茶多酚EGCG抑制大腸桿菌O157:H7生物膜研究

肖 潔，張秀琴，杜文芳，段合波，李 睿

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.神農(nóng)架林區(qū)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 神農(nóng)架 442400)

茶多酚EGCG抑制大腸桿菌O157:H7生物膜研究

肖 潔1，張秀琴2，杜文芳1，段合波1，李 睿1

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.神農(nóng)架林區(qū)檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 神農(nóng)架 442400)

研究低于抑菌濃度的茶多酚EGCG對(duì)大腸桿菌O157:H7 EDL933生物膜形成和泳動(dòng)性能的影響。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的EGCG加入到玻璃試管，接種大腸桿菌O157:H7 EDL933，30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d。結(jié)晶紫法測(cè)定生物膜量。結(jié)果表明亞抑菌濃度(0.125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL)的EGCG可以顯著抑制大腸桿菌O157:H7 EDL933的生物膜形成。0.3% LB軟瓊脂加入亞抑菌濃度(0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL)的EGCG，37 ℃培養(yǎng)大腸桿菌O157:H7 EDL933 24 h,結(jié)果證實(shí)大腸桿菌O157:H7 EDL933泳動(dòng)能力顯著減小。結(jié)果證實(shí)EGCG具有很強(qiáng)的抑制細(xì)菌生物膜的能力，有望用于食品工業(yè)控制細(xì)菌污染。

茶多酚EGCG; 大腸桿菌O157:H7;生物膜;泳動(dòng)性

Abstract：The effects of Epigallocatechin gallate (EGCG) on the biofilm formation and swimming motility ofEscherichiacoliO157:H7 were studied. The mediums supplemented with different concentrations of EGCG were added into glass tubes, thenEscherichiacoliO157:H7 EDL933 was innoculated and statically incubated at 30℃ for 5days. Biofilm biomass was measured by crystal violet assay. The results indicated that sub-MIC (0.125mg/mL,0.25mg/mL and 0.5mg/mL) of EGCG significantly inhibited the biofilm formation byEscherichiacoliO157:H7. Soft LB agar (0.3%) containing EGCG (0.125mg/mL,0.25mg/mL and 0.5mg/mL) was used in swimming inhibitory assay. The results showed that EGCG significantly suppressed swimming motility ofEscherichiacoliO157:H7 at 37℃. These results suggested the feasibility of using EGCG in food industry to controlEscherichiacoliO157:H7 growth and biofilm formation.

Key words：Epigallocatechin gallate;EscherichiacoliO157:H7; biofilm; swimming motility

1 引言

腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhageEscherichiacoli，EHEC)是一類重要的食源性致病菌，可嚴(yán)重威脅人類健康。EHEC具有多種血清型，大腸桿菌O157:H7是其中最典型的一種血清型，其發(fā)病率最高、致病性最強(qiáng)、流行性最廣[1]。

細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌為了適應(yīng)外界環(huán)境附著于其他表面上，分泌胞外多糖、脂蛋白等胞外聚合物，通過細(xì)胞彼此粘附并被自身產(chǎn)生的胞外聚合物包圍形成的大量膜樣物質(zhì)[2]。生物膜形成的三要素為：細(xì)菌、細(xì)菌附著的表面及胞外基質(zhì)[2]。細(xì)菌生物膜被認(rèn)為是細(xì)菌為適應(yīng)不利生存條件而產(chǎn)生的，生物膜中的細(xì)胞通常比浮游狀態(tài)的細(xì)胞具有更頑強(qiáng)的生命力，對(duì)不利的生存環(huán)境(例如干燥失水、極端溫度、抗生素、消毒劑等)的適應(yīng)能力增強(qiáng)[3]。生物膜促使細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性[3]?，F(xiàn)有研究表明，細(xì)菌生物膜形成除受到環(huán)境因素包括溫度、PH值、滲透壓、離子濃度等的影響外，也與細(xì)菌自身的運(yùn)動(dòng)性密切相關(guān)[4]。細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性包括群集運(yùn)動(dòng)(Swarm motility)和浮泳運(yùn)動(dòng)(Swim motility)兩種方式[4]。

茶多酚是茶葉提取物中多酚類物質(zhì)的總稱。研究表明茶多酚具有抗菌、抗病毒、抗過敏、抗炎、抗癌、抗氧化等多種活性作用[5]。茶多酚對(duì)單增李斯特菌、大腸桿菌O157:H7、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用[6]。在茶多酚中，發(fā)揮抑菌活性的主要有以下4種兒茶素：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E-epigallocatechin-3-gallate，EGCG)，表兒茶素(E-epicatechin，EC)，表兒茶素沒食子酸酯(E-epicatechin-3-gallate，ECG)和表沒食子兒茶素(E-epigallocatechin，EGC)[7]。EGCG在所有兒茶素中含量最高，約占其總含量的50-80%，抗菌活性最強(qiáng)[8]，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 EGCG的分子結(jié)構(gòu)

目前有很多化學(xué)類食品添加劑應(yīng)用于食品保鮮中，這些添加劑都有比較好的抑菌效果，但是化學(xué)類食品添加劑因副作用大備受爭(zhēng)議[9]。茶多酚等天然提取物因而受到消費(fèi)者歡迎。茶多酚在食品保鮮中的應(yīng)用已成為一大研究熱點(diǎn)[10]。但茶多酚的抑菌機(jī)理目前并未闡釋清楚。筆者以茶多酚EGCG單體為研究對(duì)象，考察其對(duì)大腸桿菌O157：H7生物膜的抑制作用，為茶多酚在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

大腸桿菌O157:H7 EDL933由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院贈(zèng)送。

2.1.2 主要試劑

EGCG(99.8%)購自南京廣潤(rùn)生物制品有限公司；LB、MH肉湯購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司； 結(jié)晶紫購自美國(guó)Amresco公司；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自武漢華順生物技術(shù)公司。

2.2 方法

2.2.1 EGCG對(duì)大腸桿菌O157:H7EDL933 最低抑菌濃度的測(cè)定

最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC) 測(cè)定參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2012版[11]進(jìn)行。即 接種大腸桿菌O157:H7 EDL933于MH平板上，劃線分離， 待長(zhǎng)出單菌落。挑取3—4個(gè)單菌落接種至含5 mL MH肉湯的試管中，37℃搖床培養(yǎng)4h至菌液OD600為0.4左右，此時(shí)細(xì)菌濁度約0.5麥?zhǔn)蠁挝弧?用MH肉湯將菌液稀釋100倍。將預(yù)先配制好的EGCG 母液用MH肉湯稀釋成設(shè)定的濃度，稀釋方法參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。向96孔板中加入對(duì)應(yīng)樣品，實(shí)驗(yàn)組為不同濃度的EGCG，每孔加50 μL，然后加入稀釋100倍的菌液50 μL；陽性對(duì)照為50 μL MH肉湯加50 μL稀釋菌液；陰性對(duì)照為100 μL MH肉湯(無菌液)和含相應(yīng)濃度EGCG的MH肉湯(無菌液)，每個(gè)樣品做4個(gè)平行孔。加入板中的菌液終濃度約為5×105CFU/mL。將96孔板置于生化培養(yǎng)箱中，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h。MIC終點(diǎn)判讀：用肉眼在96孔板中所見能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗菌藥物濃度為最小抑菌濃度。若肉眼無法準(zhǔn)確判斷，可將96孔板置于酶標(biāo)儀下測(cè)定OD600幫助判定MIC。

2.2.2 EGCG對(duì)大腸桿菌O157:H7 EDL933生物膜形成的影響

接種大腸桿菌O157:H7 EDL933于LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min 37 ℃搖床過夜培養(yǎng)，用LB液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度，使細(xì)菌OD600接近于1。將預(yù)先配制好的EGCG 母液用1/2 LB肉湯(2倍稀釋的LB)稀釋成設(shè)定的濃度，即0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL。將菌液分別用含不同濃度EGCG的1/2 LB肉湯培養(yǎng)基稀釋100倍。設(shè)定陽性和陰性對(duì)照。菌液直接用1/2 L B肉湯稀釋，不加EGCG設(shè)定為陽性對(duì)照 ； 陰性對(duì)照為無菌液的1/2 LB肉湯。將各組菌液加入到滅菌小試管中，每管加2mL菌液。將試管置于生化培養(yǎng)箱中，30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)完成后，將試管內(nèi)菌液小心吸出，沿管壁緩慢加入3 mL無菌PBS輕輕潤(rùn)洗試管1次，于37 ℃下風(fēng)干。每管加入3 mL 0.5%結(jié)晶紫染液，于37 ℃下染色30 min。棄染色液，3 mL無菌PBS(pH7.4)洗滌3次，直到陰性對(duì)照管無過量染色。 37 ℃下風(fēng)干， 取3 mL 95%乙醇過夜脫色，酶標(biāo)儀測(cè)定OD595吸光度值。每一實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組設(shè)置至少三個(gè)平行對(duì)照管，取平均值，樣品最終OD值=樣品平均OD值-陰性對(duì)照OD平均值。

2.2.3 EGCG對(duì)大腸桿菌O157:H7 EDL933泳動(dòng)能力的影響

接種大腸桿菌O157:H7 EDL933于LB肉湯中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，OD600為0.4左右。制備0.3% LB軟瓊脂，高壓蒸汽滅菌后保溫于50—60 ℃待用，防止凝固。0.3% LB軟瓊脂中加入不同濃度的EGCG，混勻，使軟瓊脂中EGCG終濃度分別為0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL。 將含不同濃度EGCG的LB軟瓊脂加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入3mL，將6孔板置于超凈工作臺(tái)中4 h，待LB軟瓊脂凝固后，分別取1 μL菌液點(diǎn)在每個(gè)LB軟瓊脂孔中央。將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板正置于生化培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)并拍照，同時(shí)測(cè)定細(xì)菌泳動(dòng)直徑大小。

2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文中所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“m±SD”來表示，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，并認(rèn)為p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且存在顯著差異(用*表示)，p<0.01為差異極顯著(**表示)。

3 結(jié)果與分析

3.1 EGCG對(duì)大腸桿菌0157:H7 EDL933的MIC測(cè)定

根據(jù)CLSI報(bào)道的方法[11]進(jìn)行一定改良，測(cè)定EGCG和檸檬酸對(duì)大腸桿菌O157:H7 EDL933的MIC。由于不同濃度的EGCG自身帶有一定顏色，顏色變化會(huì)對(duì)吸光度值帶來一定干擾，故采用自身對(duì)照法檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌O157:H7 EDL933的MIC。隨著EGCG濃度增大，EGCG本身的吸光度值增大。加入菌液培養(yǎng)20 h后，排除EGCG本身吸光值的干擾(表1)，可看到隨著EGCG濃度增大，測(cè)得的吸光度差值減小。當(dāng)EGCG濃度達(dá)到1.024 mg/mL時(shí)，吸光度差值迅速減少，說明菌體生長(zhǎng)被抑制(表1)，所以EGCG對(duì)大腸桿菌O157:H7 EDL933的MIC確定為1.024 mg/mL。

表1 EGCG對(duì)大腸桿菌O157:H7 EDL933 MIC測(cè)定的OD600值

EGCG終濃度/μg/mLEGCGOD600抑制后菌液OD600OD600差值0(陽性)0．0380．1920．15440．0560．210．15480．0570．2150．158160．0800．2390．159320．0730．2140．141640．0840．2170．1331280．0970．2260．1292560．1190．2610．1425120．2050．3870．18210240．4890．5010．012

3.2 生物膜形成實(shí)驗(yàn)

將大腸桿菌O157:H7 EDL933分別接種于含不同濃度 EGCG的1/2 LB 液體培養(yǎng)基中，30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d，結(jié)晶紫染色觀察。大腸桿菌O157:H7 EDL933的生物膜在培養(yǎng)基與空氣氣液交界面處形成，結(jié)晶紫與生物膜結(jié)合后，附著于玻璃試管內(nèi)壁，形成藍(lán)紫色的生物膜環(huán)。脫色后測(cè)定OD595。由圖2可知， 陽性對(duì)照組形成生物膜量最多，OD595最大 ； 加入EGCG后，生物膜量減少，EGCG濃度越高，測(cè)得的OD595越小。

圖2 EGCG對(duì)大腸桿菌O157:H7 EDL933生物膜形成的影響

3.3 細(xì)菌泳動(dòng)能力檢測(cè)結(jié)果

培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)，各組細(xì)菌在軟瓊脂表面生長(zhǎng)良好，形成圓形或近似圓形的大小不一的菌落。各組菌落直徑比較結(jié)果見圖3，含EGCG的實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌菌落直徑均極顯著小于PBS對(duì)照組(p<0.01)。大腸桿菌O157:H7 EDL933在含EGCG的軟瓊脂上的泳動(dòng)能力弱于PBS對(duì)照組，表明低于MIC的EGCG對(duì)該菌泳動(dòng)能力有抑制作用。

圖3 細(xì)菌泳動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

EGCG屬于天然提取物，具有諸多保健功效，可以應(yīng)用于食品保鮮中。大腸桿菌O157:H7是一種對(duì)人類健康危害極大的食源性致病菌。本文結(jié)果表明，低于MIC濃度的EGCG可以顯著抑制大腸桿菌O157:H7 EDL933生物膜的形成，抑制作用隨著EGCG濃度增大而增強(qiáng)。低于MIC濃度的EGCG可以顯著抑制大腸桿菌O157:H7 EDL933的泳動(dòng)能力，EGCG的抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)。

目前亞抑菌濃度的EGCG抑制細(xì)菌生物膜的相關(guān)報(bào)道較少。 Castillo等人 發(fā)現(xiàn)EGCG在亞抑菌濃度下可以顯著降低空腸彎曲桿菌的運(yùn)動(dòng)性，減少其生物膜的形成[12]。Blanco等人也報(bào)道了亞抑菌濃度的EGCG可抑制金黃色葡萄球菌的生物膜形成[13]。我們推斷，在亞抑菌濃度下，EGCG不能殺死細(xì)菌，因此EGCG抑制細(xì)菌生物膜形成主要是通過干擾細(xì)菌代謝、降低細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性，減少細(xì)菌粘附到固體載體表面，從而減少生物膜形成。

本文證實(shí)亞抑菌濃度的EGCG 可顯著抑制大腸桿菌O157:H7 EDL933生物膜的形成，因此EGCG可用于食品工業(yè)中控制致病菌生長(zhǎng)和生物膜的產(chǎn)生。本文結(jié)果為茶多酚開發(fā)做為天然食品保鮮劑提供了理論依據(jù)。

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Inhibition effects of Epigallocatechin gallate on the biofilm formation ofEscherichiacoliO157:H7

XIAOJie1,ZHANGXiu-qin2,DUWen-fang1,DUANHe-bo1,LIRui1

(1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China; 2.Center for Detection and Inspection,Shennongjia Forestry District,Shennongjia 442400,China)

2017-08-01.

肖潔(1991) ，女，碩士研究生，E-mail：15827061924@163.com.

李睿(1972)，女，教授，博士，E-mail：liruiwuhan@163.com.

湖北省教育廳重點(diǎn)科研計(jì)劃項(xiàng)目(D20151702).

2095-7386(2017)03-0033-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.03.006

R 155.5

A