丁姜和胃膏貼劑體外透皮釋藥研究

張偉，曹嘉，王慧，曹云飛，王瑋*

(1. 青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東 青島 266033；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

丁姜和胃膏貼劑體外透皮釋藥研究

張偉1，曹嘉1，王慧1，曹云飛2，王瑋1*

(1. 青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)，山東 青島 266033；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

采用體外透皮擴(kuò)散池法，以離體大鼠腹部皮膚為屏障，對(duì)丁姜和胃膏貼劑透皮釋藥液中的丁香酚含量測(cè)定方法和不同時(shí)間段單位面積透皮累積釋藥量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，采用Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm，5μm)色譜柱，甲醇-水(65∶35，V/V)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm的色譜條件，丁香酚含量測(cè)定的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.932%，24 h內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.843%，平均加樣回收率為97.419 2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.426%。透皮釋藥呈現(xiàn)一種先快后慢趨勢(shì)，10 h以內(nèi)累積釋藥總量占20 h內(nèi)累積釋藥總量的76.71%,10～20 h內(nèi)累積釋藥總量?jī)H占23.29%。

丁姜和胃膏貼劑；體外透皮擴(kuò)散池法；離體大鼠皮膚屏障；丁香酚含量測(cè)定；單位面積累積滲透量

Abstract∶The in vitro transdermal diffusion cell method was applied, the abdominal skin of rats in vitro was taken as the barrier, and the content determination of eugenol in transdermal solution of Dingjiang Hewei plaster and the cumulative release amount of transdermal drug per unit area in different time periods were researched. Experimental results showed the chromatographic conditions were as followed: Agilent Zorbax SB-C18column (150 mm×4.6 mm, 5 μm), methanol-water(65∶35,V/V) as mobile phase, detection wavelength was 280 nm, the RSD of the repeatability of eugenol content was 0.932%, the RSD of sample solution stability within 24 h was 1.843%, the average recovery was 97.4192%，and its RSD was 1.426%. Eugenol transdermal drug release showed a trend of first fast, then slow. The total cumulative drug release within the first 10 h accounted for 76.71% of the total cumulative drug release within 20 h, while the accumulative release total amount within 10～20 h was only 23.29%.

Key words∶Dingjiang Hewei plaster; in vitro transdermal diffusion cell method；isolated rat skin as barrier；the content determination of eugenol；cumulative transdermal amount per unit area

丁姜和胃貼膏為青島市中醫(yī)醫(yī)院外用中藥制劑，具有疏通經(jīng)絡(luò)、扶正祛邪、降逆止嘔、行氣安胎之功效[1-2]，丁香酚作為丁香的主要活性成分[3-4]，是該貼膏劑中主要生物活性成分之一。本實(shí)驗(yàn)以丁香酚為指標(biāo)，進(jìn)行丁姜和胃膏貼劑離體透皮釋藥液中的丁香酚成分含量測(cè)定方法以及膏貼劑的離體透皮藥效學(xué)研究，為臨床合理選擇用藥方法提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

RYJ-6B型藥物透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；Agilent1100型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；HHW-4 型雙顯恒溫水浴鍋( 金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

丁香酚對(duì)照品(批號(hào)：110725-201414，純度99.8 %，中國(guó)食品藥品鑒定研究院)；甲醇(色譜純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用丁姜和胃膏貼劑(批號(hào)150615)，由青島市中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室按制備工藝制成。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康大鼠(動(dòng)物批號(hào)SCXK(魯)2014-0007)，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1體外透皮釋藥實(shí)驗(yàn)

2.1.1 離體鼠皮制備

將健康大鼠腹部用電動(dòng)剃毛機(jī)剃毛，再用8%的硫化鈉脫毛，頸椎脫臼處死后，立即小心剝離腹部皮膚，除去皮下脂肪組織及粘連物，用生理鹽水清凈[5-6]，置生理鹽水中于-20 ℃低溫冷凍保存?zhèn)溆肹7]。每次用前自然解凍，選取無破損的完整鼠皮應(yīng)用。

2.1.2 經(jīng)皮滲透釋藥實(shí)驗(yàn)

將自然解凍后的鼠皮表面用濾紙吸干水分，鼠皮外表面與揭去防粘保護(hù)膜的丁姜和胃膏貼劑緊密貼敷，剪成與接受室口徑大小一致的圓形貼片(2.8 cm2)，鼠皮內(nèi)側(cè)面(真皮層)面向接受室，貼上膏貼劑的鼠皮外表面面向擴(kuò)散室，再上夾固定于兩室之間。自側(cè)口向接受室中注滿37 ℃保溫的30%乙醇生理鹽水液(釋藥接收液)，排凈空氣，使鼠皮真皮層面與接受液充分接觸[8-9]；采用循環(huán)水浴保溫，開動(dòng)磁力攪拌子以150 r/min的恒速攪拌，維持接受室的動(dòng)態(tài)環(huán)境，開始計(jì)時(shí)。

本實(shí)驗(yàn)使用的藥物透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀共有6套獨(dú)立的滲透擴(kuò)散裝置，可以同時(shí)進(jìn)行6組獨(dú)立的經(jīng)皮滲透釋藥實(shí)驗(yàn)。為方便實(shí)驗(yàn)操作，將同一批次樣品膏貼劑分別安裝到6套裝置上，間隔30 min進(jìn)行6組獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 待測(cè)經(jīng)皮釋藥液制備

每組實(shí)驗(yàn)分別于開始計(jì)時(shí)后0.5、1、2、4、6、10、15、20 h 8個(gè)時(shí)間段從接受室側(cè)口全部取出釋藥接收液，同時(shí)自側(cè)口立即注滿37 ℃預(yù)溫的30%乙醇生理鹽水，排凈接受室氣泡后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)[10-11]。將取出的釋藥接收液(約6.15 mL)用三氯甲烷提取3次，每次0.5 mL，提取液用三氯甲烷定容至2.0 mL，作為待測(cè)釋藥液。6套滲透擴(kuò)散裝置上的6組經(jīng)皮滲透釋藥實(shí)驗(yàn)在設(shè)定的8個(gè)時(shí)間段，分別制得6組(每組8份)待測(cè)釋藥液，備用。

2.2丁香酚含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

精密吸取丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品適量，用一定量甲醇溶解后制成濃度為7.984 μg·mL-1的丁香酚對(duì)照品儲(chǔ)備液10.0 mL。微孔濾膜(直徑0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液適量，加甲醇稀釋制成濃度分別為0.7984、1.996、3.992、5.988、7.984 μg·mL-15個(gè)濃度梯度對(duì)照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液制備

將2.1.2項(xiàng)下方法制得的第一套滲透擴(kuò)散裝置釋藥組4 h的待測(cè)釋藥液作為供試品溶液，備用。

2.2.4 HPLC圖譜制備

將2.2.2項(xiàng)下濃度為5.988 μg·mL-1對(duì)照品溶液和2.2.3項(xiàng)下制得的供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，HPLC色圖譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖 Fig.1 The chromatogram of HPLC

2.2.5 對(duì)照品線性關(guān)系

將2.2.2項(xiàng)下濃度分別為0.798 4、1.996、3.992、5.988 、7.984 μg·mL-15個(gè)濃度梯度對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣、測(cè)定，記錄峰面積。以丁香酚濃度(X) 為橫坐標(biāo)，峰面積(Y) 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：Y=1 273.9X+17.853，r=0.998 7。結(jié)果表明，丁香酚濃度在0.798 4 ～7.984 μg·mL-1范圍內(nèi)其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取濃度為5.988 μg·mL-1丁香酚對(duì)照品溶液10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得丁香酚的峰面積積分值分別為8 167.1、890.2、8 101.5、8 304.2、8 253.5、8 283.4，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.941 % (n=6)。表明該方法精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密吸取2.2.3項(xiàng)下制成的同一批供試品溶液6份，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次。丁香酚的峰面積積分值分別為7 103.5、7 145.6、7 185.9、7 148.2、7 202.7、7 018.2，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.932 %，表明樣品重復(fù)性較好。

2.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取2.2.3項(xiàng)下制成的同一批供試品溶液適量，分別室溫放置0、2、4、8、10、12、24 h后進(jìn)樣測(cè)定，丁香酚峰面積積分值分別為7 103.5、7 115.6、7 185.9、7 285.2、7 380.7、7 415.2。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.843 %，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取已知丁香酚含量為5.562 2 μg·mL-1的透皮釋藥液5份，每份1.0 mL，分別精密加入濃度為7.984 μg·mL-1的丁香酚對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6L、0.8、1.0 mL，用甲醇定容至2.0 mL，分別制成理論值為3.579 7、4.377 9、5.026 2、5.974 7、6.773 1 μg·mL-1的5份加樣樣品液；按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣、測(cè)定。5份樣品重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定5次，計(jì)算各份樣品平均回收率和總平均回收率。結(jié)果丁香酚的總平均回收率為97.419 2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.426%。符合含量測(cè)定要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 丁香酚加樣回收率結(jié)果

2.3丁香酚累積釋藥量測(cè)定

表2 丁香酚累積透皮釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果(x±s,n =6)

圖2 丁香酚累積透皮釋藥曲線圖Fig.2 Curve of the eugenol cumulative transdermal release (=6)

2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

不同時(shí)間段單位面積累積透皮釋藥曲線結(jié)果顯示，丁姜和胃膏貼劑中丁香酚透皮釋藥呈現(xiàn)一種先快后慢趨勢(shì)，10 h以內(nèi)是快速透皮釋藥階段，在此時(shí)間段的累積釋藥總量占20 h內(nèi)累積釋藥總量的76.71%，10 h以后進(jìn)入緩慢階段，此時(shí)間段的累積釋藥總量?jī)H占20 h內(nèi)累積釋藥總量的23.29%。提示起效時(shí)間主要在10 h以內(nèi)。這為臨床合理用藥提供了參考依據(jù)。

3 討論

丁香酚是丁姜和胃膏貼劑主要生物活性成分之一，選擇測(cè)定丁香酚單位面積離體鼠皮累積釋藥量，可在一定程度上體現(xiàn)該膏貼劑透皮藥效情況。釋藥接收液的選擇，既要充分考慮透皮成分的溶解性能，使其在持續(xù)釋放出來后快速溶解，減少接受液對(duì)指標(biāo)成分透皮釋放的影響，還要考慮其他成分對(duì)指標(biāo)成分含量測(cè)定的干擾。選擇實(shí)驗(yàn)中，分別對(duì)生理鹽水、不同濃度乙醇生理鹽水接受液進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，30%乙醇生理鹽水雜峰少、丁香酚峰峰型好且與雜峰分離度高。因此，選擇30%乙醇生理鹽水作為最佳釋藥接受液體系。

外用藥藥物成分經(jīng)皮滲透量一般較低。在接受液處理方法實(shí)驗(yàn)中，采用一次性全部取出接受液，并對(duì)其中的指標(biāo)成分丁香酚采用三氯甲烷少量多次萃取，以增加相對(duì)濃度的處理方法。結(jié)果表明全部接受液提取3次，每次0.5 mL，能夠完全提取接受液中丁香酚成分，釋藥成分測(cè)定結(jié)果精確度高。

丁香酚含量測(cè)定研究中，參考有關(guān)資料[12-19]，實(shí)驗(yàn)比較了不同比例的甲醇-水、甲醇-醋酸水、甲醇-磷酸水和乙腈-磷酸水等流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)對(duì)丁香酚成分分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)洗脫時(shí)間適中，其中甲醇-水(65∶35，V/V)丁香酚色譜峰與其相鄰峰分離度最好，故選擇此系統(tǒng)為HPLC法測(cè)定丁香酚含量的流動(dòng)相。

以選定的色譜條件和實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)丁姜和胃膏貼劑透皮釋藥液中丁香酚含量測(cè)定進(jìn)行重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，樣品溶液丁香酚含量測(cè)定的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.932%，24 h內(nèi)樣品溶液的穩(wěn)定性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.843%，平均加樣回收率為97.419 2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.426%，表明該方法能滿足含量測(cè)定要求。

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Study on in vitro transdermal drug release of Dingjiang Hewei plaster

ZHANG Wei1，CAO Jia1，WANG Hui1，CAO Yun-fei2，WANG Wei1*

(1. Qingdao Hiser Medical Group，Qingdao 266033, China；2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355, China)

R284.1

A

1002-4026(2017)05-0032-05

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.05.006

2017-03-17

青島市2014年度醫(yī)藥科研指導(dǎo)計(jì)劃(2014-WJZD 058)

張偉(1962—)，男，主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幫庥弥苿﹦┬脱芯?、中藥制劑質(zhì)量控制研究。E-mail：hczjsys@126.com

*通信作者，王瑋(1972— )，男，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴幫庥盟巹┬脱芯?。E-mail: haicizw@126.com