伴氣管管腔縮小。陽性組大鼠的肺組織(圖1C)炎性細(xì)胞明顯少于模型組，但比空白組仍有較多炎性細(xì)胞，氣管管壁增厚的狀態(tài)有所緩解。

2.4BALF和腸黏膜的sIgA水平 模型組BALF中的sIgA水平顯著低于空白組(P<0.05)；同時(shí)腸黏膜中sIgA的水平模型組顯著低于空白組、陽性組(P<0.01、P<0.05)，見表3。

表3 BALF和腸黏膜中sIgA的水平(n=8)

*：P<0.05，**：P<0.01，與空白組比較，▲：P<0.05，與陽性組比較

2.5大鼠腸道16SrDNA的分析

2.5.1OTU及其豐度分析 各處理組內(nèi)的物種豐度可通過OTU初步反映。模型組腸道菌群的物種豐度分別比治腸組和治肺組低10.82%和13.6%，但高于肺腸合治組。

2.5.2物種及其豐度分析 將不同樣品的物種根據(jù)OTU值，按照門、綱、目、科、屬進(jìn)行分類，并跟數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，做出各樣品物種profiling的柱狀圖。模型組的腸道乳酸桿菌比治腸組、治肺組和肺腸合治組分別低86.88%、77.2%和74.69%，而且3個(gè)治療組跟陽性組相比，分別高了82.7%、82.6%和80.72%；模型組的變形菌門數(shù)量比治腸組、治肺組和肺腸合治組分別低13.4%、29.69%和80.4%，見圖2。

圖2 各處理組在各分類等級(jí)上的物種profiling柱狀圖

2.5.3樣品復(fù)雜度分析 (1)單個(gè)樣品復(fù)雜性分析：模型組物種多樣性最低，各治療組的物種多樣性從高到低分別是治腸組、治肺組、肺腸合治組，見表4。(2)不同樣品物種組成聚類分析：在物種組成相似性上，肺腸合治組、治肺組和模型組最接近，陽性組和治腸組則跟模型組距離稍遠(yuǎn)，空白組距離其他5組均較遠(yuǎn)。

2.6大鼠呼吸功能測定 呼吸頻率空白組為(119.07±19.41)次，模型組(260.56±36.94)次，陽性組(153.05±14.65)次，肺腸合治組(141.79±28.88)次，治肺組(137.25±26.37)次，治腸組(203.16±17.52)次。各治療組大鼠呼吸頻率均顯著低于模型組(P<0.01)，而且治肺組與肺腸合治組跟空白組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。氣道高反應(yīng)性空白組0.95±0.21，模型組1.28±0.09，陽性組1.07±0.11，肺腸合治組0.93±0.12，治肺組1.3±0.44，治腸組0.84±0.16，肺腸合治組和治腸組均低于模型組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 樣品Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果

observed species、chao、ace指數(shù)：反映樣品中群落的豐富度； shannon、simpson指數(shù)：反映群落的多樣性

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)分別從肺腸合治、治肺和治腸三個(gè)角度利用加味升降散、桂枝加厚樸杏子湯、增液承氣湯治療腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘大鼠。選方依據(jù)：桂枝加厚樸杏子湯首載于《傷寒論·辨太陽病脈證并治》第18條“喘家作，桂枝湯，加厚樸、杏子佳”與第43條“太陽病，下之，微喘者，表未解故也，桂枝加厚樸杏子湯主之?！贝朔绞侵嗅t(yī)“傷寒論”中治療哮喘病癥的經(jīng)典方之一，同時(shí)已有許多研究表明此方可以治療哮喘。廖偉平[6]利用加減該方的方法治療變異型哮喘患者35例，試驗(yàn)結(jié)果表明治療組顯效率88.6%，對(duì)照組(常規(guī)西藥)顯效率53.3%；而1年后復(fù)發(fā)率治療組為14.3%，對(duì)照組為40.0%，可見該方治療效果顯著優(yōu)于對(duì)照組，因此作為從肺治療的方藥；《溫病條辨·中焦篇》第17條指出：“陽明溫病，下之不通，其證有五……津液不足，無水舟停者，間服增液，再不下者，增液承氣湯主之。”增液承氣湯具有滋陰增液，泄熱痛便的功效。肖陽娥等[7]利用該方治療40例慢性呼吸衰竭患者發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)治療組有效率達(dá)到82.5%，而對(duì)照組僅56.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。王愛華[8]利用該方治療喘證患者，發(fā)現(xiàn)患者服用10劑后即康復(fù)。根據(jù)“肺與大腸相表里”理論，增液承氣湯可以承氣清熱、增液益津，從而達(dá)到化痰降氣平喘的功效，因此作為從腸治肺的方藥；升降散源于明代醫(yī)家張鶴騰編著的《傷暑全書》，后得清代醫(yī)家楊粟山發(fā)揮載于《傷寒瘟疫條辨》[9]。該方以僵蠶為君，蟬蛻為臣，姜黃為佐，大黃為使，米酒為引，蜂蜜為導(dǎo)。魯恒心[10]研究發(fā)現(xiàn)利用升降散加減治療咳嗽變異型哮喘38例，有效率高達(dá)92.11%；靳文學(xué)等[11]利用加味升降散治療過敏性哮喘豚鼠，結(jié)果表明加味升降散可下調(diào)哮喘豚鼠肺內(nèi)sIgA的高免疫狀態(tài)。筆者在主方基礎(chǔ)上，加了炙麻黃、苦杏仁、黃芩和厚樸。麻黃和杏仁加強(qiáng)了該方的升降作用；黃芩清肺解毒，泄肺之郁熱；厚樸下氣平喘，通暢腑氣，作為肺腸合治的方藥。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有治療組腸道菌群中正常菌群的數(shù)量均有不同程度的提高，有害菌群數(shù)量降低，但是對(duì)于腸道微生物菌群多樣性的恢復(fù)，治腸組優(yōu)于其他兩組。但肺腸合治組對(duì)變形菌門和擬桿菌門的恢復(fù)效果最佳，說明肺腸合治法對(duì)于腸道優(yōu)勢菌種的恢復(fù)比單純治腸法更有優(yōu)勢。升降散的應(yīng)用目前國內(nèi)主要集中在呼吸道疾病或外感發(fā)熱等疾病上[12-13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方對(duì)腸道菌群的恢復(fù)具有療效，還可應(yīng)用于腸道疾病的治療。

對(duì)于改善過敏性哮喘的典型癥狀呼吸頻率和氣道高反應(yīng)性而言，3組均能有效地降低呼吸頻率，但只有肺腸合治組對(duì)氣道高反應(yīng)性也有比較好的改善作用，說明肺腸合治法在對(duì)過敏性哮喘呼吸功能的恢復(fù)上優(yōu)于單純治肺法和單純治腸法。這與國內(nèi)其他學(xué)者利用肺腸合治法治療過敏性哮喘的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[14]。

綜上所述，肺腸合治的治療方法對(duì)于治療腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘大鼠在肺功能和腸道菌群恢復(fù)上都具有明顯的優(yōu)勢和療效，可作為治療該病的首選治療方案，為中醫(yī)治療腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。治腸方在腸道菌群多樣性的恢復(fù)上具有明顯優(yōu)勢，而且治肺組對(duì)腸道致病菌梭狀芽孢桿菌的抑制作用最優(yōu)，因此可通過重新配伍的方法找到一個(gè)更優(yōu)的肺腸合治方。

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Influenceofthreedifferenttherapeuticmethodsonintestinalfloraintreatingratintestinaldysbacteriosiscomplicatingallergicasthma*

FuWen,LiuXinlong,ZhangLongqiong,GaoYongxiang△

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China)

ObjectiveTo provide a theoretical basis for the pulmonary enteric therapy in treating intestinal dysbacteriosis complicating allergic asthma according to the traditional theory of "Lung and Large intestine are interiorly-exteriorly".MethodsThe experiment included the blank group,model group,positive control group and three kinds of traditional Chinese medicine compound administration group;the intestinal dysbacteriosis in SD rats was duplicated by adopting cefoperazone and candida albicans gavage.On this basis ovalbumin injection sensitization and nebulization were applied to induce asthma.Meanwhile Jia-Wei-Sheng-Jiang Powder(SJS),Guizhi-Jia-Houpu-Xingzi Decoction(GHX) and Zeng-Ye-Cheng-Qi Decoction(ZYCQ) were orally administered for treatment of lung-intestine combine therapy,lung therapy and intestine therapy.The respiratory function was analyzed by using the Buxco whole body plethysmography.The variety of intestinal flora were analyzed by using 16SrDNA.ResultsAnalyzing the specieces composition of intestinal flora in each group by the OUT value found that the recovery of Lactobacillus in each group was close to that in the blank group and better than that in the positive group,meanwhile,3 treatment groups all could promote the recovery of Proteobacteria and bacteroidetes,but the lung-intestine combine therapy had optimal effect,the Alpha diversity analysis found that the intestinal microflora diversities from high to low were in turn the intestinal therapy group,lung therapy group,lung-intestine combined therapy group and model group;the respiratory frequency and airway hyperreactivity in the model group was 260.56(1.28),which in the lung-intestine combined therapy group,lung therapy and intestine therapy after treatment were 141.79(0.93),137.25(1.30)and 203.16(0.84)respectively, the rat respiratory frequency in each treatment group was lower than that in the model group,while the airway hyperreactivity only in the lung-intestine combined therapy group and intestinal therapy group was lower than that in the model group,moreover showing statistical significance.ConclusionThe lung-intestine combine therapy method for treating rat intestinal dysbacteriosis complicating allergic asthma is superior to simple lung therapy method or intestine therapy method.

asthma;intestinal microflora;therapeutics

R256.12

A

1671-8348(2017)25-3477-03

2016-12-22

2017-07-10)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81303085)；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目(ZRYY1620)。

付雯(1983-)，博士，講師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究。

△通信作者，E-mail:406084191@qq.com。