中華蜜蜂幼蟲(chóng)腸道響應(yīng)球囊菌早期脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)

陳大福，郭睿，熊翠玲，梁勤，鄭燕珍，徐細(xì)建，張曌楠，黃枳腱，張璐，王鴻權(quán)，解彥玲，童新宇

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中華蜜蜂幼蟲(chóng)腸道響應(yīng)球囊菌早期脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)

陳大福，郭睿，熊翠玲，梁勤，鄭燕珍，徐細(xì)建，張曌楠，黃枳腱，張璐，王鴻權(quán)，解彥玲，童新宇

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

【目的】白堊病是困擾養(yǎng)蜂生產(chǎn)的頑疾。目前，尚無(wú)利用二代測(cè)序技術(shù)研究中華蜜蜂（,簡(jiǎn)稱中蜂）幼蟲(chóng)白堊病的報(bào)道。本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)健康（AcCK）及球囊菌()脅迫的中蜂4日齡幼蟲(chóng)腸道（AcT）進(jìn)行深度測(cè)序，在轉(zhuǎn)錄組水平研究中蜂幼蟲(chóng)在球囊菌脅迫早期的脅迫應(yīng)答?！痉椒ā客ㄟ^(guò)Illumina HiSeq 2500平臺(tái)對(duì)AcCK和AcT進(jìn)行雙端（PE125）測(cè)序，首先對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和評(píng)估，利用edgeR軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEG）分析，進(jìn)而對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析及KEGG代謝通路富集分析，最后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性?！窘Y(jié)果】 AcCK和AcT的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共得到188 457 338條原始讀段（raw reads）, 經(jīng)過(guò)濾得到182 088 448條有效讀段（clean reads），兩端Q20與Q30均在97.96%和94.97%以上，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好；主成分分析（PCA）結(jié)果顯示第一與第二主成分可分別解釋基因表達(dá)總體差異的75.8%和10.7%；DEG分析結(jié)果顯示上調(diào)基因與下調(diào)基因的數(shù)量分別為344和239個(gè)；GO富集分析結(jié)果顯示DEGs共富集在36個(gè)GO分類（term）上，其中基因富集數(shù)最多的細(xì)胞（106 unigenes）、細(xì)胞組件（106 unigenes）和代謝進(jìn)程（104 unigenes）；KEGG代謝通路富集分析結(jié)果顯示上調(diào)與下調(diào)基因分別富集在72個(gè)和45個(gè)代謝通路上，其中上調(diào)基因富集數(shù)最多的是核糖體（72 unigenes）、碳代謝（16 unigenes）和糖酵解（14 unigenes），而下調(diào)基因富集數(shù)最多的是碳代謝（9 unigenes）、二羧酸代謝（8 unigenes）和氨基酸生物合成（7 unigenes），進(jìn)一步分析表明中蜂幼蟲(chóng)腸道的部分細(xì)胞免疫對(duì)球囊菌的脅迫產(chǎn)生應(yīng)答，而體液免疫不產(chǎn)生應(yīng)答，宿主的代謝相關(guān)基因受到球囊菌的顯著抑制。【結(jié)論】揭示了中蜂幼蟲(chóng)在球囊菌入侵早期的脅迫應(yīng)答，為深入解析中蜂幼蟲(chóng)的脅迫應(yīng)答機(jī)制提供了重要信息，也為在分子水平研究關(guān)鍵應(yīng)答基因打下了基礎(chǔ)。

中華蜜蜂；幼蟲(chóng)腸道；球囊菌；轉(zhuǎn)錄組；RNA-seq

0 引言

【研究意義】蜜蜂作為一種社會(huì)學(xué)模式昆蟲(chóng)，對(duì)發(fā)育學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、行為學(xué)和病原-宿主互作等研究有重要價(jià)值[1-5]。蜜蜂也是最重要的授粉昆蟲(chóng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、糧食安全和生態(tài)維持中也發(fā)揮著巨大作用[6]。白堊病是球囊菌（）特異性侵染蜜蜂幼蟲(chóng)的致死性真菌病，長(zhǎng)期困擾養(yǎng)蜂生產(chǎn)，每年給養(yǎng)蜂業(yè)造成巨大損失。近年來(lái)，隨著蜂產(chǎn)品全球貿(mào)易的快速發(fā)展，白堊病呈逐年上升趨勢(shì)[7]。有關(guān)白堊病的研究主要集中于西方蜜蜂（）幼蟲(chóng)，但關(guān)于西方蜜蜂幼蟲(chóng)響應(yīng)球囊菌脅迫的應(yīng)答研究報(bào)道極少，目前尚無(wú)球囊菌侵染東方蜜蜂（）幼蟲(chóng)過(guò)程中的應(yīng)答機(jī)制研究，也無(wú)防治白堊病的有效方法。【前人研究進(jìn)展】國(guó)內(nèi)養(yǎng)蜂生產(chǎn)中使用的主要蜂種是意大利蜜蜂（，簡(jiǎn)稱意蜂）和中華蜜蜂（，簡(jiǎn)稱中蜂），二者分別屬于西方蜜蜂和東方蜜蜂。意蜂極易暴發(fā)白堊病，但中蜂極少受到該病的影響。近20年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)白堊病開(kāi)展了一系列研究，主要集中在病原分類鑒定[8-9]、形態(tài)學(xué)[10-11]、病理學(xué)[12-13]、流行病學(xué)[14]、侵染過(guò)程[15-16]、蜜蜂防御[17-18]以及疾病防治[19]等方面。筆者課題組也在球囊菌的病理和檢測(cè)方面開(kāi)展了較為系統(tǒng)的研究[20-24]。2006年，基因組信息的公布[25]為其分子生物學(xué)研究奠定了重要基礎(chǔ)。Evans等[26]在蜜蜂細(xì)胞內(nèi)鑒定出了大多數(shù)NF-B信號(hào)通路中的基因，如的2個(gè)同系物，但都不與直系同源，表明是僅存在于果蠅的特化分支而不存在于其他昆蟲(chóng)；Aronstein等[27]利用cDNA-AFLP對(duì)健康及球囊菌感染西方蜜蜂幼蟲(chóng)進(jìn)行了測(cè)序比較，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因（DEGs）參與了能量代謝和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，其中的類幾丁質(zhì)編碼基因很可能參與了宿主對(duì)球囊菌的抵抗；Cornman等[28]利用RNA-seq技術(shù)對(duì)幼蟲(chóng)芽孢桿菌（）感染后12 h和72 h的蜜蜂幼蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)序，鑒定出75個(gè)顯著上調(diào)和6個(gè)顯著下調(diào)基因，其中若干編碼抗菌肽基因和2個(gè)編碼圍食膜基質(zhì)基因顯著上調(diào)；Julie等[29]通過(guò)RNA-seq研究了東方蜜蜂微孢子蟲(chóng)（）和殺蟲(chóng)劑單獨(dú)或共同飼喂意蜂后中腸的轉(zhuǎn)錄組變化，發(fā)現(xiàn)和殺蟲(chóng)劑并無(wú)協(xié)同效應(yīng)，長(zhǎng)期暴露于殺蟲(chóng)劑環(huán)境抑制了意蜂的免疫基因的表達(dá)。2015年，韓國(guó)研究人員測(cè)序并公布了的基因組[30]，但當(dāng)時(shí)并未公布基因位置和功能注釋信息。為深入開(kāi)展中蜂的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，筆者課題組前期已組裝并注釋了中蜂幼蟲(chóng)腸道的參考轉(zhuǎn)錄組[31]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，偶爾可見(jiàn)中蜂幼蟲(chóng)罹患白堊病的現(xiàn)象，前期研究發(fā)現(xiàn)中蜂幼蟲(chóng)可在實(shí)驗(yàn)室條件下被球囊菌侵染。白堊病研究基本都集中于球囊菌侵染西方蜜蜂幼蟲(chóng)，有關(guān)球囊菌侵染中蜂幼蟲(chóng)的相關(guān)研究幾乎沒(méi)有。本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)健康及球囊菌脅迫的中蜂幼蟲(chóng)腸道進(jìn)行深度測(cè)序，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄組水平研究宿主球囊菌入侵早期的脅迫應(yīng)答?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以健康及球囊菌脅迫的中蜂4日齡幼蟲(chóng)腸道作為研究對(duì)象，通過(guò)Illumina測(cè)序技術(shù)研究中蜂幼蟲(chóng)腸道在球囊菌入侵早期的脅迫應(yīng)答，為深入解析中蜂幼蟲(chóng)響應(yīng)球囊菌脅迫的應(yīng)答機(jī)制及關(guān)鍵應(yīng)答基因的功能研究提供重要信息。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年12月至2016年8月在福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院蜜蜂保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料

中蜂幼蟲(chóng)取自福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院教學(xué)蜂場(chǎng)，球囊菌菌株由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院蜜蜂保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并活化。

高碘酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DNaseI和Oligotex mRNA Kits Midi試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，Dynal M280磁珠購(gòu)自Invitrogen公司，DNA ligase購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，RNA Reagent抽提試劑盒、Ex Taq polymerase及Superscript II reverse transcriptase均購(gòu)自日本TaKaRa公司，純化cDNA的Ampure beads為美國(guó)Agencourt產(chǎn)品，cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒TruSeqTMDNA Sample Prep Kit -Set A為美國(guó)Illumina公司產(chǎn)品，RNase-free水購(gòu)自中國(guó)上海生工生物公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，倒置顯微鏡為中國(guó)上海光學(xué)儀器五廠產(chǎn)品，超凈工作臺(tái)為中國(guó)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品，恒溫恒濕氣候箱購(gòu)自中國(guó)寧波江南儀器廠，pH計(jì)購(gòu)自中國(guó)上海儀電科學(xué)股份有限公司，超純水儀購(gòu)自中國(guó)四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司，凝膠成像系統(tǒng)為中國(guó)上海培清科技有限公司產(chǎn)品，PCR儀為美國(guó)Bio Rad公司產(chǎn)品，超低溫冰箱為中國(guó)中科美菱公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 球囊菌活化、孢子純化及計(jì)數(shù) 將4℃保存的球囊菌培養(yǎng)皿置于已紫外滅菌的超凈臺(tái)，用酒精燈上灼燒片刻的鑷子夾取少量菌絲在平板中央2 cm左右圓心區(qū)域內(nèi)劃線操作，蓋上培養(yǎng)皿，置于37℃生化箱恒溫培養(yǎng)，3 d后觀察球囊菌生長(zhǎng)情況。接種8—10 d以后，待培養(yǎng)皿上黑色孢子較多時(shí)，刮取孢子至干凈的EP管中，用研磨棒充分研磨，按照J(rèn)ensen等[32]的方法離心純化球囊菌孢子，梯度稀釋后用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 中蜂幼蟲(chóng)的人工飼養(yǎng)及腸道樣品準(zhǔn)備 按照已報(bào)道的飼料配方[33]配制中蜂幼蟲(chóng)飼料并進(jìn)行改良，預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示中蜂幼蟲(chóng)的7日齡成活率可達(dá)70%以上。從學(xué)院教學(xué)蜂場(chǎng)群勢(shì)較強(qiáng)的健康中蜂蜂群（無(wú)白堊病癥狀且PCR鑒定為陰性）移取2日齡幼蟲(chóng)至無(wú)菌的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔對(duì)應(yīng)1只幼蟲(chóng)，孔內(nèi)加有35℃預(yù)溫的幼蟲(chóng)飼料），35℃，相對(duì)濕度70%條件下飼養(yǎng)。每隔24 h更換飼料。處理組3日齡幼蟲(chóng)飼喂含球囊菌孢子的人工飼料（孢子終濃度1×107個(gè)/mL），對(duì)照組3日齡幼蟲(chóng)飼喂正常飼料。飼喂孢子后24 h，分別剖取處理組（AcT）和對(duì)照組（AcCK）4日齡幼蟲(chóng)腸道組織，每剖取一只幼蟲(chóng)腸道，迅速將腸道移至RNA Free的EP管，再投入液氮速凍，待一組腸道樣品（7只幼蟲(chóng)腸道）集齊后，迅速轉(zhuǎn)移保存于-80℃。本試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。AcCK與AcT的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別為AcCK-1、AcCK-2、AcCK-3和AcT-1、AcT-2、AcT-3。因幼蟲(chóng)腸道是球囊菌的寄生場(chǎng)所，而本文旨在對(duì)中蜂幼蟲(chóng)在球囊菌脅迫早期的應(yīng)答進(jìn)行研究，故選取4日齡幼蟲(chóng)腸道作為測(cè)序?qū)ο蟆?/p>

1.2.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建及Illumina測(cè)序 利用RNAiso Reagent試劑盒抽提處理組和對(duì)照組中蜂幼蟲(chóng)腸道組織的總RNA，然后用RNase-free DNaseI去除基因組DNA殘留。RNA的質(zhì)量通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000（NanoDrop，Wilmington，DE，USA）進(jìn)行檢測(cè)。利用Oligotex mRNA Kits Midi試劑盒說(shuō)明書(shū)，純化各樣品總RNA中的mRNA。以10 μg mRNA作為模板，GsuI-oligo dT作為反轉(zhuǎn)錄引物，用1000 U Superscript II reverse transcriptase在42℃下孵育1 h合成第1鏈cDNA；隨后利用高碘酸鈉氧化mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)，并連接生物素；通過(guò)Dynal M280磁珠篩選連接了生物素的mRNA/cDNA，并通過(guò)堿裂解釋放第1鏈cDNA；然后通過(guò)DNA ligase在第1鏈cDNA的5′末端加上接頭，利用Ex Taq polymerase 合成第2鏈cDNA。最后，通過(guò)I酶切去除polyA和5′端接頭。利用Ampure beads對(duì)上述cDNA進(jìn)行純化，cDNA文庫(kù)通過(guò)TruSeqTMDNA Sample Prep Kit-Set A進(jìn)行構(gòu)建和TruSeq PE Cluster Kit進(jìn)行擴(kuò)增。上述6個(gè)幼蟲(chóng)腸道樣品委托廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq2500。本研究測(cè)得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已上傳美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，SRA號(hào)：SRA456721。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 對(duì)于下機(jī)數(shù)據(jù)，利用Perl腳本去除含有adaptor、未知核苷酸比例大于5%和低質(zhì)量reads，獲得有效讀段（clean reads）。利用R軟件（version 2.16.2）進(jìn)行測(cè)序飽和度分析。使用短reads比對(duì)工具bowtie[34]將clean reads比對(duì)（mapping）到核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)（最多允許5個(gè)錯(cuò)配），去除mapping上核糖體的reads，將保留下來(lái)的數(shù)據(jù)用于轉(zhuǎn)錄組的組裝及分析，進(jìn)而利用SOAP aligner/soap2軟件[35]將未mapping上核糖體的reads mapping到筆者課題組組裝的中蜂幼蟲(chóng)腸道參考轉(zhuǎn)錄組[31]。

利用FPKM（Fragments Per Kilobase of Transcript Per Million Mapped Reads）法計(jì)算基因表達(dá)量。利用R軟件（version 2.16.2）計(jì)算各樣品之間的相關(guān)性系數(shù)。利用edgeR軟件[36]進(jìn)行DEG分析。DEG的篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR≤0.05且|log2fold change≥1。將DEGs向GO數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontology.org/）的各條目（term）映射，并計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)，從而得到具有某個(gè)GO功能的基因列表及基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在DEGs中顯著富集的GO term。KEGG代謝通路顯著性富集分析以KEGG pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比在差異表達(dá)基因中顯著性富集的代謝通路。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)，隨機(jī)選取5個(gè)DEGs進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)按照SYBR Green Dye試劑盒（Vazyme公司，中國(guó)）操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)。20 μL的反應(yīng)體系中含SYBR Green Dye 10 μL，10.0 μmol·L-1正、反向引物各1 μL，cDNA模板DNA 1 μL，DEPC水8 μL。qRT-PCR反應(yīng)在ABI 7500熒光定量PCR儀（ABI公司，美國(guó)）上進(jìn)行，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸45 s。所選基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-??Ct法[37]計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控與評(píng)估

中蜂幼蟲(chóng)腸道樣品的Illumina PE125測(cè)序共測(cè)得188 457 338條reads，經(jīng)過(guò)濾得到182 088 448條clean reads，各樣品clean reads數(shù)均在95.4%以上，兩端Q20均在97.96%以上，兩端Q30均在94.97%以上（表1）。飽和度分析結(jié)果顯示隨著測(cè)序量的增多，檢測(cè)到的基因數(shù)也隨之上升、增長(zhǎng)速度趨于平緩，說(shuō)明檢測(cè)到的基因數(shù)趨于飽和（附圖1）。上述結(jié)果表明本研究中的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于進(jìn)一步分析。

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示AcCK與AcT的組內(nèi)各生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性均接近1，說(shuō)明樣本的重復(fù)性較高（附圖2）。進(jìn)一步對(duì)AcCK與AcT的各樣品進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果顯示第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）共能解釋樣品基因表達(dá)總體差異的86.5%，AcCK與AcT的組內(nèi)各生物學(xué)重復(fù)聚類良好（圖1），表明AcCK與AcT的總體基因表達(dá)模式差別顯著。

RNA-seq數(shù)據(jù)比對(duì)中蜂幼蟲(chóng)腸道參考轉(zhuǎn)錄組情況統(tǒng)計(jì)顯示，各樣品clean reads比對(duì)上參考轉(zhuǎn)錄組的比例均在88.91%以上（表2），AcCK與AcT的表達(dá)基因數(shù)目為36 604和37 108，分別占中蜂幼蟲(chóng)腸道參考轉(zhuǎn)錄組的84.05%和85.21 %。

圖1 各中蜂幼蟲(chóng)腸道樣本的PCA分析

表1 RNA-seq數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表2 RNA-seq數(shù)據(jù)比對(duì)參考基因組情況統(tǒng)計(jì)

2.2 差異表達(dá)基因（DEG）分析

利用edgeR進(jìn)行DEG分析，結(jié)果顯示在球囊菌脅迫后，4日齡幼蟲(chóng)腸道共有583個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因與下調(diào)基因的數(shù)量分別為344和239個(gè)（圖2），說(shuō)明有相當(dāng)一部分基因受球囊菌脅迫而被激活，也有部分基因受到球囊菌的抑制。

2.3 差異表達(dá)基因的GO富集分析

DEGs的GO分類結(jié)果顯示，這些DEGs分為3類：生物學(xué)進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能，分布于36個(gè)GO term上，分別為代謝進(jìn)程、生長(zhǎng)、發(fā)育進(jìn)程、生殖、生殖進(jìn)程、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞成分組織或生物起源、免疫系統(tǒng)進(jìn)程、多組織進(jìn)程、定位、單組織進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程、應(yīng)激反應(yīng)、信號(hào)、生物調(diào)控、結(jié)構(gòu)分子活性、電子載體活性、抗氧化活性、脒基-核苷酸交換因子活性、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)器、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)器活性、結(jié)合、分子傳感器活性、細(xì)胞、細(xì)胞組件、大分子復(fù)合物、細(xì)胞器組件、細(xì)胞器、突觸、細(xì)胞膜內(nèi)腔、細(xì)胞膜和細(xì)胞膜組件（圖3）。GO富集分析結(jié)果顯示，基因富集數(shù)最多的GO term為細(xì)胞（106 unigenes），其次為細(xì)胞組件（106 unigenes）和代謝進(jìn)程（104 unigenes）。

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集分析

分別對(duì)上調(diào)基因和下調(diào)基因進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，結(jié)果表明上調(diào)基因富集在72個(gè)代謝通路上，其中基因富集數(shù)最多的是核糖體（ribosome）（72 unigenes），其次為碳代謝（carbon metabolism）（16 unigenes）和糖酵解（glycolysis/gluconeogenesis）（14 unigenes）（圖4-A），而下調(diào)基因富集在45個(gè)代謝通路上，其中基因富集數(shù)最多的是碳代謝（9 unigenes），其次為二羧酸代謝（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）（8 unigenes）和氨基酸生物合成（biosynthesis of amino acids）（7 unigenes）（圖4-B）。值得關(guān)注的是，上調(diào)基因中分別有3、2、1和1個(gè)基因富集在內(nèi)吞作用（endocytosis）、吞噬體（phagosome）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）和泛素介導(dǎo)的蛋白水解（ubiquitin mediated proteolysis），說(shuō)明意蜂幼蟲(chóng)的免疫相關(guān)通路被球囊菌脅迫所激活；多達(dá)32個(gè)下調(diào)基因富集在新陳代謝相關(guān)通路，如碳代謝（9 unigenes）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）（5 unigenes）、精氨酸生物合成（arginine biosynthesis）（3 unigenes）、氮代謝（nitrogen metabolism）（2 unigenes）和丙酮酸代謝（pyruvate metabolism）（2 unigenes），說(shuō)明對(duì)中蜂幼蟲(chóng)的新陳代謝相關(guān)通路受到球囊菌的抑制，球囊菌入侵對(duì)宿主的代謝系統(tǒng)產(chǎn)生廣泛的影響。

圖2 球囊菌脅迫中蜂幼蟲(chóng)腸道的DEGs

1：生物調(diào)控 Biological regulation；2：細(xì)胞成分組織或生物合成 Cellular component organization or biosynthesis；3：細(xì)胞進(jìn)程 Cellular process；4：發(fā)育進(jìn)程 Developmental process；5：生長(zhǎng) Growth；6：免疫系統(tǒng)進(jìn)程 Immune system process；7：定位 Localization；8：運(yùn)動(dòng) Locomotion；9：代謝進(jìn)程 Metabolic process；10：多組織進(jìn)程 Multi-organism process；11：多細(xì)胞生物進(jìn)程 Multicellular organismal process；12：生殖 Reproduction；13：生殖進(jìn)程 Reproductive process；14：應(yīng)激反應(yīng) Response to stimulus；15：信號(hào)Signaling；16：?jiǎn)谓M織進(jìn)程 Single-organism process；17：細(xì)胞 Cell；18：細(xì)胞組件 Cell part；19：大分子復(fù)合物 Macromolecular complex；20：細(xì)胞膜 Membrane；21：細(xì)胞膜組件 Membrane part；22：細(xì)胞膜內(nèi)腔 Membrane-enclosed lumen；23：細(xì)胞器Organelle；24：細(xì)胞器組件 Organelle part；25：突觸 Synapse；26：抗氧化活性 Antioxidant activity；27：結(jié)合 Binding；28：催化活性 Catalytic activity；29：電子載體活性 Electron carrier activity；30：脒基核苷酸交換因子活性 Guanyl-nucleotide exchange factor activity；31：分子功能調(diào)節(jié)器 Molecular function regulator；32：分子轉(zhuǎn)換器活性 Molecular transducer activity；33：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性 Nucleic acid binding transcription factor activity；34：蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性 Protein binding transcription factor activity；35：結(jié)構(gòu)分子活性 Structural molecule activity；36：轉(zhuǎn)運(yùn)器活性 Transporter activity

A：上調(diào)基因Up-regulated genes；B：下調(diào)基因Down-regulated genes

進(jìn)而對(duì)上述免疫相關(guān)基因和代謝相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示球囊菌脅迫后，中蜂幼蟲(chóng)腸道的免疫相關(guān)基因表達(dá)量呈不同程度的上調(diào)（圖5-A），而代謝相關(guān)基因表達(dá)量不同程度地下調(diào)（圖5-B），進(jìn)一步表明中蜂幼蟲(chóng)腸道的免疫相關(guān)基因受球囊菌脅迫而激活、代謝相關(guān)基因受到球囊菌的抑制。

2.5 RNA-seq數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗(yàn)證

利用qRT-PCR檢測(cè)隨機(jī)選取的5個(gè)DEGs（4個(gè)上調(diào)基因，1個(gè)下調(diào)基因），結(jié)果顯示這些DEGs的表達(dá)水平變化趨勢(shì)與RNA-seq數(shù)據(jù)中的基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致（圖6），證明了本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

A：中蜂幼蟲(chóng)腸道的免疫相關(guān)基因A. c. cerana larval gut’s immune-related DEGs；B：中蜂幼蟲(chóng)腸道的代謝相關(guān)基因A. c. cerana larval gut’s metabolism-related DEGs

A：類圍食膜因子3-C前體表皮蛋白編碼基因cuticular protein analogous to peritrophins 3-C precursor encoding gene；B：表皮蛋白1前體編碼基因cuticular protein 1 precursor encoding gene；C：類表皮蛋白同種型X2編碼基因cuticle protein-like isoform X2 encoding gene；D：類表皮蛋白38編碼基因cuticle protein 38-like encoding gene；E：G蛋白耦聯(lián)受體Mth-like 3編碼基因probable G-protein coupled receptor Mth-like 3 encoding gene

3 討論

白堊病對(duì)蜂群的危害嚴(yán)重，每年給養(yǎng)蜂業(yè)造成巨大損失。目前，白堊病的組學(xué)研究十分有限。前期研究中，筆者課題組組裝了中蜂幼蟲(chóng)腸道的參考轉(zhuǎn)錄組，并對(duì)其進(jìn)行了功能及代謝通路注釋[31]。在此基礎(chǔ)上，本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)健康及球囊菌脅迫的中蜂4日齡幼蟲(chóng)腸道進(jìn)行深度測(cè)序，進(jìn)而研究其響應(yīng)球囊菌脅迫的應(yīng)答。腸道是昆蟲(chóng)的重要器官，在消化、發(fā)育和免疫等諸多方面中發(fā)揮重要作用。本研究針對(duì)中蜂幼蟲(chóng)腸道進(jìn)行測(cè)序，其轉(zhuǎn)錄組變化能更為精確地反映宿主響應(yīng)病原脅迫的應(yīng)答。在AcCK和AcT中分別檢測(cè)到已知基因36 604和37 108個(gè)，約占中蜂幼蟲(chóng)腸道轉(zhuǎn)錄組基因總數(shù)的84.05%和85.21%，推測(cè)部分未檢測(cè)到的基因可能在中蜂4日齡幼蟲(chóng)腸道不表達(dá)。

養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，意蜂幼蟲(chóng)極易被球囊菌侵染而暴發(fā)白堊病，而中蜂幼蟲(chóng)極少受其影響。前期研究發(fā)現(xiàn)在球囊菌脅迫后的意蜂幼蟲(chóng)腸道中共檢測(cè)到24個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因與下調(diào)基因分別為4和20個(gè)（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。本研究發(fā)現(xiàn)球囊菌脅迫后的中蜂幼蟲(chóng)腸道有583個(gè)基因差異表達(dá)（上調(diào)基因344個(gè)，下調(diào)基因239個(gè)），遠(yuǎn)多于球囊菌脅迫后的意蜂幼蟲(chóng)腸道，這些DEGs或許與中蜂的球囊菌抗性密切相關(guān)。此前，大多數(shù)研究都集中于蜜蜂的群體防御，通常認(rèn)為清理行為在蜜蜂抵御球囊菌入侵過(guò)程中至關(guān)重要。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)中蜂幼蟲(chóng)和意蜂幼蟲(chóng)接種球囊菌，兩種幼蟲(chóng)皆能被侵染而發(fā)生白堊病，但前者的發(fā)病率遠(yuǎn)低于后者，說(shuō)明在中蜂幼蟲(chóng)與意蜂幼蟲(chóng)在個(gè)體水平上對(duì)球囊菌也存在較大的抗性差異。角質(zhì)層和圍食膜是昆蟲(chóng)免疫防御的第一道防線[38]，當(dāng)病原微生物突破這道防線后，將遭遇昆蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞免疫與體液免疫的抵抗，包括內(nèi)吞作用、黑化作用、吞噬作用、蛋白的酶促水解及抗菌肽等[39-40]。內(nèi)吞作用和吞噬作用在蜜蜂抵御真菌侵染的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[40]。本研究發(fā)現(xiàn)分別有3個(gè)和2個(gè)上調(diào)基因富集在內(nèi)吞作用和吞噬體，說(shuō)明這兩個(gè)代謝通路受球囊菌脅迫而激活。泛素介導(dǎo)的蛋白水解對(duì)清除衰老和損傷細(xì)胞意義重大，同時(shí)也在調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程的諸多方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞周期、分化、發(fā)育和免疫等[41]。本研究發(fā)現(xiàn)1個(gè)上調(diào)基因富集在泛素介導(dǎo)的蛋白水解，說(shuō)明該通路同樣被球囊菌所激活。上述結(jié)果表明中蜂幼蟲(chóng)的部分細(xì)胞免疫對(duì)球囊菌的脅迫產(chǎn)生應(yīng)答，推測(cè)它們?cè)谇蚰揖肭值脑缙诎l(fā)揮重要作用。昆蟲(chóng)的體液免疫也會(huì)因病原微生物的入侵而被激活，從而合成分泌抗菌肽殺滅病原，但在本研究中，未發(fā)現(xiàn)有DEGs富集在體液免疫如NF-B和Jak-STAT信號(hào)通路，也未發(fā)現(xiàn)蜜蜂4種抗菌肽（abaecin、apidaecin、defensin和hymenoptaecin）編碼基因的差異表達(dá)，表明中蜂幼蟲(chóng)的體液免疫在球囊菌脅迫早期尚未被球囊菌激活。碳代謝對(duì)生物體內(nèi)氨基酸的合成與轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)在球囊菌脅迫的中蜂4日齡幼蟲(chóng)腸道中，富集在碳代謝上的DEGs包括16個(gè)上調(diào)基因和9個(gè)下調(diào)基因，推測(cè)多數(shù)碳代謝相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)可能與宿主的細(xì)胞免疫水平增強(qiáng)有關(guān)，而部分?jǐn)?shù)碳代謝相關(guān)基因表達(dá)水平下調(diào)反映出球囊菌-中蜂幼蟲(chóng)間互作的復(fù)雜性。本研究還發(fā)現(xiàn)多達(dá)72個(gè)上調(diào)基因富集在核糖體，說(shuō)明在球囊菌脅迫早期，宿主的蛋白合成活躍，推測(cè)宿主通過(guò)提升蛋白合成滿足抵御球囊菌入侵及自我修復(fù)的需要。

中蜂幼蟲(chóng)在球囊菌入侵早期并不表現(xiàn)出明顯的白堊病癥狀，但宿主和病原之間發(fā)生著復(fù)雜的互作，本研究發(fā)現(xiàn)有多達(dá)76個(gè)DEGs富集在新陳代謝（32個(gè)新陳代謝相關(guān)通路），本研究的結(jié)果表明此時(shí)中蜂幼蟲(chóng)的代謝系統(tǒng)已受到球囊菌一定程度地干擾和破壞，推測(cè)病原通過(guò)抑制宿主的新陳代謝減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、降低宿主的免疫應(yīng)答水平，從而促進(jìn)病原自身的侵染。在球囊菌入侵早期，這種干擾和破壞作用的累積，可能會(huì)導(dǎo)致入侵晚期白堊病的發(fā)生。此前的白堊病研究集中于意蜂且聚焦在病程晚期，忽略了病程早期的研究。本研究利用RNA-seq技術(shù)開(kāi)展中蜂幼蟲(chóng)腸道響應(yīng)球囊菌脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)在球囊菌脅迫的早期階段，中蜂幼蟲(chóng)腸道也伴隨著復(fù)雜的應(yīng)答。目前尚無(wú)一種殺真菌劑被批準(zhǔn)應(yīng)用于養(yǎng)蜂生產(chǎn)[1]，養(yǎng)蜂生產(chǎn)實(shí)踐中主要通過(guò)選育抗病品系、改善養(yǎng)蜂管理和保持清潔衛(wèi)生來(lái)防治白堊病[41]，但是效果并不理想，亟需有效的防治策略。未來(lái)的研究方向是利用RNA-seq技術(shù)對(duì)球囊菌脅迫后的不同日齡中蜂幼蟲(chóng)腸道進(jìn)行深度測(cè)序，全局研究中蜂幼蟲(chóng)在轉(zhuǎn)錄組水平的應(yīng)答，并應(yīng)用趨勢(shì)分析或WGCNA分析篩選出關(guān)鍵應(yīng)答基因，進(jìn)而利用RNAi等技術(shù)手段驗(yàn)證其功能。

4 結(jié)論

利用RNA-seq技術(shù)對(duì)健康及球囊菌脅迫的中蜂4日齡幼蟲(chóng)腸道進(jìn)行深度測(cè)序，通過(guò)對(duì)DEGs的GO和KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)在球囊菌脅迫早期，中蜂幼蟲(chóng)的部分細(xì)胞免疫被球囊菌激活，而體液免疫未被激活，宿主的新陳代謝系統(tǒng)受到球囊菌的顯著抑制。研究結(jié)果為深入解析中蜂幼蟲(chóng)響應(yīng)球囊菌脅迫的應(yīng)答機(jī)制提供了重要信息，也為白堊病的有效防治打下了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

A: AcCK-1; B: AcCK-2; C: AcCK-3; D: AcT-1; E: AcT-2; F: AcT-3

附圖1 各中蜂幼蟲(chóng)腸道樣品的測(cè)序飽和度

Fig. S1 Sequencing saturation of everylarval gut sample

附圖2 各中蜂幼蟲(chóng)腸道樣品不同生物學(xué)重復(fù)間的相關(guān)性

Fig. S2 Pearson correlation between every two biological repeats within eachlarval gut sample

Transcriptome oflarval gut Underthe Stressof

CHEN DaFu, GUO Rui, XIONG CuiLing, LIANG qin, ZHENG YanZhen, XU XiJian, ZHANG ZhaoNan, HUANG ZhiJian, ZHANG Lu, WANG HongQuan, XIE YanLing, TONG XinYu

(College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002)

【Objective】So far, no study on application of next-generation sequencing technology for the research of chalkbrood disease was reported. In the present research, RNA-seq technology was utilized to deep sequence of normal and-treated 4th instarlarval gut to mine larvae’s responses tochallenge.【Method】AcCK (un-treated group) and AcT (-treated group) were sequenced on Illumina HiSeq 2500 platform. After evaluation and filtration of raw data from RNA-seq, differentially expressed gene (DEG) analysis was performed using edgeR software, further, Gene Ontology (GO) and KEGG pathway enrichment analyses were carried out, and finally, real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was conducted to validate the RNA-seq data.【Result】 In total, RNA-seq produced 188 457 338 raw reads, and after filtration, 182 088 448 clean reads were obtained, Q20 and Q30 of each sample were above 97.96% and 94.97%, respectively, indicating that RNA-seq data in this research were with high quality. principle component analysis (PCA) was performed on all genes level and the result showed PC1 and PC2 were able to account for 75.8% and 10.7% of the expressed genes’ overall differences, respectively. DEG analysis result displayed that there were 344 up-regulated genes and 239 down-regulated genes in AcCK VS AcT. GO enrichment analysis result showed that the DEGs were enriched in 36 GO terms, among them, the mostly enriched ones were cell (106 unigenes), cell part (106 unigenes) and metabolic process (104 unigenes). KEGG pathway enrichment analysis result suggested that up- and down-regulated genes were enriched in 72 and 45 pathways, respectively, and the mostly enriched pathways for up-regulated genes were ribosome (72 unigenes), carbon metabolism (16 unigenes) and glycolysis/gluconeogenesis (14 unigenes), while the mostly enriched pathways for down-regulated genes were carbon metabolism (9 unigenes), glyoxylate and dicarboxylate metabolism (8 unigenes) and amino acids biosynthesis (7 unigenes). further analysis demonstrated that the immune-related genes inlarval gut were activated, while the metabolism-related genes were greatly inhibited.【Conclusion】The findings of the study not only uncovered thelarval gut’s responses toduring the early stage of invasion, but also provided key information for clarifying the mechanism underlying the host’s responses to, thus laying a foundation for functional investigation of key responding genes.

; larval gut;; transcriptome; RNA-seq

2016-12-26；接受日期：2017-03-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（30800806）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（蜜蜂）建設(shè)專項(xiàng)（CARS-45-KXJ7）、福建農(nóng)林大學(xué)科技發(fā)展資金（KF2015123）

陳大福，Tel：0591-83726835；E-mail：dfchen826@fafu.edu.cn。通信作者郭睿，Tel：0591-87640197；E-mail：ruiguo@fafu.edu.cn