n-3多不飽和脂肪酸對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的改善作用

喻日成，羅建華，劉 倩

(貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴陽(yáng) 550000)

論著·基礎(chǔ)研究

n-3多不飽和脂肪酸對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的改善作用

喻日成，羅建華，劉 倩

(貴州省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴陽(yáng) 550000)

目的探討n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)對(duì)高脂誘導(dǎo)的 Wister大鼠非酒精性脂肪性肝(NAFLD)的改善作用。方法Wister雄性大鼠30只，分為正常組、模型組、n-3 PUFA組。采用高脂喂養(yǎng)建立NAFLD模型，實(shí)驗(yàn)20周后，每組抽出7只大鼠檢測(cè)血清及肝臟總膽固醇(TG)及三酰甘油(TC)；其余3只大鼠肝臟蘇木精-伊紅(HE)染色；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(Real time-qPCR)及Western blot檢測(cè)肝臟組織單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) mRNA及蛋白水平。結(jié)果模型組大鼠血清及肝臟TG、TC水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，加入n-3 PUFA后血清及肝臟的TG、TC水平明顯下降(P<0.05)。HE染色能明顯觀察到模型組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性，而n-3 PUFA有明顯改善效果。模型組大鼠炎癥分子MCP-1、iNOS、TNF-α基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而n-3 PUFA組與模型組比較，MCP-1、iNOS、TNF-α炎癥分子的表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。結(jié)論高脂喂養(yǎng)能引起大鼠肝臟嚴(yán)重的脂肪變性及炎性反應(yīng)，而n-3 PUFA起明顯的改善作用。

脂肪肝，酒精性；脂肪酸類，不飽和；n-3多不飽和脂肪酸；非酒精性脂肪肝病；單核細(xì)胞趨化蛋白-1

亞太地區(qū)的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)患病率為12%～24%，已成為一種危害極大的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。NAFLD是由非酒精因素引起的肝內(nèi)嚴(yán)重的脂肪變性，與脂代謝異常、胰島素抵抗、肥胖及代謝綜合征關(guān)系密切[2]。n-3多不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acid，n-3 PUFA)能抑制脂質(zhì)合成、促進(jìn)脂質(zhì)分解，同時(shí)也有抗炎和增加胰島素敏感性的作用[3]。本研究對(duì)n-3 PUFA對(duì)大鼠NAFLD胰島素抵抗及肝臟炎癥的影響進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級(jí)Wister雄性大鼠30只，初始體質(zhì)量(160±10)g，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Applied Biosystems公司；LightCycler?TaqMan?Master購(gòu)自Roche公司；單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗購(gòu)自BD Biosciences公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的二抗購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物飼養(yǎng)及標(biāo)本留取 30只Wister雄性大鼠，分為3組：正常組，模型組，n-3 PUFA組，每組10只。正常組喂基礎(chǔ)飼料(蛋白質(zhì)22%，脂肪12%，碳水化合物66%)，模型組喂高脂飼料(蛋白質(zhì)9%，脂肪66%，碳水化合物25%)，8周后n-3 PUFA組加入1.0 g/d n-3 PUFA。喂養(yǎng)20周后，每周抽出3只大鼠，取肝臟同一部位經(jīng)固定后行蘇木精-伊紅(HE)染色，其余7只大鼠斷頭處死后分離血清，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，肝臟取出后用液氮速凍并保存于-80 ℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 Real-time PCR引物

1.2.2指標(biāo)測(cè)定 采用酶法試劑盒測(cè)定血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC),操作過(guò)程按說(shuō)明書進(jìn)行。稱取肝臟100 g，加入900 μL異丙醇作為介質(zhì)充分勻漿，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，檢測(cè)TG、TC。取3只大鼠同一部位肝臟經(jīng)4%多聚甲醛固定，行常規(guī)HE染色。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR(Real time-qPCR)檢測(cè)MCP-1、iNOS、TNF-α基因mRNA表達(dá)

1.2.3.1總RNA制備 取肝臟組織100～150 mg，勻漿，加入1 mL TRIzol，按Qiagen試劑盒說(shuō)明書介紹的方法提取總RNA，采用Nanodrop ND1000 測(cè)量RNA的濃度。

1.2.3.2cDNA合成 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，每個(gè)反應(yīng)體系含：1.0 μg RNA，2.0 μL 10×RT緩沖液，0.8 μL dNTP，2.0 μL隨機(jī)引物，1.0 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，總反應(yīng)體系20.0 μL，反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，4 ℃后取出樣品，-20 ℃保存。

1.2.3.3PCR擴(kuò)增 PCR總反應(yīng)體系為10.0 μL，含cDNA模板2.0 μL，TaqMan?Master 5.0 μL，ddH2O 2.5 μL，正、反向引物各0.5 μL(表1)。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min，72 ℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。每個(gè)qPCR重復(fù)3次，以PPIA為管家基因，目的基因的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)公式2-ΔΔCt計(jì)算。

1.2.4Western blot檢測(cè)MCP-1、iNOS、TNF-α蛋白的表達(dá) (1)大鼠肝臟總蛋白提?。喝〈笫蟾闻K組織100 mg，加入1 mL RIPA裂解液，充分勻漿后提取總蛋白，通過(guò)二喹啉甲酸(BCA)方法測(cè)量蛋白濃度。(2)將30 μg的蛋白樣品加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳點(diǎn)樣孔，100 V電壓電泳2 h。(3)電泳完的凝膠轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂牛奶封閉，MCP-1、TNF-α、iNOS及β-actin一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫下30 min，TBST洗3次。(4)化學(xué)發(fā)光法顯影、定影，將膠片進(jìn)行掃描拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的相對(duì)分子質(zhì)量和凈光密度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清及肝臟TC、TG水平 模型組大鼠血清及肝臟TG、TC水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，加入n-3 PUFA后血清及肝臟的TG、TC水平較模型組明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2各組大鼠HE染色結(jié)果 光鏡下對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列緊密，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，核大而圓，無(wú)脂滴；模型組大鼠肝臟內(nèi)有彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，脂肪浸潤(rùn)明顯，肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大小不一的脂滴；n-3 PUFA組肝細(xì)胞脂肪變性較模型組明顯改善，僅見(jiàn)輕度脂肪沉積，見(jiàn)圖1。

表2 n-3 PUFA降低大鼠肝臟及血清TC、TG

a：P<0.01，與模型組比較

A:對(duì)照組；B：模型組；C：n-3 PUFA組

圖1光鏡下大鼠肝臟組織病理改變(HE，×400)

A：MCP-1；B：iNOS；C:TNF-2；1:對(duì)照組；2：模型組；3：n-3 PUFA組

圖2大鼠肝臟MCP-1、iNOS、TNF-α基因表達(dá)

2.3n-3 PUFA對(duì)大鼠肝臟組織炎癥分子基因表達(dá)的影響 Real time-qPCR及Western blot結(jié)果顯示：模型組大鼠炎癥分子MCP-1、iNOS、TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，而n-3 PUFA組與模型組比較，MCP-1、iNOS、TNF-α炎癥分子的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3 討 論

多個(gè)臨床研究證實(shí)增加飲食中n-3 PUFA水平能降低三酰甘油水平、降低血壓、減少肝臟炎癥、改善胰島素抵抗[4-5]。非酒精性肝硬化患者行肝臟活檢發(fā)現(xiàn)n-3/n-6多不飽和脂肪酸水平降低[6]。有研究表明飲食中n-3PUFA能通過(guò)孕烷X受體(PXR)及法尼醇X受體(FXR)信號(hào)通路改善NAFLD纖維化及硬化[7]。本研究采用國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的方法，利用高脂喂養(yǎng)建立大鼠NAFLD病模型。本研究結(jié)果表明高脂喂養(yǎng)大鼠20周后，大鼠血清TG、TC明顯高于正常對(duì)照組，肝臟組織的TG、TC亦明顯高于對(duì)照組。肝臟組織的HE染色觀察到高脂喂養(yǎng)的大鼠存在嚴(yán)重的脂肪變性，而對(duì)照組大鼠的肝細(xì)胞形態(tài)正常，這些結(jié)果表明通過(guò)高脂喂養(yǎng)成功建立了大鼠的NAFLD模型。

NAFLD的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，有研究表明肝臟的炎癥及纖維化在NAFLD的發(fā)病環(huán)節(jié)中起重要作用，一些炎癥因子如TNF-α及活性氧(ROS)通過(guò)上調(diào)肝臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)及α-平滑肌機(jī)動(dòng)蛋白(SMA)參與NAFLD的發(fā)病過(guò)程[8-9]。本研究結(jié)果表明高脂喂養(yǎng)大鼠建立NAFLD模型后肝臟組織的炎癥因子MCP-1、iNOS、TNF-α表達(dá)明顯上調(diào)，結(jié)果與國(guó)外研究一致。TNF-α是肝臟炎癥的重要標(biāo)志物，在肝臟的損害及肝纖維化中起重要作用[10]。MCP-1促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)肝臟，國(guó)外研究表明MCP-1基因敲除的小鼠肝臟巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)減少，肝臟的炎性反應(yīng)減輕[11]。n-3 PUFA具有明顯的抗炎及改善胰島素抵抗作用，能減少脂肪組織及肝臟組織的炎癥分子如TNF-α的表達(dá)[12]。本研究結(jié)果表明NAFLD模型組大鼠加入n-3 PUFA喂養(yǎng)20周后，肝臟組織脂肪變性明顯改善，肝臟組織TC、TG水平明顯降低，炎癥分子MCP-1、iNOS、TNF-α表達(dá)明顯下調(diào)。有研究表明n-3 PUFA通過(guò)激活過(guò)氧化物酶增殖活化受體-α(PPAR-α)及下調(diào)類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的基因表達(dá)增加肝臟脂肪酸氧化。n-3 PUFA亦可通過(guò)核因子kappa B通路減少肝臟及脂肪組織的炎性反應(yīng)，明顯減少肝臟組織TNF-α的表達(dá)[13-14]。

n-3 PUFA具有明顯抗炎及改善脂代謝作用，能明顯減少NAFLD大鼠肝臟脂肪變性及肝臟組織TG、TC水平，減少肝臟組織的炎性反應(yīng)，為臨床工作中NAFLD防治提供一定的理論依據(jù)。

[1]Farrell GC,Chitturi S,Lau GK,et al.Guidelines for the assessment and management of non-alcoholic fatty liver disease in Asia-Pacific region:executive summary[J].J Gastroenterol Hepatol,2007,22(6):775-777.

[2]Sakurai M,Takamura T,Ota T,et al.Liver steatosis,but not fibrosis,is associated with insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease[J].J Gastroenterol Hepatol 2007,42(4):312-317.

[3]Delarue J,Li CH,Cohen R,et al.Interaction of fish oil and a glucocorticoid on metabolic responses to an oral glucose load in healthy human subjects[J].Br J Nutr,2006,95(2):267-272.

[4]Davidson MH.Mechanisms for the hypotriglyceridemic effect of marine omega-3 fatty acids[J].Am J Cardiol,2006,98(4A):27-33.

[5]Calder PC.Polyunsaturated fatty acids and inflammation[J].OCL,2004,11(1):38-45.

[6]Elizondo A,Araya J,Rodrigo R,et al.Polyunsaturated fatty acid pattern in liver and erythrocytephospholipids from obese patients[J].Obesity,2007,15(1):24-31.

[7]Saraswathi V，Perriotte-Olson C，Ganesan M，et al.A combination of dietary N-3 fatty acids and a cyclooxygenase-1 inhibitor attenuatesnonalcoholic fatty liver disease in mice[J].J Nutr Biochem,2017,42(4):149-159.

[8]Minicis S,Seki E,Paik YH,et al.Role and cellular source of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase in hepatic fibrosis[J].Hepatology,2010,52(4):1420-1430.

[9]Carpino G，Nobili V，Renzi A，et al.Macrophage activation in pediatric nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD) correlates with hepatic progenitor cell response via Wnt3a pathway[J].PLoS One,2016,11(6):e0157246.

[10]Li Z,Yang S,Lin H,et al.Probiotics and antibodies to TNF inhibit inflammatory activity and improve nonalcoholic fatty liver disease[J].Hepatology,2003,37(2):343-350.

[11]Baeck C,Wehr A,Karlmark KR,et al.Pharmacological inhibition of the chemokine CCL2(MCP-1) diminishes liver macrophage infiltration and steatohep-atitis in chronic hepatic injury[J].Gut,2012,61(3):416-426

[12]Xu H,Barnes GT,Yang Q,et al.Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance[J].J Clin Invest,2003,112(12):1821-1830.

[13]Schmitz G,Ecker J.The opposing effects of n-3 and n-6 fatty acids[J].Prog Lipid Res,2008,47(2):147-155.

[14]Yuan F，Wang H，Tian Y，et al.Fish oil alleviated high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease via regulating hepatic lipids metabolism and metaflammation:a transcriptomic study[J].Lipids Health Dis，2016，15(20)：219-233.

Improvementeffectofn-3polyunsaturatedfattyacidonratnonalcoholicfattyliverdisease

YuRicheng,LuoJianhua,LiuQian

(DepartmentofEndocrinology,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550000,China)

ObjectiveTo investigate the improvement effect of n-3 polyunsaturated fatty acid (n-3 PUFA) on rat nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD) induced by high fat diet.MethodsThirty Wister male rats were divided into the control group,model group and n-3 PUFA group.The high fat feeding was adopted to establish NAFLD model.After 20 weeks of experiment,7 cases were extracted from each group for detecting serum and liver total cholesterol (TC) and triacylglyceride(TG);other 3 cases were performed the liver HE staining,the levels of MCP-1,iNOS,TNF-α mRNA protein were detected by using the Real time quantitative PCR(qPCR) and Western blot.ResultsThe TC and TG levels in serum and livers of the model group were significantly higher than those in the control group(P<0.01),but which were evidently decreased after adding n-3 PUFA(P<0.05).The HE staining clearly observed the rat hepatic cells fatty degeneration in the model group,while polyunsaturated fatty acid had obvious improvement effect on it.The inflammatory molecule MCP-1,iNOS,TNF-α gene expression levels in the model group were significantly higher than those in the control group(P<0.05),while the expression levels of MCP-1,iNOS and TNF-α in the n-3PUFA group were significantly decreased compared with the model group.ConclusionHigh fat feeding can cause the severe fatty degeneration in rat liver,but polyunsaturated fatty acid can play obvious improvement effect.

fatty liver,alcoholic；fatty acids,unsaturated；n-3 Polyunsaturated fatty acid；nonalcoholic fatty liver disease；monocyte chemotactic protein-1

R589.2

A

1671-8348(2017)26-3620-03

2017-02-18

2017-06-06)

喻日成(1976-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事糖尿病慢性并發(fā)癥及肥胖方面研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.007