負(fù)壓創(chuàng)面治療術(shù)對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞遷移行為的影響

李曉明，劉 蘋，汪 超，楊佳佳，姚仕采，張 波△

(1．第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，重慶 400042；2．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院PICU/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.003

負(fù)壓創(chuàng)面治療術(shù)對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞遷移行為的影響

李曉明1，劉 蘋1，汪 超2，楊佳佳1，姚仕采2，張 波1△

(1．第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，重慶 400042；2．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院PICU/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014)

目的探討負(fù)壓創(chuàng)面治療術(shù)(NPWT)對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞(ADSCs)遷移行為的影響。方法8頭體質(zhì)量為(20±2) kg巴馬小香豬，分別接受假手術(shù)(A組，n=16)、持續(xù)負(fù)壓吸引(B組，n=8)和間歇負(fù)壓吸引(C組，n=8)，治療72 h后觀察3個(gè)月。細(xì)胞水平觀察NPWT對(duì)ADSCs遷移行為的影響，提取大鼠ADSCs，采用8 h持續(xù)負(fù)壓吸引和間歇負(fù)壓作用于ADSCs，Transwell檢測(cè)ADSCs遷移能力，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Western blot法檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)的表達(dá)。結(jié)果B組和C組創(chuàng)面愈合效果明顯優(yōu)于A組；與A組比較，B、C組ADSCs細(xì)胞遷移數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，而細(xì)胞增殖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HIF-1α表達(dá)與ADSCs細(xì)胞遷移結(jié)果一致。結(jié)論NPWT通過上調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)大鼠ADSCs遷移。

負(fù)壓創(chuàng)面治療術(shù)；脂肪干細(xì)胞；遷移

創(chuàng)面難愈是目前醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，尤其是糖尿病足、壓迫性潰瘍等癥狀，嚴(yán)重影響著人們的健康。負(fù)壓創(chuàng)面治療術(shù)(negative-pressure wound therapy,NPWT)作為一種加快患者創(chuàng)面愈合的新方法，多應(yīng)用于難愈性創(chuàng)面的治療并在臨床治療中取得了很好的療效，但其作用機(jī)制尚不明確[1-2]。脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)具有多向分化潛能、取材方便、來源充足等優(yōu)點(diǎn)，被稱為修復(fù)治療中的“種子細(xì)胞”，有研究表明，局部移植ADSCs可有效促進(jìn)皮膚創(chuàng)面組織修復(fù)[3-5]。因此，假設(shè)NPWT可通過上調(diào)ADSCs遷移，進(jìn)而促進(jìn)皮膚創(chuàng)面組織修復(fù)，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)主要目的在于觀察NPWT對(duì)大鼠ADSCs遷移行為的影響，進(jìn)一步探討NPWT促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制，以便更好地將NPWT應(yīng)用于難愈性創(chuàng)面相關(guān)疾病的研究及治療。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8頭巴馬小香豬，雌雄不限，體質(zhì)量(20±2)kg；10只雌性3月齡SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g。動(dòng)物由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(渝)2012-0010。

1.2儀器與試劑 儀器主要包括組織勻漿器(德國Miltenyi)，8 MV Precise醫(yī)用直線加速器(瑞典Elekta)，負(fù)壓引流儀(山東威高)，低溫離心機(jī)(美國Thermo)，電泳儀(美國Bio-Rad)，凝膠成像儀(美國Bio-Rad)，核酸蛋白定量?jī)x(美國Thermo)。試劑主要包括BSA(武漢博士德生物)，MTT(美國Hyclone)，結(jié)晶紫(成都科龍)，0.4 μm Transwell小室(美國Corning)，蛋白酶抑制劑(美國Roche)，cDNA試劑盒(大連寶生物)，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α)抗體(北京博奧森)，GAPDH抗體(北京博奧森)，辣根過氧化物酶山羊抗兔(聯(lián)科生物)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore)，增強(qiáng)型ECL顯色液(美國Thermo)，BCA試劑盒(碧云天)。

1.3方法

1.3.1分組及難愈性創(chuàng)面模型制備 小香豬在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，10 mg/kg氯胺酮快速麻醉，5～10 min后肌內(nèi)注射0.5 mg/kg地西泮和25 mg/kg阿托品，后續(xù)視動(dòng)物麻醉情況按0.2 g/kg肌內(nèi)注射追加15 g/L戊巴比妥鈉。將小香豬背部剃毛，采用直線加速器照射脊柱兩側(cè)4 cm區(qū)域，創(chuàng)面照射劑量20 Gy。備皮打孔，形成直徑4 cm、深度為0.8 cm皮膚全層缺損。每頭小香豬單側(cè)2個(gè)創(chuàng)面，共4個(gè)創(chuàng)面，一側(cè)作為對(duì)照組接受假手術(shù)(A組，n=16)，另一側(cè)分別接受120 mm Hg持續(xù)負(fù)壓吸引(B組，n=8)和120 mm Hg間歇負(fù)壓吸引(C組，n=8)治療72 h后，觀察3個(gè)月。

1.3.2ADSCs分離與培養(yǎng) 采用0.5 mL/100 g肌肉注射速眠新對(duì)SD大鼠進(jìn)行麻醉；用剃毛器去除腹股溝表皮毛發(fā)，局部消毒，切開皮膚，取皮下脂肪組織；用生理鹽水和PBS液沖洗脂肪組織塊3次，以洗去血跡；采用組織剪將組織塊攪碎，呈糊狀；將濃度為0.075%的2～3倍體積Ⅰ型膠原酶加入攪碎的組織塊中消化60～90 min；然后用50目的濾網(wǎng)過濾脂肪組織，濾液進(jìn)行1 000 r/min離心10 min；棄上清液，得到的細(xì)胞沉淀用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基溶液重懸；調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中；37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每3天換1次液，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)用 0.25%胰酶消化傳代，隔天換液；倒置相差顯微鏡觀察記錄培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。本課題組前期工作已對(duì)該方法提取的ADSCs進(jìn)行了鑒定，因此本文未進(jìn)行進(jìn)一步探討[6]。

1.3.3Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，將Transwell上室加入20 000個(gè)細(xì)胞，下室加入含1%血清培養(yǎng)基，使用不同負(fù)壓模式作用于Transwell小室。在孵箱中靜置8 h后，使用棉球輕輕將膜上層未遷移過去的細(xì)胞擦掉，倒置晾干；使用0.1%結(jié)晶紫室溫染色30 min；細(xì)胞進(jìn)行染色后用PBS清洗，晾干；在顯微鏡下挑選5個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)。

1.3.4細(xì)胞活性檢測(cè) 將細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，按一定密度接種至24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，使用PBS清洗并加入無血清培養(yǎng)基，置于孵箱內(nèi)孵育8 h后，將每孔中分別加入60 μL 的MTT溶液，然后置于孵箱中孵育4 h后輕輕吸掉培養(yǎng)基，再在孔中分別加入300 μL DMSO，置于搖床上搖5 min；在490 nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A)值。

1.3.5Western blot檢測(cè) 收集蛋白樣品，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白上樣量為每孔20 μg，電泳過程中，跑60 V濃縮膠盡量保持1 h以上，110 V分離膠大概所需2.5 h，待溴酚藍(lán)跑至底部后，暫停電泳儀；200 mA下持續(xù)100 min電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5% BSA溶液中封閉1 h，TBST洗滌3次，將PVDF膜置于含有HIF-1α(1∶1 000)、GAPDH抗體(1∶1 000)的5% BSA中，4 ℃搖床孵育過夜，次日加入HRP抗體室溫孵育2 h，顯影。用Image J軟件(美國國立衛(wèi)生研究院)進(jìn)行灰度分析，結(jié)果以目的蛋白與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)平均吸光度值的比值表示。

2 結(jié) 果

2.1NPWT對(duì)難愈性創(chuàng)面愈合的影響 NPWT治療難愈性創(chuàng)面72 h后，A組肉芽組織較晦暗，B組和C組肉芽組織鮮紅，呈細(xì)顆粒狀。治療21 d后A組創(chuàng)面大小未見明顯變化，B組和C組創(chuàng)面明顯收縮，且C組愈合程度優(yōu)于B組，見圖1。

A1～C1：負(fù)壓吸引72 h后小香豬創(chuàng)面圖；A2～C2：負(fù)壓吸引21 d后小香豬創(chuàng)面圖(A1、A2為對(duì)照組，B1、B2為持續(xù)負(fù)壓吸引組，C1、C2為間歇負(fù)壓吸引組)

圖1不同NPWT模式對(duì)難愈性創(chuàng)面愈合的影響

2.2NPWT對(duì)大鼠ADSCs遷移行為的影響 采用Transwell法檢測(cè)不同負(fù)壓創(chuàng)面治療模式作用ADSCs 8 h后遷移變化情況，結(jié)果顯示：B組、C組與A組相比，ADSCs細(xì)胞遷移數(shù)量增加且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；B組與C組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且遷移數(shù)量低于C組，見表1、圖2。

A：對(duì)照組；B：持續(xù)負(fù)壓吸引組；C：間歇負(fù)壓吸引組

圖2不同NPWT模式對(duì)大鼠ADSCs遷移行為的影響(×100)

A：對(duì)照組；B：持續(xù)負(fù)壓吸引組；C：間歇負(fù)壓吸引組

圖3不同NPWT模式對(duì)大鼠ADSCs增殖行為的影響

2.3NPWT對(duì)大鼠ADSCs增殖行為的影響 采用MTT法檢測(cè)不同負(fù)壓創(chuàng)面治療模式作用ADSCs 8 h后細(xì)胞增殖變化情況，結(jié)果顯示：B組、C組與A組之間ADSCs細(xì)胞增殖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖3。

2.4Western blot檢測(cè)大鼠ADSCs HIF-1α表達(dá) 經(jīng)與內(nèi)參GAPDH對(duì)比后，B組(0.62±0.09)、C組(1.39±0.27)與A組(0.47±0.07)相比HIF-1α表達(dá)增加且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；B組與C組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且HIF-1α表達(dá)低于C組，見圖4。

表1 不同NPWT模式對(duì)大鼠ADSCs遷移、增殖行為的影響

a：P<0.05，b：P<0.01，與A組比較；c：P<0.01，與C組比較

A：對(duì)照組；B：持續(xù)負(fù)壓吸引組；C：間歇負(fù)壓吸引組

圖4 HIF-1α在ADSCs中的表達(dá)

3 討 論

NPWT是近年來創(chuàng)立并開展的創(chuàng)面治療新方法，被廣泛應(yīng)用于各種急性或慢性復(fù)雜難愈性創(chuàng)面，我國最早由裘華德教授引進(jìn)并改良后應(yīng)用于骨科和普通外科患者。NPWT可避免化學(xué)藥物治療可能引起的不良反應(yīng)，較常規(guī)開放式換藥，具有創(chuàng)面愈合快、感染率低、更換敷料次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，但其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的確切作用機(jī)制尚未完全清楚[1,7]。NPWT可分為持續(xù)負(fù)壓吸引、間歇負(fù)壓吸引及變壓負(fù)壓吸引，目前臨床常采用持續(xù)負(fù)壓吸引，這種治療模式的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單方便、易操作，而歐美負(fù)壓創(chuàng)傷治療學(xué)會(huì)的基礎(chǔ)理論研究顯示：間歇負(fù)壓吸引更加有利于肉芽組織再生，加速創(chuàng)傷愈合過程，本研究采用不同負(fù)壓吸引模式治療結(jié)果顯示，間歇負(fù)壓吸引組創(chuàng)面愈合效果明顯優(yōu)于對(duì)照組和持續(xù)負(fù)壓吸引組，這與同類型研究結(jié)果相吻合[8-9]。

ADSCs作為一種存在于人或動(dòng)物不同部位脂肪組織中的“種子細(xì)胞”，可明顯加快全程皮膚組織切除后的創(chuàng)面愈合及糖尿病創(chuàng)面等難愈創(chuàng)面的修復(fù)，此外，ADSCs在創(chuàng)面局部微環(huán)境下可以誘導(dǎo)分化為創(chuàng)面修復(fù)所必需的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)層細(xì)胞[10-11]。盡管ADSCs在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮著極其重要的作用，但ADSCs異體或自體移植仍面臨生物安全性等諸多問題，且該細(xì)胞的遷移能力差，因此尋找合適的方式提高ADSCs的遷移能力和修復(fù)功能顯得至關(guān)重要[10]。HIF-1α是缺氧環(huán)境密切相關(guān)的蛋白，其介導(dǎo)的缺氧信號(hào)傳導(dǎo)是調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的重要機(jī)制，相關(guān)研究證實(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)變化與ADSCs細(xì)胞遷移能力關(guān)系密切[12]，而NPWT能誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)上調(diào)[13]，由此推斷NPWT可通過增加HIF-1α蛋白水平表達(dá)促進(jìn)ADSCs遷移，進(jìn)而加速皮膚創(chuàng)面組織修復(fù)，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間。

本研究通過采用持續(xù)負(fù)壓吸引和間歇負(fù)壓吸引兩種不同NPWT模式治療小香豬難愈性創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)不同負(fù)壓吸引模式在創(chuàng)面愈合過程中存在著差異，且間歇負(fù)壓吸引更加有利于創(chuàng)面組織修復(fù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)負(fù)壓吸引組、間歇負(fù)壓吸引組與對(duì)照組相比ADSCs細(xì)胞遷移數(shù)量增加，且間歇負(fù)壓吸引組優(yōu)于持續(xù)負(fù)壓吸引組；為排除因細(xì)胞增殖而導(dǎo)致的遷移差異，采用MTT觀察遷移過程中ADSCs生物活性，結(jié)果顯示持續(xù)、間歇負(fù)壓吸引均對(duì)ADSCs細(xì)胞增殖無顯著影響。分析負(fù)壓吸引后蛋白表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，間歇負(fù)壓吸引可增加HIF-1α蛋白水平表達(dá)，以往有研究證實(shí)，HIF-1α受氧分壓的調(diào)控，能在缺氧條件下穩(wěn)定表達(dá)[14]。

綜上所述，本研究揭示了NPWT通過上調(diào)HIF-1α蛋白水平表達(dá)，誘導(dǎo)ADSCs細(xì)胞遷移，進(jìn)而調(diào)控創(chuàng)面修復(fù)。NPWT促進(jìn)ADSCs細(xì)胞遷移可能成為創(chuàng)面修復(fù)潛在治療靶點(diǎn)，為NPWT用于難愈性創(chuàng)面治療的深入研究提供理論依據(jù)。

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Effectofnegative-pressurewoundtherapyonadipose-derivedstemcellsmigrationbehavior*

LiXiaoming1,LiuPing1,WangChao2,YangJiajia1,YaoShicai2,ZhangBo1△

(1．InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042;2．PediatricIntensiveCareUnitAffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity/KeyLaboratoryofChildDevelopmentalDiseases,MinistryofEducation,Chongqing400014,China)

ObjectiveTo investigate the effect of negative-pressure wound therapy (NPWT) on the migration behavior of rat adipose-derived stem cells (ADSCs).MethodsEight(20±2)kg Bama miniature pigs respectively received the sham operation (group A,n=16),continuous negative pressure suction (group B,n=8) and intermittent negative pressure suction (group C,n=8).The pigs were observed for 3 months after 72 h treatment.The effect of NPWT on the migration behavior of ADSCs was observed at the cellular level.In order to avoid the influence of serum-free on cell viability,ADSCs were extracted and treated with continuous negative pressure suction or intermittent negative pressure suction for 8 h.The migration ability of ADSCs was detected by transwell.The proliferation ability of ADSCs was detected by MTT.The expression of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) was detected by Western blot.ResultsThe wound healing effect of continuous negative pressure suction group and intermittent negative pressure suction group was better than that of the control group,and compared with the control group,the number of migrating ADSCs cells had statistically significant difference (P<0.05,P<0.01),but cell proliferation had no statistically significant difference.The expression of HIF-1α was consistent with the migration results of ADSCs.ConclusionNPWT can promote the migration of rat ADSCs by up-regulating HIF-1α protein expression.

negative-pressure wound therapy;stem cells;migration

R649.9

A

1671-8348(2017)25-3463-03

2017-01-18

2017-06-06)

中國科學(xué)院-威高集團(tuán)高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(ZKYWG2013-05)

李曉明(1988-)，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事創(chuàng)傷修復(fù)、再生醫(yī)學(xué)研究。

△通信作者，E-mail:zhangbo67184@163.com。