柑橘響應潰瘍病菌轉錄因子CsBZIP40的克隆及功能分析

賈瑞瑞，周鵬飛，白曉晶，陳善春，許蘭珍，彭愛紅，雷天剛，姚利曉，陳敏，何永睿，李強

?

柑橘響應潰瘍病菌轉錄因子CsBZIP40的克隆及功能分析

賈瑞瑞，周鵬飛，白曉晶，陳善春，許蘭珍，彭愛紅，雷天剛，姚利曉，陳敏，何永睿，李強

（西南大學柑桔研究所/中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所/國家柑桔工程技術研究中心，重慶400712）

【目的】分析柑橘BZIP轉錄因子家族并克隆柑橘潰瘍病菌相關的轉錄因子CsBZIP40，對其進行亞細胞定位并研究外源激素及機械損傷對該基因的誘導表達，確定其誘導表達模式，分析其與潰瘍病菌侵染的關系?！痉椒ā炕谌蚪M公共數(shù)據(jù)庫，對柑橘BZIP轉錄因子進行綜合專業(yè)注釋以獲得柑橘中BZIP家族的所有成員信息，并根據(jù)染色體定位對其進行命名；利用MEME分析其結構域；利用MEGA 6.0分析柑橘BZIP與擬南芥BZIP的系統(tǒng)發(fā)育關系，并根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關系對該基因家族進行分類，確定本研究關注的CsBZIP40所屬的類型；結合染色體定位和系統(tǒng)發(fā)育樹確定該家族的基因復制情況；利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法驗證感染潰瘍病菌前后由柑橘轉錄組篩選出的表達模式；分析、啟動子元件（plantCARE）和核定位信號（cNLSmapper），構建GFP融合載體，用洋蔥表皮進行亞細胞定位分析，來對預測的核定位信息進行驗證；利用qRT-PCR技術分析水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯利（ET）以及機械損傷（wounding）對該基因的誘導表達模式，揭示該轉錄因子與激素代謝途徑的關系。【結果】從柑橘（甜橙）全基因組數(shù)據(jù)庫中共注釋到47個，這些基因位于9號染色體之外的所有染色體上，其中3號染色體基因密度最大為4.5×10-7個/Mb，2號染色體上的基因密度最小，僅占所有基因的2%；柑橘BZIP基因家族含有較少的基因復制事件，所以相對其他已測序物種其BZIP家族較?。换蛉L5 756 bp，開放閱讀框1 530 bp，編碼509個氨基酸；經(jīng)BZIP家族染色體定位、結構域和系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示基因序列特異性較好，且與擬南芥中屬于同源基因，屬于柑橘10個亞家族中參與病菌防御的D亞類；上游啟動子元件含多個與植物逆境或激素應答相關的順式作用元件，例如Box-W1、HSE、ERE等；此基因含有核定位信號，亞細胞定位表明此蛋白定位于細胞核，具備轉錄因子發(fā)揮作用的前提；外源水楊酸并不會使四季橘和紐荷爾臍橙中的表達水平顯著上調(diào)，紐荷爾臍橙在茉莉酸甲酯誘導后有明顯的差異表達，但乙烯利可以使在四季橘和紐荷爾臍橙中均有較明顯的差異表達；柑橘潰瘍病菌侵染可誘導抗病品種四季橘中此基因上調(diào)表達，而在感病品種紐荷爾臍橙中，該基因對柑橘潰瘍病菌侵染沒有響應?！窘Y論】CsBZIP40是響應潰瘍病菌侵染的一個轉錄因子，該基因可作為柑橘抗?jié)儾【肿佑N的一個候選基因來進行進一步功能性驗證，具有潛在的分子育種價值。

柑橘潰瘍??；BZIP；轉錄因子；亞細胞定位

0 引言

【研究意義】柑橘潰瘍?。╟itrus bacterial canker，CBC）由柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種（subsp.，）引起，該病傳播快、發(fā)病高。目前，只能通過噴灑銅制劑農(nóng)藥或集中銷毀果苗加以控制，但其造成的經(jīng)濟損失較大。因此，尋找潛在的抗病基因并進行分子育種顯得尤為重要。轉錄因子（transcription factors，TF）是分子育種實踐中被廣泛利用的候選基因，它是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性互作而影響下游基因表達的一類反式作用因子[1]。轉錄因子中，BZIP（basic leucine zipper）是一個進化上十分古老的亞類。在目前已經(jīng)完成全基因組測序的植物中，BZIP類轉錄因子在總數(shù)上占較大比重。這個家族中的成員參與多種生物學過程，包括植物生長、花發(fā)育、種子成熟、衰老、光信號、損傷、病菌防御以及對各種環(huán)境脅迫的響應等[2]。若能獲得有潛力的BZIP候選基因用于柑橘抗?jié)儾》肿佑N，將會有很大的現(xiàn)實指導意義?！厩叭搜芯窟M展】Jakoby等[3]對擬南芥基因組全序列進行分析，根據(jù)堿性結構域及其他保守的結構域，將擬南芥的73個BZIP類轉錄因子基因家族成員分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S類共10個亞家族。不同家族成員其行使的功能也不相同，A亞族主要參與ABA和逆境脅迫的調(diào)控表達；C亞族作用于種子發(fā)育和逆境脅迫；D亞族在抗氧化和病菌防御方面起重要作用；E亞族與I亞族亮氨酸拉鏈結構相似性很高，但功能研究較少；G亞族在光信號轉導和種子成熟過程中發(fā)揮作用；H亞族在光合作用過程起關鍵作用；I亞族參與赤霉素代謝；S亞族參與逆境脅迫和糖類信號代謝，而B亞族和F亞族報導很少。除擬南芥外，其他植物BZIP轉錄因子的分類也大致如此[4]。不同的植物含有的BZIP類轉錄因子家族成員數(shù)量不同。現(xiàn)在擬南芥、大豆、水稻、玉米、葡萄、大麥、黃瓜、白菜中鑒定出的BZIP轉錄因子數(shù)分別為75[3]、100[5]、89[6]、125[7]、55[8]、89[9]、64[10]、136[11]。目前，有關BZIP蛋白的研究主要集中在模式植物的ABA信號通路及一些非生物脅迫方面，如ABI5和ABFs是ABA的響應元件，在擬南芥中通過參與轉錄水平的蛋白磷酸化和泛素化來穩(wěn)定相關蛋白從而調(diào)節(jié)ABA的信號途徑[12]；從枳殼中分離的PtrABF轉到煙草中可通過清除活性氧或者增強其對活性氧的耐性來調(diào)節(jié)逆境應答，抵御干旱脅迫[13]。此外，BZIP轉錄因子與其他信號通路間的關系也有報道，如ABF2是糖代謝途徑的一個重要組成部分，該基因的過表達可以增強植物對多重脅迫的抗性[14]，而DREB2C可以與ABF2互作，調(diào)節(jié)與ABA響應相關基因的表達[15]?！颈狙芯壳腥朦c】目前也有BZIP轉錄因子在植物病害方面的研究，主要涉及D類BZIP成員，但在柑橘潰瘍病方面還鮮有研究，因此，以柑橘為材料針對BZIP轉錄因子進行研究具有一定的價值?！緮M解決的關鍵問題】探索CsBZIP40對潰瘍病菌侵染、外源激素和物理創(chuàng)傷的響應模式，分析其抗病育種價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為紐荷爾臍橙及四季橘（）葉片，分別取自于西南大學柑橘研究所溫網(wǎng)室和資源育種室苗圃。試驗開始于2016年1月，柑橘葉片材料采自9月期間，在中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所改良課題實驗室完成。潰瘍病菌由國家柑橘苗木脫毒中心提供，是亞洲種A株系，其對野生錦橙發(fā)病率是91%，病斑面積是4.5 mm2，病斑總面積是90.4 mm2，病斑所含病原菌數(shù)量是2.99×106cfu/mm2，病情指數(shù)73.3%。

植物總RNA提取試劑盒購自Aidlab公司；實時熒光染料購自BIO-RAD公司；膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒購自Omega公司；克隆載體pGEM-T easy、反轉錄試劑盒和大腸桿菌（）DH5感受態(tài)細胞購買自TaKaRa公司；GFP融合載體由本實驗室構建和保存；根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞由筆者實驗室制備和保存。

1.2 數(shù)據(jù)挖掘、注釋與信息學分析

柑橘（甜橙，）的基因組和蛋白組數(shù)據(jù)下載于公共數(shù)據(jù)庫Phytozome（https://phytozome.jgi. doe.gov）和華中農(nóng)業(yè)大學甜橙基因組數(shù)據(jù)庫CAP[16]（http://citrus.hzau.edu. cn/cgi-bin/orange/）。采用三步法綜合注釋流程對BZIP家族進行了專業(yè)注釋[17]，首先以擬南芥的BZIP家族73條完整序列與上述來源的蛋白質組數(shù)據(jù)進行比對初步獲得甜橙中的BZIP蛋白序列；然后去掉其中的錯誤注釋和重復序列，并且從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢測EST數(shù)據(jù)支持并對上述錯誤的注釋進行校正，最終得到的BZIP蛋白序列進行SCIPIO[18]分析，獲得相應的染色體定位數(shù)據(jù)、基因結構數(shù)據(jù)、DNA和CDS序列以及上述兩數(shù)據(jù)庫中未注釋的BZIP成員，自此，便完成了數(shù)據(jù)挖掘和注釋。將得到的BZIP成員按照染色體定位進行命名，如：Cs為縮寫，BZIP是基因家族的縮寫，01是根據(jù)在染色體上的位置給這個成員的序號。

最大似然（maximum-likelihood）系統(tǒng)發(fā)育樹采用PhyML-aLRT 3.0[19]進行分析并用Mega 6.0[20]進行進化樹展示。構建進化樹使用了甜橙全部的全長BZIP蛋白序列，序列對比和編輯采用MAFFT和Bioedit V7.2[21]。基因的染色體定位和基因復制關系（全基因組復制、片段復制、隨機復制）的圖形展示使用Mapchart軟件[22]。

經(jīng)過注釋，筆者從轉錄組中獲得的一個與潰瘍病相關基因被命名為，根據(jù)基因序列設計引物F：5′-ATGGCGAGTCACAGAATTGGA-3′、R：5′-TCAAAAGTTCGAGAAATGATT-3′，以紐荷爾臍橙葉片cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 15 s，57℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃延伸3 min；4℃保存。回收PCR產(chǎn)物，連接pGEM-T easy載體，重組質粒轉化DH5感受態(tài)細胞，藍白斑篩選，挑取陽性克隆，PCR驗證后送上海英駿公司測序。用ProtParam程序（http://web. expasy.org/protparam/）對氨基酸序列的分子量、理論等電點（pI）、氨基酸含量、不穩(wěn)定指數(shù)、親水性進行預測；利用在線軟件CELLO[23]（http://cello.life.nctu. edu.tw/）進行亞細胞定位預測；用cNLS Mapper[24-25]（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）進行核定位信號預測；利用MEME[26]在線軟件（http://meme-suite.org/）分析CsBZIP的結構域。

根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫中基因序列設計特異引物F：5′-AAATTAAACAAATGTAAAGAAGA T-3′、R：5′-AGCTCCAATTCTGTGACTCGCCAT-3′，以基因組DNA為模板，擴增得到基因啟動子并測序，利用網(wǎng)站PlantCARE[27]數(shù)據(jù)（http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析預測啟動子序列的順式作用元件。

1.3 亞細胞定位

根據(jù)核苷酸序列設計去除了終止子并且兩端都含有HⅠ酶切位點和保護堿基的引物F：5′-CGCGGATCCATGGCGAGTCACAGAATTGG-3′、R：5′-CGCGGATCCAAAGTTCGAGAAATGATTTT-3′，以測序正確的DNA為模板（連有pGEM-T easy載體），進行PCR擴增，其產(chǎn)物回收后連接在FJ905222（Binary vector pCX-DG）雙元載體上，構建出::重組載體轉化大腸桿菌，篩選陽性克隆提取質粒，進行PCR及酶切驗證，將驗證正確的質粒轉化農(nóng)桿菌，再進行上述陽性克隆子檢測，驗證農(nóng)桿菌中是否含有上述質粒。將含重組質粒pCX-DG–::-CaMV-nos和作為對照的空載體pCX-DG--CaMV-nos農(nóng)桿菌菌液配成OD600=0.1的菌懸液，參照Xu等[28]的方法將菌懸液注射在洋蔥表皮細胞下兩三層葉肉組織中，平均每1 cm2的表皮注射200 μL，28℃暗箱培養(yǎng)48 h，然后撕取表皮制成裝片，熒光顯微鏡明、暗視野下觀察表達情況，并拍照記錄。

1.4 潰瘍病菌侵染對的誘導表達

將采集的紐荷爾臍橙和四季橘葉片用75%無水乙醇的棉花擦凈后自來水沖凈，再用無菌水清洗兩次后擺放到滅菌的培養(yǎng)皿中。將OD600=0.5的潰瘍病菌液稀釋1 000倍，用針刺法分別接種到荷爾臍橙和四季橘葉片上。28℃光照培養(yǎng)0、1、3、5 d后，切取病斑備用，以未接種潰瘍病菌的葉片作對照。從切下含病斑的葉片中提取總RNA并反轉錄成cDNA，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析各樣品中的表達量。

1.5 外源激素及機械損傷對的誘導表達

將紐荷爾臍橙和四季橘葉片清洗干凈，用打孔器將葉片打成直徑為7 mm的葉圓片，然后將葉圓片分別浸泡在濃度為100 μmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）、10 μmol·L-1水楊酸（SA）、10 μmol·L-1乙烯利（ET）溶液中。分別在0、6、12、24 h取樣，提取總RNA并反轉錄為cDNA，qRT-PCR檢測各誘導環(huán)境下不同時段的表達量。以75%無水乙醇處理的葉圓片為茉莉酸甲酯的對照組，以水處理的葉圓片為水楊酸和乙烯利處理的對照組。將紐荷爾臍橙和四季橘葉片清洗干凈后用手術刀在葉片兩側各劃一刀，以未處理的葉片作對照，然后分別在0、6、12、24 h打孔取樣（葉圓片中間有劃痕），提取RNA后反轉錄為cDNA，qRT-PCR檢測的表達量。

1.6 實時熒光定量PCR與統(tǒng)計分析

利用NCBI在線軟件設計基因定量引物F：5′-AGTTCCCTTTGGGCATCTCG-3′、R：5′-ACCATTTGCAGATCCGTCGT-3′，內(nèi)參為甜橙，引物序列為F：5′-CATCCCTCAGCACCTTC C-3′、R：5′-CCAACCTTAGCACTTCTCC-3′。在ABI 7500熒光定量PCR儀上檢測該基因表達量。采用12 μL的PCR反應體系：6 μL 2X熒光染料、4.4 μL H2O、0.3 μL 10 mol·L-1引物、1 μL cDNA。反應程序：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。每個處理進行3次生物學重復和3次平行樣重復。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算（ΔCt=CtCsBZIP40-CtActin），使用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用Origin軟件進行繪圖，使用SPSS 20進行差異顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 BZIP基因家族注釋

經(jīng)過注釋總計從參考基因組挖掘到了47個（附表1）。跟其他物種相比，柑橘的數(shù)量較少，這些基因位于9號染色體之外的所有染色體上，其中3號染色體上有13個，占所有的27%，其基因密度最大為4.5×10-7個/Mb，2號染色體上的基因密度是3.2×10-8個/Mb，其基因密度最小，僅占所有的2%（圖1）。該家族中有15對基因發(fā)生了全基因組重復，與屬于隨機重復，在所有染色體上均沒有節(jié)段重復事件發(fā)生，沒有發(fā)生染色體復制?；蚪M復制事件比其他物種少，這也是柑橘BZIP家族相對較小的原因。為得到較原始的BZIP進化數(shù)據(jù)，對這47個蛋白質序列與73個擬南芥BZIP蛋白數(shù)據(jù)進行進化分析，系統(tǒng)進化樹將柑橘BZIP分為了10個亞家族，其中A亞家族10個，B亞家族1個，C亞家族5個，D亞家族7個，E亞家族3個，F(xiàn)亞家族1個，G亞家族4個，H亞家族3個，I亞家族5個，S亞家族8個（圖2）。本試驗中的在柑橘中沒有與之相近的同源基因，特異性較好，但與擬南芥中基因的同源，它們均屬于在病菌防御方面發(fā)揮作用的D亞家族。

CsBZIP轉錄因子家族的結構域分析結果顯示motif 1的序列為QKTLAQNREAARKSRLRKKAYVQ QLE，motif 5的序列為KLTQLEQELQRARQQ，二者共同組成CsBZIP轉錄因子的核心元件，其他結構域的位置和數(shù)量所存在的差異造成CsBZIP間的功能差異（附圖1）。根據(jù)柑橘BZIP家族的結構域差異進行分類，其結果與系統(tǒng)進化樹分類結果相符。

相互連接的兩個基因表示一個基因復制事件The links between genes represented gene duplication events

2.2及其啟動子的克隆與生物信息學分析

測序結果及序列分析得到cDNA全長為5 756 bp，開放閱讀框長度為1 530 bp，編碼509個氨基酸。CsBZIP40蛋白分子量為125 601.06，等電點是4.98，主要編碼丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、蘇氨酸，含量分別為30.5%、22.5%、23.5%、23.6%，不穩(wěn)定指數(shù)為42.66，脂肪酸系數(shù)為30.46，親水指數(shù)為0.851，該蛋白整體表現(xiàn)為親水的不穩(wěn)定蛋白。

克隆測序了的核心啟動子序列，DNA片段有1.5 kb。該啟動子含有參與逆境和植物激素應答相關的順式作用元件Box-W1、HSE、ERE等（表1）。

表1 PLACE預測CsBZIP40啟動子區(qū)順式作用元件

圖2 柑橘中的BZIPs與擬南芥中的BZIPs系統(tǒng)進化分析

2.3 CsBZIP40核定位信號預測及亞細胞定位

亞細胞定位結果顯示CsBZIP40定位于細胞核的預測分值顯著高于其他位置，預測CsBZIP40在細胞核優(yōu)勢表達。cNLS Mapper結果顯示，CsBZIP40的氨基酸序列中特定位點核定位分值較高，預測這些氨基酸序列為核定位信號（表2）。瞬時表達結果表明，空載體在整個細胞中均有表達，而融合蛋白在細胞核中定位，說明CsBZIP40是在細胞核中表達并發(fā)揮功能的轉錄因子，與亞細胞定位的預測結果一致（圖3）。

2.4 抗/感品種中表達差異性

定量分析得知在葉片接種潰瘍病菌0、1、3、5 d不同時期的表達水平存在差異，在柑橘高感病品種紐荷爾臍橙接種潰瘍病菌后的表達變化上升幅度微小，隨時間的變化幅度不明顯，而在高抗病品種四季橘中的上調(diào)情況要明顯高于紐荷爾臍橙，特別是在接種潰瘍病菌3 d后的表達有一個顯著的上升，證明該基因是高感病品種紐荷爾臍橙和高抗病品種四季橘感染潰瘍病菌后的一個差異表達基因，與筆者實驗室轉錄組測序結果分析一致（圖4）。

2.5 外源激素及機械損傷對的誘導表達分析

SA處理后，紐荷爾臍橙和四季橘葉片中的表達沒有顯著性差異，可能由于此基因的啟動子上沒有與之相關的順式作用元件（圖5-A）。MeJA處理后，紐荷爾葉片的表達量明顯上調(diào)，在12 h時表達量達到最高，但四季橘葉片中的表達沒有顯著變化。此基因啟動子沒有茉莉酸響應的順式作用元件，但是紐荷爾中對茉莉酸甲酯有響應，可能與脅迫響應元件有關（圖5-B）。經(jīng)ET誘導后，紐荷爾和四季橘葉片的表達量上調(diào)，兩個品種中表達量整體呈先升后降的趨勢，在不同時間段的表達有顯著差異，其中，四季橘在處理6 h后表達下降，而紐荷爾在6 h 后的表達趨勢與四季橘相反，有明顯的上調(diào)。兩個品種對乙烯均有響應，這與啟動子中乙烯順式作用元件相關（圖5-C）。在機械損傷后，紐荷爾中的表達量要高于四季橘，整體來看四季橘受機械損傷后表達量沒有明顯變化，而紐荷爾在損傷初期表達量有明顯上升后趨于穩(wěn)定（圖5-D）。

NH：紐荷爾臍橙Citrus junos；SJ：四季橘Calamondin。下同 The same as below

A：水楊酸SA；B：茉莉酸甲酯MeJA；C：乙烯利ET；D：機械損傷Wounding

3 討論

植物在應對外界非生物脅迫過程中，不同基因啟動子的順式作用元件可與不同轉錄因子結合，然后激活或抑制相關抗逆基因的表達以使植物對脅迫作出針對性的調(diào)節(jié)反應。對進行啟動子分析，發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)存在生長素響應元件AuxRR-core、乙烯響應元件ERE、赤霉素響應元件GARE-motif、脅迫響應元件TC-rich repeats及參與熱激響應元件HSE等，這些元件的存在表明該轉錄因子可能參與轉錄調(diào)控，與激素的代謝途徑相關，進而影響生物或非生物逆境的響應。因此推測可能參與植物的逆境響應。此外，該基因順式作用元件中還含有與胚乳發(fā)育相關的Skn-1-motif及響應真菌誘導的作用元件Box-W1，推測其在植物生長發(fā)育和真菌入侵防御過程中也發(fā)揮相應作用。

每個轉錄因子家族成員的多少與染色體間的節(jié)段重復，隨機重復發(fā)生的頻率有直接聯(lián)系，例如，擬南芥、水稻和高粱的基因組中片段重復的概率為53%—59%[10]，黃瓜為37%[10]，玉米為46%[7]，而柑橘基因組中沒有片段重復的；從隨機復制角度來看，黃瓜中隨機復制的概率為12%，擬南芥為73%，水稻為56%[10]，而柑橘中僅有2%。從總體來看，柑橘中的基因家族發(fā)生基因隨機重復和片段重復的概率都比其他幾個物種要低很多，因此柑橘中的該基因家族成員較少。同時每條染色體上的基因密度小也是造成該基因家族成員較少的原因。

是筆者實驗室轉錄組測序中得到的一個明顯響應潰瘍病菌侵染的基因，克隆紐荷爾中的轉錄因子CsBZIP40后，經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其具有D類BZIP亞家族的結構域，進化分析顯示該基因與擬南芥中在病菌防御方面發(fā)揮作用的D亞家族AT1G08320同源，有研究證明擬南芥中的BZIP蛋白可以對昆蟲危害和細菌感染作出應答[29]，推測該基因可能也參與柑橘中的其他病害防御反應。

不同的激素種類或不同的環(huán)境刺激會誘導不同的抗性基因的表達，如CAM家族的CAM7與BZIP家族的HY5轉錄因子互作可以參與ABA應答[30]；白菜中的BrABI5a和BrABI5b是ABA信號通路的正向調(diào)控因子[11]；大麥HvRAF受水楊酸、乙烯、茉莉酸甲酯、高鹽和病害的脅迫誘導[31]，而本研究發(fā)現(xiàn)外源水楊酸并不會使四季橘和紐荷爾臍橙中的表達水平顯著上調(diào)，紐荷爾在茉莉酸甲酯誘導后有明顯的差異表達，但乙烯利可以使在四季橘和紐荷爾臍橙中均有較明顯的差異表達，而且該基因也響應柑橘潰瘍病菌。由此表明并不參與水楊酸的抗病信號途徑，而參與乙烯和茉莉酸的信號響應。此外，在四季橘中乙烯的信號響應模式與潰瘍病菌的響應有上升趨勢，推測二者之間存在聯(lián)系，關于與乙烯信號途徑及乙烯信號途徑與潰瘍病抗性間的聯(lián)系有待進一步研究。

植物通過抗病信號途徑上調(diào)下游相關防衛(wèi)基因表達，抵制病原菌侵染，從而產(chǎn)生抗病性。同一植物對不同類型病原微生物的抗病反應涉及的抗病信號途徑不同。本試驗表明抗性品種四季橘在感染潰瘍病后表達量會上升，整體而言，在紐荷爾中的表達量要低于四季橘，說明是一個正向調(diào)節(jié)因子，在四季橘中，較高表達量的可以調(diào)控下游基因的表達，從而引起抗性。紐荷爾中同樣有這個基因，但是它并沒有在潰瘍病菌侵染時提升表達量，可能因為在紐荷爾中缺少識別潰瘍病菌侵染的因子或者缺少信號轉導途徑將侵染信號傳遞給轉錄因子CsBZIP40，導致沒有更多的表達，從而無法更好地調(diào)節(jié)下游抗性基因的表達進而產(chǎn)生抗性。所以在四季橘和紐荷爾中，表達量決定了是否抗?jié)儾?。實踐中，可以采用在紐荷爾中過表達的方式來提升對下游抗性基因的調(diào)控來進行分子育種，該基因對柑橘感染潰瘍病后的抗性評價值得進一步研究。

4 結論

與擬南芥的同源，該基因在柑橘中沒有同源基因，屬于與病原菌抗性相關的D類BZIP轉錄因子，序列和結構特異性較好；CsBZIP40是一個在細胞核中表達并響應潰瘍病病菌的轉錄因子，經(jīng)外源乙烯利誘導后有一個較明顯的上調(diào)表達；在柑橘的抗?jié)儾〔【肿佑N中，可作為一個很有潛力的候選基因來進行后期的功能性驗證。

References

[1] 陳儒鋼, 鞏振輝, 逯明輝, 李大偉, 黃煒. 植物抗逆反應中的轉錄因子網(wǎng)絡研究進展. 農(nóng)業(yè)生物技術學報, 2010, 18(1): 126-134.

CHEN R G, GONG Z H, LU M H, LI D W, HUANG W. Research advance of the transcription factor networks related to plant adverse environmental stress., 2010, 18(1): 126-134. (in Chinese)

[2] 李紅霞, 汪妤, 張戰(zhàn)鳳, 彭惠茹, 倪中福. 植物轉錄因子與作物抗逆脅迫關系的研究進展. 麥類作物學報, 2013, 33(3): 613-618.

LI H X, WANG Y, ZHANG Z F, PENG H R, NI Z F. Progress in relationship between plant transcription factors and crop stress tolerance., 2013, 33(3): 613-618. (in Chinese)

[3] Jakoby M, Weisshaar B, Dr?ge-Laser W, Vicente- Carbajosa J, Tiedemann J, Kroj T, Parcy F. bZIP transcription factors in,2002, 7(3): 106-111.

[4] 張計育, 渠慎春, 郭忠仁, 杜小麗, 都貝貝, 章鎮(zhèn). 植物bZIP轉錄因子的生物學功能. 西北植物學報, 2011, 31(5): 1066-1075.

ZHANG J Y, QU S C, GUO Z R, DU X L, DU B B, ZHANG Z. Biology function of BZIP transcription factors in plants., 2011, 31(5): 1066-1075. (in Chinese)

[5] JIN Z, XU W, LIU A. Genomic surveys and expression analysis ofgene family in castor bean (L.)., 2014, 239(2): 299-312.

[6] NIJHAWAN A, JAIN M, TYAGI A K, KHURANA J P. Genomic survey and gene expression analysis of the basic leucine zipper transcription factor family in rice., 2008, 146(2): 333-350.

[7] WEI K, CHEN J, WANG Y, CHEN Y, CHEN S, LIN Y, PAN S, ZHONG X J, XIE D X. Genome-wide analysis of bZIP-encoding genes in maize., 2012, 19(6): 463-476.

[8] LIU J Y, CHEN N N, FEI C B C, SILVIA D S, GIOVANNI B T, MARIO P, CHENG Z M. Genome-wide analysis and expression profile of the bZIP transcription factor gene family in grapevine ().,2014, 15: 281.

[9] POURABED E, GHANE GOLMOHAMADI F, SOLEYMANI MONFARED P, RAZAVI S M, SHOBBAR Z S. Basic leucine zipper family in barley: genome-wide characterization of members and expression analysis., 2015, 57(1): 12-26.

[10] BALOGLU M C, ELDEM V, HAJYZADEH M, UNVER T. Genome-wide analysis of the BZIP transcription factors in cucumber., 2014, 9(4): e96014.

[11] BAI Y L, ZHU W B, HU X C, SUN C C, Li Y L, WANG D D, WANG Q H, PEI G L, ZHANG Y F, GUO A G, ZHAO H X, LU H B, MU X Q, HU J J, ZHOU X N, XIE C G. Genome-wide analysis of the BZIP gene family identifies two ABI5-Like BZIP transcription factors, BrABI5a and BrABI5b, as positive modulators of ABA signalling in Chinese cabbage., 2016, 11(7): e0158966.

[12] WANG Y, LI L, YE T, LU Y, CHEN X, WU Y. The inhibitory effect of ABA on floral transition is mediated by ABI5 in., 2013, 64(2): 675-684.

[13] HUANG X S, LIU J H, CHEN X J. Overexpression ofgene, a BZIP transcription factor isolated from, enhances dehydration and drought tolerance in tobacco via scavenging ROS and modulating expression of stress-responsive genes., 2010, 10: 230.

[14] KIM S, KANG J Y, CHO D I, PARK J H, KIM S Y. ABF2, an ABRE-binding BZIP factor, is an essential component of glucose signaling and its overexpression affects multiple stress tolerance., 2004, 40(1): 75-87.

[15] LEE S J, KANG J Y, PARK H J, KIM M D, BAE M S, CHOI H I, KIM S Y. DREB2C interacts with ABF2, a BZIP protein regulating abscisic acid-responsive gene expression, and its overexpression affects abscisic acid sensitivity., 2010, 153(2): 716-727.

[16] XU Q, CHEN L L, RUAN X A, CHEN D J, ZHU A D, CHEN C L, BERTRAND D, JIAO W B, HAO B H, LYON M P, CHEN J J, GAO S, XING F, LAN H, CHANG J W, GE X H, LEI Y, HU Q, MIAO Y, WANG L, XIAO S X, BISWAS M K, ZENG W F, GUO F, CAO H B, YANG X M, XU X W, CHENG Y J, XU J, LIU J H, LUO J H, TANG Z H, GUO W W, KUANG H H, ZHANG H Y, ROOSE M, NAGARAJAN N, DENG X X, RUAN Y J. The draft genome of sweet orange ()., 2013, 45(1): 59-66.

[17] FAWAL N, LI Q, MATHé C, DUNAND C. Automatic multigenic family annotation: risks and solutions., 2014, 30(8): 323-325.

[18] KELLER O, ODRONITZD F, STANKE M, KOLLMAR M, WAACK S. Scipio: using protein sequences to determine the precise exon/ intron structures of genes and their orthologs in closely related species., 2008, 9: 278D.

[19] GUINDON S, DUFAYARD J F, LEFORT V, ANISIMOVA M, HORDIJK W, GASCUEL O. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0.,2010, 59(3): 307-321.

[20] TAMURA K, STECHER G, PETERSON D, FILIPSKI A, KUMAR S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0., 2013, 30(12): 2725-2729.

[21] TIPPMANN H F. Analysis for free: comparing programs for sequence analysis., 2004, 5(1): 82-87.

[22] VOORRIPS R E. MapChart: software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs., 2002, 93(1): 77-78.

[23] YU C S, LIN C J, HWANG J K. Predicting subcellular localization of proteins for gram-negative bacteria by support vector machines based on-peptide compositions., 2004, 13(5): 1402-1406.

[24] KOSUGI S, HASEBE M, TOMITA M, YANAGAWA H. Systematic identification of yeast cell cycle-dependent nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs., 2009, 106(25): 10171-10176.

[25] KOSUGI S, HASEBE M, MATSUMURA N, TAKASHIMA H, MIYAMOTO-SATO E, TOMITA M, YANAGAWA H. Six classes of nuclear localization signals specific to different binding grooves of importin., 2009, 284(1): 478-485.

[26] BAILEY T L, BODéN M, BUSKE F A, FRITH M, GRANT C E, CLEMENTI L, REN J, LI W W, NOBLE W S. MEME suite: tools for motif discovery and dearching., 2009, 37(Suppl. 2): W202-W208.

[27] LESCOT M, DéHAIS P, THIJS G, MARCHALA K, MORESU Y, PEER Y V, ROUZé P, ROMBAUTS S. PlantCARE, a database of plant-acting regulatory elements and a portal to tools foranalysis of promoter sequences., 2002, 30(1): 325-327.

[28] XU K, HUANG X, WU M, WANG Y, CHANG Y, LIU K, ZHANG J, ZHANG Y, ZHANG F L, YI L M, LI T T, WANG R Y, TAN G X, LI C W. A rapid, highly efficient and economical method of-mediatedtransient transformation in living onion epidermis., 2014, 9(1): e83556.

[29] BARAH P, WINGE P, KUSNIERCZYK A, TRAN D H, BONES A M. Molecular signatures inin response to insect attack and bacterial infection., 2013, 8(3): e58987.

[30] ABBAS N, CHATTOPADHYAY S. CAM7 and HY5 genetically interact to regulate root growth and abscisic acid responses., 2014, 9(9): e29763.

[31] JUNG J, WON SY, SUH SC, KIM H, WING R, JEONG Y, HWANG I, KIM M. The barley ERF-type transcription factor HvRAF confers enhanced pathogen resistance and salt tolerance in., 2007, 225(3): 575-588.

（責任編輯 岳梅）

附表1 甜橙的BZIP基因家族

Table S1 The BZIP gene family in

名稱NameCAP 序號CAP IDPHYTOZOME序號PHYTOZOME ID氨基酸數(shù)目Number of amino acid分子量MW (Da)等電點PI CsBZIP01Cs1g02310orange1.1g018238m35940694.617.58 CsBZIP02Cs1g16230orange1.1g045786m45350145.968.25 CsBZIP03Cs1g21370orange1.1g029952m18521565.7910.53 CsBZIP04Cs1g23780orange1.1g018605m35337267.854.94 CsBZIP05Cs1g25890orange1.1g041471m 22624569.4611.45 CsBZIP06Cs2g28995orange1.1g025739m24927909.3310.05 CsBZIP07Cs3g06150orange1.1g017286m37441773.17.56 CsBZIP08Cs3g06870orange1.1g021146m31735582.749.48 CsBZIP09Cs3g08880orange1.1g036551m45349075.3810 CsBZIP10Cs3g10860orange1.1g012287m 46650479.339.79 CsBZIP11Cs3g16310orange1.1g039918m14016314.255.36 CsBZIP12Cs3g18860orange1.1g045277m 33537531.429.39 CsBZIP13Cs3g18870orange1.1g036441m36141242.846.87 CsBZIP14Cs3g21220orange1.1g019163m 34538054.079.75 CsBZIP15Cs3g21410orange1.1g025985m 24527174.874.91 CsBZIP16Cs3g23480orange1.1g021624m 31033685.8510.81 CsBZIP17Cs3g25230orange1.1g041765m16318766.026.51 CsBZIP18Cs3g25760orange1.1g014471m 42446769.736.79 CsBZIP19Cs3g27850orange1.1g022379m 29833464.564.44 CsBZIP20Cs4g16750orange1.1g045005m14917325.349.97 CsBZIP21Cs5g11160orange1.1g015258m41045514.848.45 CsBZIP22Cs5g23040orange1.1g014327m42646456.76.57 CsBZIP23Cs5g30460orange1.1g013166m44848302.276.2 CsBZIP24Cs6g08980orange1.1g048456m21123516.827.6 CsBZIP25Cs6g14960orange1.1g043882m 45649574.589.04 CsBZIP26Cs6g15200orange1.1g011345m 48853375.787.78 CsBZIP27Cs6g16070orange1.1g020697m 32236003.976.9 CsBZIP28Cs6g16800orange1.1g035544m72778198.977.1 CsBZIP29Cs6g19350orange1.1g042014m16919480.686.15 CsBZIP30Cs7g05140orange1.1g030957m16818478.4210.28 CsBZIP31Cs7g07550orange1.1g015739m40143551.266.77 CsBZIP32Cs7g12290orange1.1g043159m 20122988.586.73 CsBZIP33Cs7g13010orange1.1g018357m 35739491.037.79 CsBZIP34Cs7g19070orange1.1g038233m 33236639.547.57 CsBZIP35Cs7g25940orange1.1g041582m15317288.1310.94 CsBZIP36Cs7g29820orange1.1g020026m33237008.195.43 CsBZIP37Cs8g06020orange1.1g013197m 44848529.3310.18 CsBZIP38Cs8g06860orange1.1g026806m23326184.157.57 CsBZIP39Cs8g07470orange1.1g044691m 17219237.296.24 CsBZIP40Cs8g15030orange1.1g036039m50856488.337.52 CsBZIP41Cs8g15050orange1.1g037676m26729628.917.87 CsBZIP42Cs8g20530orange1.1g035677m16819399.059.99 CsBZIP43Cs8g20540orange1.1g038341m351394486.05 CsBZIP44orange1.1t00453orange1.1g014660m42144628.429.11 CsBZIP45orange1.1t01674orange1.1g032187m14516628.358.49 CsBZIP46orange1.1t03130orange1.1g007579m59764817.566.98 CsBZIP47orange1.1t04546orange1.1g037696m36340884.687.01

附圖1 甜橙中BZIPs的結構域分析

Fig. S1 The motifs of BZIPs in

Gene Cloning and Expression Analysis of Canker-Related Transcription Factor CsBZIP40 in Citrus

JIA RuiRui, ZHOU PengFei, BAI XiaoJing, CHEN ShanChun, XU LanZhen, PENG AiHong, LEI TianGang, YAO LiXiao, CHEN Min, HE YongRui, Li Qiang

(Citrus Research Institute, Southwest University/Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712)

【Objective】The objective of this study is to annotate the BZIP family and clone the citrus canker related transcription factor CsBZIP40. It is also aimed to confirm the subcellular localization and the expression profile reduced by exogenous hormone and mechanical damage and the relations betweenandsubsp.() infection. 【Method】Based on the public genome databases, the BZIP gene family was expertly and comprehensively annotated and named based on the chromosomal localization of all the members of BZIP; the motifs of the BZIPs were analyzed by MEME online tool. the phylogenetic tree of BZIPs inandwas constructed using software Mega 6.0 based on which the category of BZIP family was obtained. Canker-related transitional factorobtained from transcriptome data was also detected by qRT-PCR. Elements in the promoter and the nuclear localization signal were analyzed with database plantCARE and online tool cNLSmapper, respectively. And then the subcellular localization was confirmed by GFP fusion experiments in onion to confirm the prediction of nuclear localization analyzed with softwares. Expression profiles induced by salicylic acid (SA), jasmonic acid methyl ester (MeJA), ethylene (ET) and mechanical damage ofwere checked with qRT-PCR. 【Result】A total of 47genes were annotated from the whole genome ofand all theare located on every chromosome except the 9th one. Theconcentration on chromosome 3 are 4.5×10-7/Mb which is the highest while chromosome 2 is the lowest, contains only 2% of allin citrus. There were fewer gene duplication events detected from BZIP family of citrus compared with other plants, such as, grapevine and so on. That is why citrus has a smaller BZIP family size. The full-length ofis 5 756 bp with a 1 530 bp open reading frame which codes a protein containing 509 amino acids. It is closely related tobased on the evolutionary analysis. In citrus, the BZIPs have been annotated which can be divided into 10 different sub-families.belongs to sub-family D, which is always take part in the pathogen resistance in plants. The gene promoter contains multiple cis involved in plant adversity or hormone response, such as Box-W1, HSE, ERE and so on. Subcellular localization results confirmed the prediction of protein localization in nucleus. Based on the qPCR data, the exogenous salicylic acid cannot induce the different expression of, in contrast, jasmonic acid methyl ester, mechanical damage and ethylene can induce significant differences in gene expression level.attack can significantly increase the expression level ofCalamondin but no difference in Newhall navel orange. 【Conclusion】CsBZIP40 would be an important transcription factor which is closely associated with the resistance of citrus canker. This gene should be a potential candidate in the molecular breeding to improve the canker resistance of citrus.

citrus canker; BZIP; transcription factors; subcellular localization

2017-01-09；接受日期：2017-02-27

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)柑桔產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-27）、中央高校基本科研業(yè)務費（XDJK2015C089，SWU115025，XDJK2014A08）

賈瑞瑞，E-mail：jiarui0678@foxmail.com。通信作者李強，E-mail：liqiang@cric.cn。通信作者何永睿，E-mail：heyongrui@cric.cn