小麥鋅指轉錄因子TaDi19A對低溫的響應及其互作蛋白的篩選

茹京娜，于太飛，陳雋，陳明，周永斌，馬有志，徐兆師，閔東紅

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小麥鋅指轉錄因子TaDi19A對低溫的響應及其互作蛋白的篩選

茹京娜1,2，于太飛2，陳雋2，陳明2，周永斌2，馬有志2，徐兆師2，閔東紅1

（1西北農(nóng)林科技大學/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌712100；2中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學工程/農(nóng)業(yè)部麥類生物學與遺傳育種重點實驗室，北京100081）

【目的】鋅指類轉錄因子在植物逆境信號轉導和非生物脅迫響應中發(fā)揮重要的作用。通過對小麥鋅指轉錄因子基因的耐冷性能進行鑒定，利用酵母雙雜交技術篩選并獲得與TaDi19A互作的候選蛋白，以解析介導的抗逆調控機制?！痉椒ā客ㄟ^對低溫處理的小麥轉錄組測序結果進行分析，獲得一個鋅指類轉錄因子。利用生物信息學的方法分析的分子特性，用SMART在線工具進行蛋白結構分析；用GSDS和PHYRE2在線工具分別對結構和蛋白三級結構進行分析；用NetPhos 2.0 Server數(shù)據(jù)庫預測TaDi19A蛋白磷酸化位點。以低溫處理的小麥cDNA作為模板，通過SYBR Green染料法進行實時熒光定量PCR，檢測在低溫處理不同時間段的表達模式。構建植物表達載體pBI121-，通過花序侵染法轉化擬南芥，用T3代擬南芥進行耐冷性鑒定，分析低溫處理對轉基因擬南芥的根長、鮮重和存活率的影響。檢測轉擬南芥中抗逆相關基因表達變化，分析調控植物耐冷性的作用機制。構建誘餌載體pGBKT7-，驗證自激活活性；利用酵母雙雜交技術，將誘餌載體pGBKT7-和小麥cDNA文庫共轉化酵母AH109感受態(tài)細胞，通過SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和X-α-gal顯藍反應篩選得到陽性克隆，測序和BLAST分析獲得候選蛋白?！窘Y果】小麥編碼區(qū)全長747 bp，編碼248個氨基酸，分子量為28.03 kD，等電點為4.74，基因含4個外顯子，3個內含子。TaDi19A蛋白靠近N-端包含鋅指結合結構域，C端為Di19結構域，預測的TaDi19A蛋白三級結構包含2個α螺旋結構。磷酸化位點分析結果顯示TaDi19A蛋白含有12個絲氨酸、9個蘇氨酸和3個酪氨酸磷酸化位點。實時熒光定量PCR結果顯示，受低溫脅迫誘導表達。正常生長條件下，轉基因和野生型擬南芥沒有明顯差異，低溫處理下，轉基因擬南芥的根長明顯大于野生型擬南芥，并且耐冷性強于野生型擬南芥。下游基因檢測結果表明，低溫處理后，、和等冷脅迫響應相關基因在野生型和轉基因植株中表達量都升高，在轉基因植株中的表達量顯著高于野生型，表明可能通過調節(jié)下游冷脅迫響應相關基因的表達提高轉基因植物的耐冷性。通過對酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到的候選互作蛋白進行初步分析表明，這些候選互作蛋白主要參與植物體的信號轉導和非生物脅迫響應過程，表明在植物的逆境信號轉導及非生物脅迫響應過程中發(fā)揮著重要作用?！窘Y論】小麥受低溫誘導表達，過表達能夠提高轉基因擬南芥的耐冷性；而功能的發(fā)揮可能需要其他蛋白的參與。

普通小麥；鋅指轉錄因子；耐冷性；酵母雙雜交；蛋白互作

0 引言

【研究意義】干旱、鹽堿、高溫、低溫等非生物脅迫因子嚴重影響作物的產(chǎn)量和品質[1]，其中低溫是一個非常重要的環(huán)境因子。近年來氣候變化異常，極端低溫天氣出現(xiàn)頻繁，低溫寒害已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的嚴重自然災害之一。低溫通過影響植物細胞膜成分，氣孔開度等生理、生化過程對植物造成傷害，限制作物的種植區(qū)域，影響作物的產(chǎn)量[2]。植物遭受冷脅迫時，從接收低溫信號到引起生理生化反應，再到調節(jié)基因表達，最后產(chǎn)生耐冷能力，存在一個復雜的信號傳導系統(tǒng)[3-4]，其中低溫脅迫相關轉錄因子的作用尤為關鍵，它可以誘導下游多個耐冷基因的表達從而提高植物的耐冷性[5]。小麥是世界重要的糧食作物之一，低溫凍害和倒春寒對小麥生產(chǎn)造成了嚴重的威脅。因此，發(fā)掘小麥耐冷相關轉錄因子基因，研究其調控機制，對于完善低溫脅迫應答的分子機制和利用分子手段改良作物耐冷性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物對逆境脅迫應答反應是一個涉及多基因、多信號傳導途徑及多基因表達產(chǎn)物的復雜過程[6]。其中轉錄因子是植物體內一類重要的調節(jié)因子。轉錄因子（transcription factor，TF）也稱反式作用因子，能夠與基因啟動子區(qū)域中順式作用元件特異性結合，調節(jié)眾多下游基因的表達，對植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、以及抵抗非生物脅迫起重要作用[7-9]。自植物中最早的轉錄因子在玉米中被報道以來[10]，已從植物中分離鑒定出大量轉錄因子，根據(jù)DNA結構域的特點將轉錄因子分成若干個家族，包括WRKY、AP2/EREBP、MYB、bZIP和ZFPs等[11-12]。在植物對低溫脅迫的響應過程中，轉錄因子通過調控下游抗逆相關基因的表達起著重要的作用[13]。低溫能夠誘導多種植物基因的表達，如、、或者等[14-16]。CBFs/DREBs轉錄因子能夠與COR/KIN/LTI/RD基因啟動子區(qū)的DRE/CRT順式作用元件結合并調控其表達[17-18]。擬南芥中過表達和能調控下游冷誘導基因的表達，產(chǎn)生高水平的脯氨酸和可溶性糖，從而提高植物的耐冷性[19-21]；冷處理下能夠負向調控和的表達，從而調控下游基因表達及擬南芥的耐冷性[22]。編碼一個MYC類bHLH 轉錄因子，位于CBFs上游，正向調控CBFs，過表達的同源基因同樣能夠提高擬南芥的耐冷性[23-24]。這些研究都表明CBF-依賴途徑在植物低溫脅迫中起著重要的作用。除了CBF-依賴途徑，在植物的低溫脅迫響應中還存在著多重的信號途徑[25-27]。C2H2類鋅指蛋白是真核生物中最大的轉錄因子家族之一，在植物非生物脅迫響應中起著重要作用[8, 28-29]，其中一些C2H2類鋅指蛋白對低溫脅迫響應。例如大豆的鋅指蛋白基因，能夠提高bZIP類轉錄因子SGBF-1與ABRE的結合效率，調控轉基因植物對低溫的耐受性[30]；另一個大豆的鋅指蛋白基因能夠被ABA、鹽、干旱和低溫誘導，增強轉基因擬南芥對干旱和低溫的耐受性[13]。據(jù)報道，水稻鋅指蛋白基因//和沙冬青的鋅指蛋白基因受多種非生物脅迫誘導，均提高了轉基因植株對冷、干旱和鹽脅迫的耐受性[11, 31-34]。雖然近幾年生物技術發(fā)展迅速，但是植物C2H2類鋅指蛋白的生理生化功能研究還很少。到目前為止，大部分被鑒定的植物脅迫相關的C2H2類鋅指蛋白都在干旱和鹽脅迫中起著重要作用，然而其中很少涉及到冷脅迫響應，尤其是在作物中[30-31]?！颈狙芯壳腥朦c】小麥是世界重要的糧食作物之一，而低溫凍害和倒春寒卻限制了小麥的種植區(qū)域。本研究通過對低溫處理的小麥轉錄組測序結果進行分析，獲得一個Di19家族轉錄因子。Di19家族屬于鋅指蛋白中的一個小家族，包含zf-di19和di19_C結構域，涉及到植物非生物脅迫響應[35-37]。在擬南芥、水稻和大豆中分別鑒定出了7個成員[35, 38-39]，而在小麥中的研究卻很少。小麥中，LI等[40]發(fā)現(xiàn)對植物非生物脅迫響應起著重要作用，過表達能提高擬南芥在萌發(fā)期對鹽脅迫、ABA和甘露醇的敏感性，根長試驗表明過表達能夠降低植株對鹽脅迫的耐受性和對乙烯的敏感性，然而關于Di19在小麥冷脅迫響應中的研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過實時熒光定量PCR鑒定了在低溫脅迫下的表達模式，以及轉基因擬南芥對低溫脅迫的響應；為了進一步研究的耐冷作用機制，利用酵母雙雜交技術以pGBKT7-為誘餌篩選小麥cDNA文庫，篩選可能與其互作的候選蛋白，為研究小麥Di19轉錄因子抗逆調控機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及脅迫處理

普通小麥（L.）農(nóng)家品種小白麥是由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所景蕊蓮研究員提供。將其播種在土中于22℃生長1周，然后對其進行低溫脅迫處理：將小麥幼苗放入4℃繼續(xù)生長，并于1、2、4、8、12和24 h分別取樣。取2周大的野生型擬南芥（Columbia-0）和過表達的擬南芥進行下游脅迫相關基因的分析。將所取樣品迅速放入液氮中，然后保存到-80℃冰箱中。

1.2 基因的生物信息學分析

小麥TaDi19A數(shù)據(jù)來源于EnsemblPlants（http:// plants.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫。小麥TaDi19A蛋白的分子量和等電點用在線工具 Compute pI/Mw tool（http://web.expasy.org/protparam/）計算。其余的生物信息學分析方法如下：利用SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）在線工具分析小麥TaDi19A蛋白的結構域；利用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）制作小麥TaDi19A外顯子-內含子結構示意圖；利用PHYRE2（http://www.sbg. bio.ic.ac.uk/ phyre2.html）在線工具對TaDi19A蛋白三級結構進行分析[41]。利用NetPhos 3.1 Server數(shù)據(jù)庫（http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）預測TaDi19A蛋白磷酸化位點。

1.3 RNA提取和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

用植物總RNA提取試劑盒（天根，北京）提取不同時間段低溫處理的小麥RNA和擬南芥RNA，按照反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明書將提取的RNA反轉錄成單鏈cDNA。然后將反轉錄的cDNA模板均稀釋到200 ng·μL-1，以SYBR Green染料法，在ABI 7500（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）儀器上進行實時熒光定量PCR反應。反應體系及程序參見Feng等[38]。每個反應3次重復。按照基因相對表達分析2-ΔΔCT方法分析和擬南芥脅迫相關基因的相對表達量及其標準差。

1.4 轉基因擬南芥的產(chǎn)生及低溫鑒定

將的編碼序列構建到帶有CaMV35S啟動子的pBI121表達載體上，轉入GV3101農(nóng)桿菌中，通過花序侵染法侵染開花期的野生型擬南芥。轉基因擬南芥的篩選參照HE等[42]，T3純合轉基因種子和野生型種子用于低溫表型鑒定。

將野生型WT與T3轉基因擬南芥種子用70%的酒精洗3 min，無菌水洗3次，0.7%的NaClO溶液泡15 min，無菌水再沖洗3次，晾干后點種于MS0培養(yǎng)基上。先在4℃春化3 d打破休眠，然后轉移到16 h光照/8 h黑暗、60%相對濕度、22℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)生長。將生長5 d的擬南芥幼苗移到新的MS0培養(yǎng)基上，將其分別放入22℃和4℃直立生長，觀察轉基因和野生型植株根部的生長狀況，統(tǒng)計根長和鮮重。將生長10 d大的擬南芥幼苗轉移到營養(yǎng)土中（蛭石﹕泥炭土=1﹕1），在適宜條件下（16 h光照/8 h黑暗、溫度22℃、相對濕度60%）生長3周，隨后進行低溫處理：4℃放置3 h進行冷適應，轉移到-10℃放置5 h，然后轉移到4℃放置3 h，最后轉移到正常生長條件（22℃）恢復生長5 d，觀察表型，統(tǒng)計存活率并照相。采用檢驗方法，對所有數(shù)據(jù)進行顯著性分析?！?.05即為差異顯著，用一顆黑色五星標注，≤0.01即為差異極顯著，用兩顆黑色五星標注。

1.5 小麥cDNA文庫構建和誘餌載體構建

利用RNA提取試劑盒（天根，北京）提取小麥葉片的總RNA，將提取的RNA反轉錄合成cDNA第一鏈（TaKaRa，大連），以反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板進行LD-PCR擴增，反應程序和后續(xù)反應按照于太飛等[43]的方法進行，最終得到小麥cDNA文庫。

根據(jù)的序列以及誘餌載體pGBKT7（Clontech，美國）的限制性酶切位點設計特異引物，通過PCR技術擴增的編碼序列。pGBKT7采用Ⅰ單酶切，將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物切膠回收，然后通過In-Fusion技術（TaKaRa，大連）連接后轉化入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞中（天根，北京）。測序比對正確后提取質粒得到pGBKT7-重組質粒。

1.6 TaDi19A互作蛋白的篩選

酵母AH109的感受態(tài)細胞按照試劑盒說明書（Yeastmaker? Yeast TransformationSystem 2 User Manual，Clontech）制備。自激活驗證的方法參照于太飛等[43]的方法。首先將1 μg的pGBKT7-重組質粒加入50 μL新制備的酵母感受態(tài)細胞中，再加入500μL PEG/LiAc，混勻后30℃水浴30 min，每5min顛倒混勻一次；再加入20 μL DMSO，42℃水浴15 min，每5min顛倒混勻一次；8000r/min離心15 s，棄上清，將菌體重懸于1 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)90min；高速離心棄上清，將菌體重懸于0.9%的NaCl中，然后涂到SD/-Trp、SD/-Trp/-His/-Ade固體培養(yǎng)基上，驗證pGBKT7-是否存在自激活。

將5 μg的誘餌載體pGBKT7-質粒及5 μg 的小麥cDNA文庫質粒加入600 μL制備好的酵母感受態(tài)細胞中，再加入2.5 mL PEG/LiAc，混勻后30℃水浴45 min，期間每10 min顛倒混勻一次；再加入160 μL DMSO，混勻后42℃水浴20 min，每10 min顛倒混勻一次；200 r/min離心5 min棄上清，將菌體重懸于1 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)90 min；200 r/min離心5 min棄上清，將菌體重懸于0.9%的NaCl中，然后涂到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)4 d左右；挑取直徑大于2 mm的單克隆，重懸于0.9%的NaCl中，然后點涂到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-gal顯藍板上避光培養(yǎng)，篩選藍色陽性單克隆。

挑取篩選到的陽性菌落于1 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃，230 r/min振蕩培養(yǎng)，待菌液搖混后進行PCR檢測。PCR反應條件參照于太飛等[43]的方法。將插入片段大小在1 000 bp左右的酵母單克隆提取質粒并轉化到大腸桿菌TOP10（天根，北京）中，測序，然后將測序結果在 NCBI 網(wǎng)站進行同源性BLAST分析。

2 結果

2.1生物信息學分析

通過對低溫處理的小麥轉錄組測序結果進行分析，獲得一個鋅指類轉錄因子。小麥全長747 bp，編碼248個氨基酸，分子量為28.03 kD，等電點為4.74，基因含有4個外顯子和3個內含子（圖1-A）；TaDi19A蛋白靠近N-端包含鋅指結合結構域，C端為Di19結構域（圖1-B），預測的TaDi19A蛋白三級結構包含2個α螺旋結構（圖1-C），有助于折疊成正確的蛋白結構，從而行使其生物學功能；磷酸化位點分析結果顯示TaDi19A含有12個絲氨酸、9個蘇氨酸和3個酪氨酸磷酸化位點，推測磷酸化作用可能與TaDi19A蛋白的活性調控有關。

2.2低溫脅迫響應分析

為進一步研究對低溫脅迫的響應，通過實時熒光定量PCR分析在低溫處理不同時間段的表達模式。結果顯示，在低溫脅迫下，上調表達，在脅迫處理2 h時達到最大值，為對照的25倍，之后表達量迅速下降，處理后12 h后恢復到初始水平（圖2）。

2.3 轉擬南芥植株的耐冷性鑒定

為進一步研究對低溫脅迫的響應，通過獲得的轉基因擬南芥（圖3）分析其在低溫脅迫下的根長和耐冷性。在正常生長條件下，野生型擬南芥與3個轉基因株系的主根長、總根長和鮮重均沒有顯著差異。而在4℃處理后，野生型和轉基因擬南芥的生長都受到抑制，野生型擬南芥受抑制的程度要比轉基因植株嚴重，轉基因擬南芥的主根長、總根長和鮮重都顯著高于野生型擬南芥（圖4）。例如，在低溫處理20 d后，野生型擬南芥的主根長平均為2.4 cm左右，而轉基因擬南芥達到2.9 cm左右。

為進一步檢測野生型和轉基因擬南芥的耐冷性，將植株種在土盆里于22℃生長4周，隨后經(jīng)4℃/3 h、-10℃/5 h和4℃/3 h低溫處理，22℃/5 d恢復正常生長，發(fā)現(xiàn)大約60%野生型擬南芥存活，而大約90%的轉基因植株存活，轉基因植株的存活率明顯高于野生型（圖5）。無論是低溫根長試驗還是存活率都表明轉基因植株的耐冷性強于野生型擬南芥，表明提高了轉基因植株的耐冷性。

2.4 冷脅迫相關基因在轉植株中的表達

為研究耐低溫脅迫應的機制，檢測正常生長情況下轉基因和野生型擬南芥植株中冷脅迫響應有關基因的表達。結果顯示，正常生長條件下，除了在轉基因擬南芥中的表達量比野生型高之外，、和的表達量在野生型和轉基因擬南芥中沒有顯著差異；4℃處理后，、、和在野生型和轉基因擬南芥中表達量都有顯著提高，但在轉基因植株的表達量明顯高于野生型，如在轉基因擬南芥中的表達量是野生型的2倍多（圖6）。結果表明，能正向調控、、和的表達，并通過調控冷脅迫相關基因的表達提高轉基因植株的耐冷性。

2.5 誘餌載體的構建及自激活檢測

將編碼區(qū)全長構建到pGBKT7誘餌載體上，用PCR技術進行菌液檢測，瓊脂糖電泳得到與目的片段大小相符的單一條帶約750 bp，經(jīng)測序和序列比對，提取正確的重組質粒pGBKT7-。

為檢測是否存在自激活活性，將pGBKT7-重組質粒轉入酵母感受態(tài)細胞中，轉化產(chǎn)物分別涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His/-Ade的固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d，結果只有在SD/-Trp培養(yǎng)基長出酵母菌落，而SD/-Trp/-His/-Ade平板上沒有菌落長出（圖7）。表明pGBKT7-成功轉入酵母感受態(tài)細胞，且無自激活活性，可以用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選小麥cDNA文庫。

2.6 小麥cDNA文庫的篩選以及候選互作蛋白序列分析

為解析的抗性機理，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選其可能的互作候選蛋白。將誘餌載體pGBKT7-質粒與小麥cDNA文庫質粒共轉化酵母感受態(tài)細胞，轉化后產(chǎn)物涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)4 d左右，挑取直徑大于2 mm的單克隆，點涂于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-gal顯藍板上培養(yǎng)，篩選藍色陽性單克?。▓D8）。

將顯藍的單克隆進行菌液PCR檢測，結果表明不同克隆插入的片段大小不同，大部分集中在1 000 bp 左右（圖9），大部分克隆擴增結果為1條帶，但還有一些克隆擴增結果為2條帶。將插入片段大小在1 000 bp左右的單克隆提質粒并轉化到大腸桿菌TOP10（天根，北京）中，送達公司測序，然后將測序結果在NCBI網(wǎng)站進行同源性比對分析。通過序列比對分析結果（表1），發(fā)現(xiàn)篩選出的互作候選蛋白包括金屬硫蛋白、PSBR蛋白、溫度誘導的脂質運載蛋白、熱激蛋白、低溫誘導蛋白、核轉運因子等，其中大多能夠參與植物對逆境脅迫響應，還有的能介導細胞內代謝物質交換，還有一些編碼功能未知蛋白。例如金屬硫蛋白能夠解除金屬離子的毒害、維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定、消除活性氧的危害，對植物抵御非生物脅迫有著重要作用[44]；核轉運因子能夠協(xié)助運載物運進或運出細胞；溫度誘導的脂質運載蛋白能夠傳遞信號并調節(jié)植物抵御逆境[45]；低溫誘導蛋白和熱激蛋白都能參與植物對逆境脅迫的響應等[46-48]。這些蛋白能參與植物的能量代謝以及對非生物脅迫的響應，對植物抵御逆境脅迫有著重要的作用。

3 討論

干旱、鹽堿、高溫、低溫等非生物脅迫因子嚴重影響植物的生長和發(fā)育。目前已經(jīng)報道的參與逆境脅迫調控過程的蛋白主要分兩類：一類是功能蛋白，主要參與逆境脅迫的直接調控，包括分子伴侶、離子通道蛋白等；另一類是調節(jié)蛋白，包括轉錄因子、蛋白激酶等信號分子[49]。其中轉錄因子能夠與基因啟動子區(qū)域中順式作用元件特異性結合，是一大類轉錄調控因子。本研究從低溫處理的小麥轉錄組測序結果中獲得了一個轉錄因子基因。Di19蛋白編碼一個小基因家族，包含保守的C2H2鋅指結構域，屬于鋅指類轉錄因子，在植物的生長、發(fā)育和非生物脅迫響應中起著重要的作用[35-37]。擬南芥中Di19基因廣泛的在不同組織中表達，包括幼苗、根、莖、花和果實中；和能夠快速被干旱脅迫誘導，和在高鹽的誘導下表達量增加，而與光信號的調控有關，對非生物脅迫無響應[50-51]。擬南芥能結合、、啟動子的TACA(A/G)T元件，增強其表達，過表達能提高轉基因擬南芥的抗旱性[35]。另外擬南芥Di19家族成員能夠以Ca2+依賴的方式被CPK11和CPK3磷酸化[50]。qRT-PCR和芯片數(shù)據(jù)分析表明，水稻7個Di19家族成員能夠大量在營養(yǎng)器官中表達，但在生殖器官中表達量很少，一些能顯著被非生物脅迫和外源激素誘導[37]。過表達通過增強ROS的清除活性提高轉基因水稻的抗旱性，并且轉基因水稻對ABA高度敏感，敲除表現(xiàn)出對ABA敏感性降低[37,39]。與互作并磷酸化，ABA處理后的磷酸化作用增強，提高了調控下游ABA相關基因的能力[39]。大豆中共鑒定出了7個Di19基因，每個Di19基因對鹽、干旱、氧化、ABA脅迫有著特定的響應。在非生物脅迫中起著負調的作用，過表達提高了轉基因擬南芥對鹽、干旱、氧化和ABA脅迫的敏感性；GmDi19-5與GmLEA3.1互作，通過調控脅迫相關基因的表達參與ABA和SOS信號通路[38]。

表1 候選基因的BLAST分析結果及其功能推測

小麥在植物對非生物脅迫的響應中起著重要作用，過表達提高了擬南芥在萌發(fā)期對鹽、ABA和甘露醇的敏感性，過表達降低了擬南芥在苗期對鹽脅迫的耐受性和對乙烯的敏感性[40]。FAN等[52]發(fā)現(xiàn)能被多種脅迫誘導，過表達提高了轉基因擬南芥的耐鹽性。這些研究都表明Di19在植物非生物脅迫響應中起著重要的作用。

本研究從低溫處理的小麥轉錄組測序結果中獲得了。實時熒光定量PCR結果表明受低溫誘導；低溫處理的根長試驗，轉基因和野生型擬南芥的耐冷性鑒定（圖4和圖5）都表明過表達能提高轉基因植株的耐冷性。為研究耐冷脅迫響應機制，通過檢測正常和低溫處理情況下轉基因和野生型擬南芥中冷脅迫響應相關基因的表達，表明能正向調控、、和的表達，說明可能通過調控冷脅迫相關基因的表達提高轉基因植株的耐冷性。為進一步研究調控植物冷脅迫響應的作用機制，本研究通過酵母雙雜交技術篩選到一些可能與TaDi19A互作的候選蛋白，其中括金屬硫蛋白、PSBR蛋白、溫度誘導的脂質運載蛋白、熱激蛋白、低溫誘導蛋白、核轉運因子等，其中大多能夠參與植物對逆境脅迫響應，比如熱激蛋白。熱激蛋白廣泛分布于真菌、動物和植物細胞中，研究發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白在高溫、低溫、干旱、過氧化等逆境下均能大量表達，通過作為分子伴侶促進其他蛋白合成、折疊、穩(wěn)定、運輸和降解等來維持植物內環(huán)境的穩(wěn)定，在植物抵御逆境及適應環(huán)境中發(fā)揮重要作用[53-54]。據(jù)報道，HSP90、HSP70家族和一些小的HSPs能在低溫響應中積累，通過保護細胞膜、蛋白質的重新折疊等抵御低溫脅迫[53]。當植物遭遇低溫脅迫時，表達量上升，熱激蛋白積累量增多，植物抵御低溫能力增強，TaDi9A可能通過與熱激蛋白相互作用提高轉基因擬南芥的耐冷性。

另外，有研究表明溫度誘導的脂質運載蛋白涉及非生物脅迫響應[55-57]。溫度誘導的脂質運載蛋白是一種膜蛋白，在低溫脅迫下大量積累[57]。擬南芥中缺失突變體對光和冷敏感，與野生型相比，過氧化氫和活性氧的積累增多；而過表達植株對冷和強光脅迫的耐受性增強[58]。小麥和苜蓿都響應低溫脅迫，轉煙草通過促進活性氧的清除和調控下游耐冷相關基因的表達提高轉基因植株的耐冷性[56-57]。本研究通過酵母雙雜交技術篩選出的脂質運載蛋白、熱激蛋白、低溫誘導蛋白等都是和溫度脅迫相關的蛋白，它們可能通過與TaDi9A相互作用共同調控植物對低溫脅迫的響應，這可能部分解釋了轉基因擬南芥的耐冷性提高。

4 結論

小麥受低溫脅迫誘導表達，過表達提高了轉基因擬南芥的耐冷性；TaDi19A可能通過與其他蛋白相互作用參與植物對低溫的響應過程。

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（責任編輯 李莉）

Response of Wheat Zinc-finger Transcription Factor TaDi19A to Cold and its screening of interacting proteins

RU JingNa1,2, YU TaiFei2, CHEN Jun2, CHEN Ming2, ZHOU YongBin2, MA YouZhi2, XU ZhaoShi2, MIN DongHong1

(1Northwest A & F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/ Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crop, Ministry of Agriculture, Beijing 100081)

【Objective】Zinc-finger transcription factors play an important role in stress signal transduction and abiotic stress response in plants. In this study, the function ofwas identified under low temperature stress and its interacting proteins were screened by yeast two-hybrid system to explore the regulation mechanism of.【Method】gene was isolated from the cold-treated wheat transcriptome profile. Bioinformatics method was used to analyze the molecular properties of thegene, SMART online tools were used for protein structure analysis; GSDS and PHYRE2 online tools were used to analyze gene structure and tertiary structure ofTaDi19A protein; NetPhos 2.0 Server database was used to predict phosphorylation sites ofTaDi19A protein. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR), conducted using the cold-treated wheat cDNA based on SYBR Green technology, was used to analyze the expression pattern ofunder cold temperature stress treatment in different time periods.was fused with PBI121 to transform into wild-type (WT)plants (Columbia-0) mediated by the floral dip method, homozygous T3seeds of transgenic lines and WT were used for cold tolerance analysis which the root length, fresh weight, and survival rate were measured before and after cold treatment. The expressions of four stress-response genes were investigated in transgenic lines and WT under normal and low temperature conditions to analyze the cold-resistant regulation mechanism of. Bait plasmid pGBKT7-was constructed and the self-activation was detected. The pGBKT7-and wheat cDNA library was co-transformed into yeast cell AH109 by two-hybrid system, and the positive clones were screened via SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade and SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal plate and these single clones were sequenced and analyzed by BLAST to obtain the interaction candidate proteins.【Result】The full length ofgene was 747 bp with 4 exons, encoding 248 amino acids, and the protein molecular weight and isoelectric point of were 28.03 kDa and 4.74, respectively. TaDi19A protein included Zinc-finger binding domain, Di19 domain and the predicted tertiary structure contained 2 alpha helix. Phosphorylation site analysis showed that there were 12 serine, 9 threonine, and 3 tyrosine phosphorylation sites in TaDi19A protein. qRT-PCR analysis showed thatwas induced by low temperature. The root length and cold tolerance assays revealed thattransgenicincreased the cold tolerance. the expression of several cold-stress-responsive genes was monitored through PCR analysis, the expression of genes,,andshowed elevated levels in both WT and transgenicplants under cold-stress condition, and the expression levels in transgenic plants were significantly higher than those in WT. analysis of candidate proteins screened by yeast two-hybrid system revealed that those proteins mainly affected the signal transduction and abiotic stress response, which demonstrated thatis critical to stress signal transduction and abiotic stress response in plants. 【Conclusion】Cold-inducibleimproved cold tolerance in transgenic;might work via interacting with other proteins.

; zinc-finger transcription factor; cold tolerance; yeast two-hybrid; protein interaction

2017-01-23；接受日期：2017-03-07

國家轉基因生物新品種培育科技重大專項（2014ZX08009-016B）、國家自然科學基金（31371620）、西北農(nóng)林科技大學唐仲英育種基金

茹京娜，E-mail：rujingna1993@163.com。通信作者閔東紅，E-mail：mdh2493@126.com。通信作者徐兆師，E-mail：xuzhaoshi@caas.cn