清氣化痰湯對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響

陳 竹，彭 玉，龐 平，楊見輝，羅貞清

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院兒科，貴陽 550001)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.006

清氣化痰湯對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響

陳 竹，彭 玉，龐 平，楊見輝，羅貞清

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院兒科，貴陽 550001)

目的觀察清氣化痰湯對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和肺組織炎性反應(yīng)的干預(yù)作用。方法將45只BALB/c小鼠分為正常對(duì)照組(CON組)、哮喘模型組(MOD組)、地塞米松組(TRE組)、清氣化痰湯組(X1組)、清氣化痰湯聯(lián)合地塞米松組(X2組)。通過卵清清蛋白和氫氧化鋁凝膠進(jìn)行致敏和霧化建立哮喘小鼠模型。取支氣管肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及觀察肺組織病理變化。結(jié)果與CON組比較，MOD組BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多，TRE組、X1組、X2組BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯減少，TRE組和X2組治療后第15天與第5天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；各治療組均能減輕小鼠肺組織病理炎性浸潤，減少肺大泡產(chǎn)生、氣道上皮增厚，X2組炎癥損傷輕。結(jié)論清氣化痰湯能減輕氣道炎癥，改善模型小鼠的肺組織炎性反應(yīng)。

哮喘；炎癥;清氣化痰湯

哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，其以氣道炎、氣道高反應(yīng)性、氣道重塑為特征[1]。哮喘是一個(gè)全球性的疾病，其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢[2]。兒童是哮喘的高發(fā)人群，我國第3次全國兒科哮喘流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全國0～14歲兒童哮喘患病率為0.42%～5.73%，平均為3.02%，較10年前增加了53.3%[3]。很多研究證實(shí)哮喘的發(fā)生及嚴(yán)重程度與嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥有關(guān)[4]。清氣化痰湯是全國名老中醫(yī)黃建業(yè)教授治療哮喘痰熱壅肺的經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效確切。本研究通過建立哮喘小鼠模型，觀察清氣化痰湯對(duì)哮喘模型小鼠肺部炎癥和肺組織病理炎性損傷的影響，探討其對(duì)哮喘的防治作用，為臨床推廣名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方及進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，SPF級(jí)[合格證號(hào)SYXK(黔)2012-001]，購自貴州省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程中心。

1.2儀器與試劑 2%氫氧化鋁凝膠購自Invivo Gen公司；卵清清蛋白(OVA)購自Sigma公司；注射用地塞米松磷酸鈉購自馬鞍山豐原制藥有限公司，每支5 mg(批號(hào)150512-1)。蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Masson 染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3藥物 清氣化痰湯由膽南星、全瓜蔞、法夏、浙貝、枳殼、陳皮、茯苓、杏仁等10味中藥組成。

1.4方法

1.4.1造模方法 第1、8、15天腹腔注射OVA及氫氧化鋁凝膠混合液0.2 mL(內(nèi)含OVA 60 μg及2.25 mg氫氧化鋁凝膠)致敏；第21天開始用5% OVA溶液8 mL行超聲霧化，每次30 min，連續(xù)霧化5 d進(jìn)行激發(fā)，建立動(dòng)物模型。CON組用生理鹽水代替OVA進(jìn)行致敏和霧化。每天觀察小鼠一般情況，并稱取各組小鼠的體質(zhì)量。

1.4.2分組及給藥 將45只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組9只：(1)正常對(duì)照組(CON組)，用生理鹽水代替OVA進(jìn)行致敏和霧化，不給藥；(2)哮喘模型組(MOD組)，按1.4.1方法進(jìn)行致敏和激發(fā)，不給藥；(3)地塞米松組(TRE組)，按1.4.1方法進(jìn)行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg)；(4)清氣化痰湯組(X1組)，按1.4.1方法進(jìn)行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min灌胃給予中藥0.3 mL；(5)清氣化痰湯聯(lián)合地塞米松組(X2組)，按1.4.1方法進(jìn)行致敏和激發(fā)，于每次激發(fā)前30 min灌胃給予中藥0.3 mL，腹腔注射地塞米松(0.25 mg/kg)，每天1次，連續(xù)15 d。1 mL藥液相當(dāng)于 5.4 g生藥。

1.4.3BALF細(xì)胞計(jì)數(shù) 于治療后第5、15天每組各處死小鼠3只，同時(shí)從氣管注射無菌生理鹽水0.5 mL入肺，抽吸3次后將抽出液體即支氣管肺泡灌洗液(BALF)凍存于-20 ℃；取150 μL BALF細(xì)胞懸液與細(xì)胞計(jì)數(shù)液按1∶1稀釋混勻，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，余下BALF 4 ℃、2 000 r/min離心10 min，取沉淀物涂片，瑞氏染色后在顯微鏡下觀察，每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共觀察10個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.4.4肺組織病理觀察 處死小鼠后，取右肺置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，HE染色，每張切片隨機(jī)選取左、右、上、中、下5個(gè)視野，觀察各組小鼠肺組織病理變化。

2 結(jié) 果

2.1小鼠一般情況及體質(zhì)量觀察 (1)在致敏階段，各組小鼠一般情況均較好，無明顯差別；開始激發(fā)后，MOD、TRE、X1組和X2組小鼠均出現(xiàn)煩躁、精神萎靡、進(jìn)食減少等變化，各組間無明顯差異。(2)MOD組小鼠體質(zhì)量較CON組下降，其他治療組小鼠體質(zhì)量介于二者之間(圖1)。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化

2.2各組小鼠BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 與CON組比較，MOD組BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多(P<0.05)；TRE組治療后第5天與第15天BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯差異(P>0.05)；X1組在治療15 d后BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較治療第5天時(shí)明顯減少，其治療效果有明顯差異(P<0.05)；X2組治療后第5天與第15天BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較也有明顯差異(P<0.05)；3個(gè)治療組中X2組治療5 d與15 d后BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)下降最為顯著(表1)。

表1 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

#：P<0.01，與CON組比較；*：P<0.05,**：P<0.01，與MOD組比較

A：CON組;B：MOD組;C：TRE組;D：X1組;E：X2組

圖2治療5 d后各實(shí)驗(yàn)組肺組織病理變化(HE×200)

A：CON組;B：MOD組;C：TRE組;D：X1組;E：X2組

圖3治療15 d后各實(shí)驗(yàn)組肺組織病理變化(HE×200)

2.3肺組織病理觀察 (1)治療5 d后肺組織病理觀察：CON組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡、小血管、支氣管等結(jié)構(gòu)完整，氣管壁和肺泡周圍無炎癥細(xì)胞浸潤；MOD組肺組織中肺大泡形成，肺充血，肺泡內(nèi)出現(xiàn)泡沫樣滲出物，間質(zhì)水腫，可見淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，肺組織中氣道上皮增厚，管腔狹窄，肺間質(zhì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞浸潤；TRE和X1組肺泡間質(zhì)炎癥較重，肺泡間隔增寬，可見淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)可見炎性滲出物；X2組小鼠肺部炎癥減輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)可見少量淋巴細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞浸潤(圖2)。(2)治療15 d后肺組織病理觀察：CON組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡、小血管、支氣管等結(jié)構(gòu)完整，氣管壁和肺泡周圍無炎性浸潤；MOD組小鼠肺組織炎癥減輕，部分可見肺充血，肺泡內(nèi)出現(xiàn)泡沫樣滲出物，間質(zhì)水腫，可見淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，肺組織中氣道上皮增厚，管腔狹窄，肺間質(zhì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞浸潤；TRE和X1組肺泡間質(zhì)仍有炎癥，肺泡間隔增寬，可見淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)可見炎性滲出物；X2組小鼠肺部炎癥進(jìn)一步減輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)可見少量淋巴細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞浸潤(圖3)。

3 討 論

祖國醫(yī)學(xué)中雖沒有支氣管哮喘的病名，但在《素問·逆調(diào)論》、《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣篇》已經(jīng)有類似哮喘的記載，《諸病源侯論·咳嗽病諸侯》就提出“呷嗽者，猶是咳嗽也，其胸膈痰飲多者，嗽則氣動(dòng)于痰，上搏咽喉之間，痰氣相擊，隨嗽動(dòng)息，呀呷有聲，謂之呷嗽”，所描述癥狀與支氣管哮喘相符。兒童哮喘的發(fā)病率高與兒童的生理病理密切相關(guān)。小兒肺臟嬌嫩，脾常不足，腎常虛。人體水液的正常代謝為肺脾腎三臟所司，若三臟功能失調(diào)，則致水液代謝失常，痰濁內(nèi)生。如因外邪犯肺或感觸異物、吸入異氣，肺治節(jié)無權(quán)，水津失于輸布，凝液為痰；兒童脾常不足，脾虛不能為胃行其津液，運(yùn)化失司，濕聚為痰，上貯于肺；腎氣虛衰，不能蒸化水液，也能使水濕上泛為痰。臨床不論何種證型均表現(xiàn)為咳嗽氣喘，喉間痰鳴。中醫(yī)認(rèn)為痰易生并伏儲(chǔ)于氣道是哮喘發(fā)作的病理基礎(chǔ)，痰易生難消成為治療哮喘的一個(gè)難點(diǎn)。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)哮喘病因病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，推測哮喘“痰飲伏肺”的中醫(yī)病理特征與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)哮喘氣道炎癥、氣道重塑存在必然的聯(lián)系[5]。

清氣化痰湯是本院國家級(jí)名老中醫(yī)黃建業(yè)教授治療痰熱咳喘的經(jīng)驗(yàn)方，由膽南星、全瓜蔞、法夏、浙貝、枳殼、陳皮、茯苓、杏仁等10味中藥組成。膽南星、全瓜蔞共為君藥，可疏泄實(shí)痰實(shí)火之壅閉，寬胸散結(jié)，達(dá)到清化肺內(nèi)痰熱，理氣止咳目的。法夏為辛溫之品，與苦寒之黃芩、浙貝相配共為臣藥，一化痰散結(jié)，一清熱降火，既相輔、相制又相成；佐以杏仁降利肺氣以宣上，枳殼、陳皮理氣化痰以寬胸；茯苓健脾滲濕以杜生痰之源；焦楂消積以助脾運(yùn)。全方具有清熱化痰、止咳平喘的作用。

本研究采用藥物激發(fā)制造小鼠哮喘模型，在進(jìn)行激發(fā)后除CON組小鼠外，其余各組小鼠均出現(xiàn)煩躁、精神萎靡、進(jìn)食減少、體質(zhì)量下降等變化，尤其是MOD組小鼠體質(zhì)量持續(xù)下降明顯。提示哮喘作為一個(gè)慢性氣道炎癥，可對(duì)患者的精神及體格生長造成影響，這對(duì)處于生長發(fā)育時(shí)期的兒童危害更大。大量研究表明，炎癥在哮喘的發(fā)病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，肺組織的嗜酸性粒細(xì)胞能夠介導(dǎo)氣道高反應(yīng)性、氣道重塑等病理改變[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)TRE組在治療后5 d BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較X1組低，但組內(nèi)比較，治療5 d與15 d后BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯差異，說明激素治療在疾病早期可較快抑制炎性反應(yīng)，但隨著治療時(shí)間的延長其治療效果并未明顯增強(qiáng)。X1組在治療5 d后雖然BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)都較TRE組高，但在治療15 d后其治療效果有明顯差異，上述數(shù)值均隨著藥物持續(xù)給予逐漸下降，接近激素治療效果，說明清氣化痰湯在抑制炎癥介質(zhì)釋放方面雖然起效慢，但隨著治療時(shí)間的延長治療效果逐漸增強(qiáng)。X2組在治療5 d與15 d BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于TRE、X1組，且組內(nèi)比較有明顯差異，提示清氣化痰湯與激素在減少炎癥介質(zhì)釋放、控制炎性反應(yīng)方面有協(xié)同治療作用。

氣道的炎癥和氣道功能受損，二者存在密切聯(lián)系，支氣管氣道的炎癥主要表現(xiàn)在嗜酸細(xì)胞的增多及浸潤，而支氣管氣道功能受損主要表現(xiàn)為上皮結(jié)構(gòu)和功能改變[9]。本研究建立的哮喘模型均出現(xiàn)了氣道炎癥和功能的受損。有研究指出氣道結(jié)構(gòu)和功能的改變是支氣管哮喘病理改變的核心環(huán)節(jié)，氣道上皮可以促使Th2細(xì)胞因子表達(dá)增加[10]，這些細(xì)胞因子對(duì)成熟嗜酸細(xì)胞具有趨化和激活作用，直接參與了哮喘的發(fā)病和氣道炎癥的形成[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)X1組的病理改變輕，無肺大泡、氣道上皮未增厚，說明清氣化痰湯的治療作用不僅是抑制嗜酸細(xì)胞等炎癥介質(zhì)的釋放還在維護(hù)氣道上皮的完整性、調(diào)節(jié)免疫方面有積極作用。X2組小鼠肺組織病理示炎癥較X1、TRE組輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)僅見少量淋巴細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞浸潤。說明清氣化痰湯在減輕小鼠肺組織炎癥浸潤方面療效與激素相似，并且在與激素聯(lián)合使用時(shí)能明顯修復(fù)肺組織的病理損傷。

通過研究證實(shí)，清氣化痰湯治療哮喘、減輕咳喘痰鳴癥狀的作用機(jī)制是抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減少肺組織中炎性滲出，減輕肺組織損傷。但清氣化痰湯與激素聯(lián)合使用能更好地保護(hù)肺組織的機(jī)制，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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EffectofQingqihuatanDecoctiononpulmonaryinflammationinasthmaticmouse*

ChenZhu，PengYu，PangPing，YangJianhui，LuoZhengqing

(DepartmentofPediatrics,SecondClinicalMedicalCollege,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550001，China)

ObjectiveTo observe the interventional effect of Qingqihuatan Decoction on airway inflammation and inflammatory reaction of lung tissue in asthmatic mouse.MethodsForty-five BALB/c mice were randomly divided into the normal control group(CON),asthmatic model group(MOD),dexamethasone group(TRE),Qingqihuatan Decoction group(X1) and Qingqihuatan Decoction combined dexamethasone group(X2).The asthmatic mouse model was established by the sensitization and inhalation of OVA and aluminium hydroxide gel.The bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was performed the cell counts and eosinophil counts,and the pathological changes of lung tissue were observed.ResultsCompared with CON group,BALF cell count and eosinophil count in the model group were increased obviously,which in the treatment group were significantly decreased.The effect of the X1 group and X2 group had statistical difference between on 5 d and 15 d.(P<0.05 orP<0.01);the treatment groups could reduce the pathogenical infiltration,lung bullae production and airway epithelial thickening of mouse lung tissue,especially the inflammation damage in X2 group was mild.ConclusionQingqihuatan Decoction can relieve the airway inflammation and improves the lung tissue inflammatory response in model mouse.

asthma;inflammation;Qingqihuatan Decoction

R272

A

1671-8348(2017)25-3473-04

2016-12-18

2017-06-06)

貴州省科學(xué)技術(shù)資金資助項(xiàng)目(黔科合LH字[2014]7314號(hào))；貴州省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(gzwjkj2014-2-124)。

陳竹(1976-)，碩士，副教授，主要從事兒童呼吸系統(tǒng)疾病的中西醫(yī)結(jié)合防治研究。