血紅素加氧酶-1在高氧肺損傷小鼠中的表達(dá)及作用*

羅喜鋼，王 毅，張鳳香

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)中心，遼寧錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧錦州 121001)

論著·基礎(chǔ)研究

血紅素加氧酶-1在高氧肺損傷小鼠中的表達(dá)及作用*

羅喜鋼1，王 毅1，張鳳香2△

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)中心，遼寧錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧錦州 121001)

目的探討血紅素加氧酶-1(HO-1)在高氧造成的肺損傷轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠中的肺部表達(dá)水平及其作用。方法把32只新生小鼠分成4組：野生型組(WT組)，特異性轉(zhuǎn)基因小鼠全身高水平表達(dá)HO-1組[HO-1-FL(H)組，細(xì)胞質(zhì)]、特異性轉(zhuǎn)基因小鼠全身低水平表達(dá)HO-1組[HO-1-FL(L)組，細(xì)胞質(zhì)]和切去C末端HO-1(Nuc-HO-1-TR組，細(xì)胞核)。把4組小鼠暴露在高氧環(huán)境中3 d，然后放到正?？諝猸h(huán)境中，通過免疫組織化學(xué)、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)技術(shù)來觀察小鼠3 d、7 d和14 d肺泡發(fā)育情況及HO-1在小鼠肺部表達(dá)情況。結(jié)果HO-1在HO-1-FL(H)組小鼠肺部高表達(dá)，高氧暴露3 d后4組小鼠肺部肺泡發(fā)育都受到了損害，在正?？諝猸h(huán)境中7、14 d時(shí)HO-1-FL(H)組小鼠的肺泡發(fā)育恢復(fù)得最好。結(jié)論小鼠肺部適度高水平的HO-1表達(dá)有助于高氧環(huán)境造成的小鼠肺損傷的恢復(fù)。

肺損傷；血紅素加氧酶-1；基因敲除小鼠

血紅素加氧酶-1(HO-1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的錨定蛋白[1]，在新生兒肺中含量豐富，但不響應(yīng)于高氧的誘導(dǎo)[2-3]。HO-1高水平的超表達(dá)與體外氧的細(xì)胞毒性相關(guān)聯(lián)[4-5]。同成人比較，暴露高氧中的新生小鼠HO-1局限于細(xì)胞核中[6-7]。本研究對(duì)HO-1表達(dá)水平與亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備及耗材 全自動(dòng)生化分析儀(日立7600-110)，液氮冰箱(海爾)，生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(KH-BL)，切片機(jī)(KH-Q380)，氣相色譜儀(北京恒通瑞利 GC6891N)，熒光顯微鏡(奧林巴斯)。

1.1.2主要試劑及藥品 鹽酸氯胺酮(西安漢豐藥業(yè))，甲苯噻嗪鹽酸鹽、磷酸鹽緩沖液(PBS，武漢普諾賽)，抗血凝素(HA)、抗小鼠肺表面活性物質(zhì)蛋白(SP-C)抗體、抗波形蛋白抗體、抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體、抗CD45，核質(zhì)提取試劑盒(NE-PER,Sigma)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)對(duì)象 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的SPF級(jí)新生小鼠。小鼠分成4組，每組8只，即野生型組(WT組)，特異性轉(zhuǎn)基因小鼠全身高水平表達(dá)HO-1組[HO-1-FL(H)組，細(xì)胞質(zhì)]，特異性轉(zhuǎn)基因小鼠全身低水平表達(dá)HO-1組[HO-1-FL(L)組，細(xì)胞質(zhì)]和轉(zhuǎn)基因小鼠切去C末端HO-1組(Nuc-HO-1-TR組，細(xì)胞核)。

1.2方法 (1)本研究把4組新生的小鼠幼崽分到含正?？諝馊萜骱秃?5%氧氣的容器內(nèi)，其中95%氧氣的容器能夠連續(xù)監(jiān)測、調(diào)節(jié)氧和二氧化碳的含量，在此容器內(nèi)小鼠被暴露于高氧環(huán)境中3 d，然后放到正常環(huán)境中恢復(fù)，一直持續(xù)到第2周結(jié)束。(2)肺組織收集：小鼠被腹腔注射鹽酸氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪鹽酸鹽(10 mg/kg)進(jìn)行麻醉，肺動(dòng)脈用PBS進(jìn)行灌注后，切下右肺放入液氮中冷凍保存并進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，左肺膨脹并用10%中性甲醛固定24 h[8]。肺組織被石蠟包埋制成5 mm厚切片，固定在載玻片上。(3)免疫組織化學(xué)：本研究使用生物素化抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組織化學(xué)染色作為細(xì)胞增殖的一般標(biāo)記，蛋白印記分析作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記。石蠟包埋的組織切片用免疫熒光或修飾后的生物素進(jìn)行間接染色,切片在4 ℃的溫度下和抗血凝素(HA)、PCNA、抗SP-C、抗波形蛋白、抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白及抗CD45抗體一起過夜孵育，然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。(4)免疫沉淀，使用NE-PER核質(zhì)提取試劑盒，抗HA結(jié)合到瓊脂糖珠上進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)[8]：組織裂解液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)柱，接著加入抗HA瓊脂糖珠上4 ℃孵育過夜。旋轉(zhuǎn)柱子移除組織裂解物，洗滌珠子。還有一部分和鈣連蛋白(calnexin)抗體進(jìn)行免疫沉淀，免疫沉淀得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗滌和免疫印記。(5)HO-1活性測定：以 CO 產(chǎn)生量用氣相色譜儀進(jìn)去測定，間接測定出 HO-1活性[9]。

2 結(jié) 果

2.1HA標(biāo)記肺組織的HO-1的表達(dá) 用HA標(biāo)記的HO-1在HO-1-FL(H)組小鼠肺部特異性的高表達(dá)，而在其他類型小鼠少量表達(dá)或無表達(dá)，見圖1、2。通過免疫熒光方法觀察HA染色的肺泡上皮細(xì)胞的表達(dá)與分布，在HO-1-FL(H)組中能看到大量的綠色熒光，而在HO-1-FL(L)組和Nuc-HO-1-TR組上有少量的綠色熒光，WT組上沒有綠色熒光，HO-1在HO-1-FL(H)組肺泡上皮細(xì)胞上大量分布，見圖2。

1：WT組；2：Nuc-HO-1TR-組；3：HO-1-FL(L)組;4：HO-1-FL(H)組

圖1 HO-1在小鼠肺部的表達(dá)

圖2 小鼠HA染色(綠色)圖和細(xì)胞核DAPI染色

2.2肺部HO-1酶活性的測定 總HO-1酶活性HO-1-FL(H)組高于WT組(P<0.05)，HO-1酶活性在HO-1-FL(L)和Nuc-HO-1-TR組與WT組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

2.3在高氧和恢復(fù)之后肺泡發(fā)育受到損害程度的比較 在正常空氣環(huán)境中，WT組小鼠發(fā)展成有序的通氣道，與之相反，WT組新生小鼠暴露高氧環(huán)境中3 d，肺泡的發(fā)育受到損害，導(dǎo)致肺泡簡化和肺組織輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC)均顯著降低。HO-1-FL(L)組在高氧環(huán)境中的RAC也較差，但同暴露在高氧中WT組相比，在正?？諝庵谢謴?fù)后，RAC得到了顯著的提高。與此相反，Nuc-HO-1-TR組和HO-1-FL(H)組在14 d時(shí)后，RAC均得到了顯著提高，見圖4。

圖3 14 d小鼠肺部HO-1酶活性計(jì)數(shù)

圖4 肺泡發(fā)育受損程度的比較

2.4高氧暴露后肺細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡情況 在正?？諝猸h(huán)境中，4組小鼠肺部PCNA陽性細(xì)胞數(shù)量相差不多。而在高氧環(huán)境中，除HO-1-FL(H)組外，其余3組細(xì)胞數(shù)大量減少，見圖5。

圖5 高氧暴露3 d 后PCNA免疫組織化學(xué)染色(綠色)

3 討 論

雖然，高氧環(huán)境在自然界中尚未證實(shí)存在，但是在臨床環(huán)境和適應(yīng)性反應(yīng)中存在這種挑戰(zhàn)[10-11]。 暴露在高氧環(huán)境中成年嚙類目動(dòng)物被觀察到的HO-1的誘發(fā)是一種保護(hù)作用，但是新生小鼠在同樣的條件下，肺部的HO-1沒有被誘導(dǎo)[12-13]。本研究先前已經(jīng)表明，低水平的HO-1表達(dá)是有益的[14-15]，但是在體外研究表明HO-1表達(dá)的增加也是有益的[8,12]，這就暗示HO-1的有益表達(dá)是有閾值的。本課題組的研究表明，HO-1的表達(dá)的程度和它細(xì)胞內(nèi)表達(dá)定位改變著它在小鼠體內(nèi)的保護(hù)能力。

本研究模擬臨床環(huán)境，新生轉(zhuǎn)基因小鼠暴露高氧中3 d后，然后放在正?？諝庵谢謴?fù)，這個(gè)模型用來評(píng)估新生小鼠急性肺損傷和修復(fù)。同經(jīng)過3 d高氧環(huán)境的WT組相比，HO-1-FL(H)組在第14 d從肺損傷中完全恢復(fù)。這表明HO-1在肺上皮細(xì)胞中的適度表達(dá)在高氧引起的肺損傷的恢復(fù)起著至關(guān)重要的作用。

綜上所述，本研究構(gòu)建出一種新生小鼠對(duì)高氧環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)模型，通過HO-1在轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠肺部表達(dá)的對(duì)比，研究得出適度的HO-1在肺部表達(dá)有益小鼠急性肺損傷的恢復(fù)，為進(jìn)一步的研究工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]An J,Li T,Dong Y,et al.Terminalia chebulanin attenuates psoriatic skin lesion via regulation of heme oxygenase-1[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(2):531-543.

[2]Noda M,Doi Y,Liang J,et al.Fractalkine attenuates excito-neurotoxicity via microglial clearance of damaged neurons and antioxidant enzyme heme oxygenase-1 expression[J].J Biol Chem,2016,291(27):14388.

[3]Go H,La P,Namba F,et al.MiR-196a regulates heme oxygenase-1 by silencing Bach1 in the neonatal mouse lung[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2016,311(2):L400-411.

[4]Iho S,Maeyama J,Suzuki F.CpG oligodeoxynucleotides as mucosal adjuvants[J].Hum Vaccin Immunother,2015,11(4):755-760.

[5]Ko SH,Rhoda J.Bacteroides fragilis enterotoxin upregulates heme oxygenase-1 in intestinal epithelial cells via a mitogen-activated protein kinase- and NF-κB-dependent pathway,leading to modulation of apoptosis[J].Infect Immun,2016,84(9):2541-2554.

[6]Prado E.Antimicrobial peptide elicitors:new hope for the post-antibiotic era[J].Innate immunity,2013,19(1):227-241.

[7]Cheng X,Gao D,Chen B,et al.Endotoxin-binding peptides derived from casein glycomacropeptide inhibit lipopolysaccharide-stimulated inflammatory responses via blockade of NF-κB activation in macrophages[J].Nutrients,2015,7(8):3119-3137.

[8]Negi G,Nakkina V,Kamble P,et al.Heme oxygenase-1,a novel target for the treatment of diabetic complications:focus on diabetic peripheral neuropathy[J].Pharmacol Res,2015(102):158-167.

[9]Russell Cruz C,Bollard CM.T-cell and natural killer cell therapies for hemato-logic malign-ancies after hematopoietic stem cell transplantation:enhancing the graft-versus-leukemia effect[J].Haematologica,2015,100(6):709-719.

[10]Lee HS,Lee JG,Yeom HJ,et al.The Introduction of human heme oxygenase-1 and soluble tumor necrosis factor-α receptor type Ⅰ with human IgG1 Fc in porcine islets prolongs islet xenograft survival in humanized mice[J].Am J Transplant,2016,16(1):44-57.

[11]Allin KH,Nordestgaard BG,Zacho J,et al.C-reacti-ve protein and the risk of cancer:a mendelian randomization study[J].J Natl Cancer Inst,2010,102(11):202-206.

[12]Cheng HT,Yen CJ,Chang CC,et al.Ferritin heavy chain mediates the protective effect of heme oxygenase-1 against oxidative stress[J].Biochim Biophys Acta,2015,1850(12):2506-2517.

[13]Wu MM,Chiou HY,Lee TC,et al.GT-repeat polymorphism in the heme oxygenase-1 gene promoter and the risk of carotid at herosclerosis related to arsenic exposure [J].J Bio Med Sci,2010,17(6):70.

[14]Matthay MA,Ware LB,Zimmerman GA.The acute respiratory distress syndrome[J].J Clin Invest,2012,122(8):2731-2740.

[15]Aird WC,Mosnier LO,Fairhurst RM.Plasmodium falciparum picks on EPCR[J].Blood,2014,123(2):163-167.

Expressionandroleofhemeoxygenase-1inmouselunginjuryinducedbyhyperoxia*

LuoXigang1,WangYi1,ZhangFengxiang2△

(1.LaboratoryCenter,ThirdAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China;2.DepartmentofThoracicSurgery,FirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China)

ObjectiveTo investigate the expression of heme oxygenase-1 in lungs of transgenic mice and normal mice and its effects.Methods32 newborn mice were divided into four groups:wild-type group (WT group),specific transgenic mice expressed hemoglobin oxygenase-1 high level group[HO-1-FL(H) group,cytoplasm],low level WT group[HO-1-FL(L) group,cytoplasm] and the C-terminal heme oxygenase-1 group(Nuc-HO-1-TR group,nucleus).Then four groups of mice were exposed to high oxygen for 3 days,after that placed in normal air environment.Immunohistochemistry and immunofluorescence were used to observe the alveolar development and hemoglobin addition at 3 days,7 days and 14 days oxygenase-1 expression in the lungs of mice.ResultsThe levels of heme oxygenase-1 were significantly higher in the lungs of HO-1-FL (H) group,and the alveolar development in the lungs of the four groups after 3 days of hyperoxia exposure was impaired.In the normal air environment,the recovery of alveolar development in HO-1-FL (H) group on the 7th and 14th day was the best.ConclusionThe moderately high levels of heme oxygenase-1 expression in the lungs contribute to the recovery of lung injury in mice caused by hyperoxic environments.

pulmonary injury;heme oxygenase-1;knockout mice

R-332

A

1671-8348(2017)26-3614-03

2017-02-21

2017-06-06)

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.005

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81541099)。

羅喜鋼(1980-)，碩士，主管檢驗(yàn)師，主要從事體液酶學(xué)方面研究?！?/p>

，Email：zhangfengxiang64@163.com。