豫中地區(qū)主栽烤煙品種煙葉成熟期氮代謝特征研究

王 群，劉化冰，陳 飛，何 澎，韓曉哲，楊丙釗

(1.內蒙古自治區(qū)煙草公司煙葉處，內蒙古 呼和浩特 010020；2.浙江中煙工業(yè)有限責任公司，浙江 杭州 310000；3.貴州煙葉復烤有限責任公司畢節(jié)復烤廠，貴州 畢節(jié) 551700；4.深圳煙草工業(yè)有限責任公司，深圳 518109；5.深圳波頓香料有限公司，深圳 518055；6.河南中煙工業(yè)有限責任公司，河南 鄭州 450099)

豫中地區(qū)主栽烤煙品種煙葉成熟期氮代謝特征研究

王 群1，劉化冰2，陳 飛3，何 澎4，韓曉哲5，楊丙釗6*

(1.內蒙古自治區(qū)煙草公司煙葉處，內蒙古 呼和浩特 010020；2.浙江中煙工業(yè)有限責任公司，浙江 杭州 310000；3.貴州煙葉復烤有限責任公司畢節(jié)復烤廠，貴州 畢節(jié) 551700；4.深圳煙草工業(yè)有限責任公司，深圳 518109；5.深圳波頓香料有限公司，深圳 518055；6.河南中煙工業(yè)有限責任公司，河南 鄭州 450099)

采用隨機區(qū)組試驗，深入研究了豫中地區(qū)主栽烤煙品種中煙100和NC89成熟期的氮代謝特性。結果表明：成熟期，2個品種葉片GS1酶活性均呈上升趨勢，GS2酶活性均呈下降趨勢。與NC89相比，中煙100的2種GS同工酶活性均較低。同時，中煙100具有較低的葉片NH4+濃度、總氮含量和可溶性蛋白含量，且具有較大的氨氣揮發(fā)潛力。而NC89在生育后期具有較高的氮素再利用能力，這可能是中煙100具有較強耐氮肥能力，而NC89易貪青晚熟的原因之一。

烤煙；谷氨酰胺合成酶同工酶；氮素代謝；相關性分析

Abstract： The randomized block experiment was carried out to deeply research the characteristics of nitrogen metabolism in mature leaves of mainly-planted flue-cured tobacco varieties (Zhongyan 100 and NC89) in the central area of Henan province. The results showed that: at maturity stage, the activity of GS1 in leaves of these two varieties all revealed an upward trend, while the activity of GS2 was decreasing. Zhongyan 100 had lower GS1 activity and GS2 activity, lower NH4+concentration, total nitrogen content and soluble protein content in leaves, and greater ammonia volatilization potential than NC89; but NC89 had a higher nitrogen reuse capacity at later growth stage than Zhongyan 100. The above results might be the reasons for the stronger nitrogen-tolerance of Zhongyan 100 and the late maturing of NC89.

Keywords： Flue-cured tobacco; Glutamine synthase isozyme; Nitrogen metabolism; Correlation analysis

氮素是烤煙生長發(fā)育和品質形成的重要因素，其用量涉及到碳氮代謝水平的高低和轉化時間的早晚，并最終影響烤煙糖、總氮和煙堿等的積累[1]。煙葉成熟期是品質形成的關鍵時期，合理的氮素供應是形成優(yōu)質煙葉的前提[2]。目前，我國豫中煙區(qū)氮肥用量普遍偏高，加之土壤中的氮素殘留量高、礦化量大，導致成熟期煙葉氮素營養(yǎng)過多，破壞了碳氮代謝的協(xié)調性，最終造成煙葉品質低劣[3-4]。氮代謝特性在不同烤煙品種間存在差異[5]，耐氮肥性強的品種在氮素殘留量高的條件下不容易貪青晚熟，進入成熟期依然能夠正常落黃，從而保證煙葉的良好品質。20世紀90年代以來，學者主要圍繞不同烤煙品種對氮素吸收的差異來探究其耐氮肥機理[6-7]，結果表明：耐肥能力強的品種與不耐肥品種相比較而言，葉綠素含量、根系活力和硝酸還原酶活性均明顯偏低。近些年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，植物生育后期地上部的氨氣揮發(fā)是氮素損失的主要途徑[8-10]。劉化冰[11]、段旺軍[12]等對不同耐肥性烤煙品種生育后期質外體生理指標和有關代謝酶活性進行了分析，發(fā)現(xiàn)耐氮肥品種葉片質外體銨離子濃度高于不耐氮肥品種，具有較大的氨揮發(fā)潛力，且差異達到極顯著水平。這些研究大多是圍繞烤煙葉片生育后期地上部氨氣揮發(fā)、氮素轉移來探討其耐氮肥機理。

Kichey等[13]通過主成分分析法，研究了氮代謝生理指標的第一主成分為GS同工酶活性以及總氮、蛋白質、氨基酸和葉綠素含量，且發(fā)現(xiàn)蛋白質、氨基酸和總氮含量與葉片GS酶活性呈顯著正相關關系。基于亞細胞定位的不同，高等植物的GS同工酶可以分為2類：一類為定位于細胞液中的由多個基因編碼的GS1，主要參與種子萌發(fā)時儲存氮源的轉運及葉片衰老時氮源的轉移及再利用；另一類定位于質體中的GS2，由一個核基因編碼，主要參與光呼吸、硝酸還原產生的氨的同化過程[14]。目前，對GS同工酶的研究逐漸成為探索植物氮代謝機理和改良氮代謝效率的熱點，而現(xiàn)階段在煙草中關于GS同工酶的活性動態(tài)變化及其與氮代謝相關生理指標的相關性研究尚未見報道。豫中煙區(qū)是我國典型的濃香型特色烤煙產區(qū)，對豫中煙區(qū)主栽品種進行氮代謝特征研究，有利于完善烤煙氮代謝機理的研究，進而深入挖掘濃香型特色產生的機制。

1 材料與方法

1.1試驗材料

參試烤煙品種為豫中煙區(qū)具有較大種植面積的中煙100(ZY100)和NC89，其中中煙100具有較強的耐肥能力，而NC89的耐肥性較差。施用肥料為硝酸銨、磷酸二氫鈉和硫酸鉀，由許昌市煙草公司提供。

1.2試驗設計及取樣

試驗于2016年在許昌市襄城縣進行，試驗地前茬作物為紅薯，土壤質地為黃棕壤土，土壤肥力均勻，耕層含有機質9.71 g/kg、全氮0.94 g/kg、速效氮69.25 mg/kg、速效磷26.83 mg/kg、速效鉀95.67 mg/kg，pH值7.82。于5月10日進行移栽，采用隨機區(qū)組設計，每個品種3次重復，共6個小區(qū)。每一小區(qū)植煙50株，株行距為110 cm×55 cm，所施肥料N∶P2O5∶K2O為1∶2∶3，采用穴施方式，按照優(yōu)質煙葉生產方式進行管理，7月9日進行打頂。在葉齡50、60、70 d(以幼葉長1 cm，寬0.5 cm時作為葉齡第1天)取第12片葉(自下向上數(shù))測定煙葉GS同工酶蛋白亞基含量，同時測定GS、GDH、NR酶的活性變化，以及葉片銨離子濃度、總氮、可溶性蛋白和質外體NH4+濃度、質外體pH值和氨氣補償點。

1.3測定內容與方法

1.3.1 GS同工酶蛋白亞基的測定 參照段旺軍等[12]的試驗方法。首先，對采集的葉片樣品進行粗酶液的制備，隨后將所提取的粗酶液進行SDS-PAGE電泳分離，所配置的凝膠規(guī)格為：濃縮膠5%，分離膠15%。凝膠的制備和電泳方法參考《分子克隆指南》。電泳結束后開始進行Western Blot,包含膜處理、轉膜、封閉、一抗孵育和二抗孵育。所用抗體由河南農業(yè)大學煙草學院育種實驗室饋贈。最后，將Western ECL Substrate的2種組分按照1∶1的比例混合，然后該混合液與膜常溫孵育5 min，用Bio-Rad化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行拍照，并進行灰度分析。

1.3.2 氮代謝酶活性測定 谷氨酰胺合成酶(GS)活性的測定參照O’ Neal D等[15]的方法。谷氨酸脫氫酶(GDH)活性的測定參照Turano F J等[16]的方法。硝酸還原酶(NR)活性測定參照鄒琦[17]的方法。

1.3.3 其他生理指標測定方法 質外體NH4+濃度和質外體pH值測定參考文獻[12]的方法。本試驗測定的溶液蘋果酸脫氫酶活力與葉片蘋果酸脫氫酶活力比值為2.33%(小于3%)，符合試驗標準[9]。氨氣補償點的計算參考文獻[12]的方法。葉片NH4+濃度、可溶性蛋白和總氮含量分別采用改良的茚滿三酮法、凱氏定氮法和考馬斯亮藍G-250法測定[17]。

1.4數(shù)據處理

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據單因素方差分析(ANOVA)，使用新復極差法在0.01顯著性水平進行差異顯著性分析，圖表用Excel 2016和SigmaPlot 1 2.5軟件繪制。

2 結果與分析

2.1不同烤煙品種葉片GS同工酶蛋白亞基含量差異

2.1.1 不同烤煙品種葉片GS1蛋白亞基含量差異 由于谷氨酰胺合成酶為同源八聚體酶，即GS同工酶均由8個亞基組成[14]，因此GS同工酶蛋白亞基含量可以用來表征GS同工酶活性。由表1可知，不同耐肥性烤煙品種葉片GS1蛋白亞基含量在成熟期隨著時間的推移均呈現(xiàn)增長趨勢，且增長幅度較大。中煙100的GS1蛋白亞基含量均小于NC89，且差異達到極顯著水平。說明成熟期中煙100具有較低的GS1酶活性，氮素再運轉和再利用的能力較弱，而NC89氮素向其他葉片轉移的能力較強。

表1 不同烤煙品種葉片GS1蛋白亞基含量

注:小、大寫字母分別表示在0.05、0.01水平上的差異顯著顯著性，字母相同則差異不顯著，不同則顯著。下同。

2.1.2 不同烤煙品種葉片GS2蛋白亞基含量差異 由表2可知，不同品種葉片GS2蛋白亞基含量在生育后期呈現(xiàn)降低趨勢。NC89的GS2蛋白亞基含量均大于中煙100，分別是中煙的1.35、1.45和1.37倍，差異達到極顯著水平。說明成熟衰老期中煙100具有較低的GS2酶活性，氮素同化能力較弱，而NC89則恰好相反。

表2 不同烤煙品種葉片GS2蛋白亞基含量

2.2不同烤煙品種葉片氮代謝酶活性的差異

GS/GOGAT循環(huán)是高等植物體內氮素的主要同化途徑，而GS酶是GS/GOGAT循環(huán)的關鍵酶，是無機氮轉化為有機氮的樞紐。GS酶活性的高低可以反映煙草植株氮素同化能力的強弱[18]。由表3可知，隨葉齡的增長，2個品種的GS酶活性均呈降低趨勢，中煙100的降幅較小，為34.18%；而NC89的降幅較大，達53.67%。當葉齡為50、70 d時，NC89的GS酶活性分別為中煙100的1.98倍、1.39倍。GS酶活性變化趨勢和GS2蛋白亞基含量變化趨勢較為一致，說明生育后期GS酶活性的下降主要是GS2同工酶活性的降低。相對于中煙100而言NC89仍然具有較高的氮素同化能力。

GDH在植物體內氮素代謝方面的生理功能仍然存在爭議，但是越來越多的證據表明：成熟衰老期葉片組織銨離子濃度的增長對其產生了誘導作用，其功能由合成氨逐漸轉變?yōu)槊摪盵19]。由表3可知，2個品種GDH活性均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。結合前人的研究結果，可能因為在葉齡60 d之前，葉片大分子物質降解產生的NH4+誘導了GDH活性的增加，隨后葉片NH4+進入其他代謝途徑致使其濃度降低，GDH活性也隨之減弱。各生育期中煙100的GDH活性均大于NC89，可能由于中煙100相對于NC89而言，進入衰老之后物質降解較早且降解量較大。

NR是一種受NO3-誘導的酶。2個品種的NR活性變化動態(tài)和GS酶較為接近，均表現(xiàn)出隨葉齡增長逐漸降低的趨勢。NC89的NR活性下降幅度較大，達70.43%，而中煙100下降幅度較小，為60.76%。各生育期中煙100的NR活性均極顯著低于NC89。

表3 不同烤煙品種葉片氮代謝酶活性

2.3不同烤煙品種葉片NH4+濃度、總氮和可溶性蛋白含量差異

煙葉內的NH4+是一個核心中間體，主要來源于光呼吸、硝酸還原、蛋白質代謝和酰胺的降解等過程，在成熟期主要來源于氮素營養(yǎng)物質的降解[20]。由表4可知，葉齡50 d時中煙100葉片NH4+濃度高于NC89，隨后降幅較大，葉齡60 d時降幅為46.15%，70 d時降幅為43.13%。而NC89葉片NH4+濃度降幅較小。2個品種在上述3個葉齡時期差異均達到極顯著水平。

煙葉總氮含量是對其含氮化合物多少的一種反映，可以體現(xiàn)出葉片總體的氮素水平。由表4可知，隨著葉齡增加中煙100總氮含量下降幅度較大，達61.24%，而NC89下降幅度較小，僅為24.70%，葉齡70 d時總氮含量仍然達到了1.89%左右。2個品種在各葉齡時期差異均達到極顯著水平，說明不耐肥品種生育后期具有較高的總氮含量。可溶性蛋白的主要成分是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)。其變化趨勢與總氮相似，但是下降幅度較緩。NC89在各生育期可溶性蛋白含量均高于中煙100，且差異達到極顯著水平。

2.4不同烤煙品種葉片質外體NH4+濃度、質外體pH值和氨氣補償點差異

質外體被認為是NH4+的動力池，質外體的NH4+是葉片氨氣揮發(fā)的重要來源，而葉片內的NH4+也源源不斷地向質外體輸送[21]。由表5可知，2個參試品種葉片質外體NH4+濃度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，葉齡60 d時中煙100質外體NH4+濃度最大值達1.49 mmol/L,而NC89僅為0.98 mmol/L。各葉齡時期中煙100質外體NH4+濃度均高于NC89，差異達到極顯著水平。

葉片氨氣揮發(fā)速率與質外體pH值呈正相關，pH值越高越有利于氨氣揮發(fā)[10]。由表5可知，2個參試品種葉片質外體pH值在成熟期均呈現(xiàn)下降趨勢，與NC89相比中煙100下降幅度較大，不同葉齡時期中煙100質外體pH值均高于NC89，且差異達到極顯著水平。

表4 不同烤煙品種葉片NH4+濃度、總氮和可溶性蛋白含量

葉片質外體中的一定濃度的NH4+維持著質外體空氣間隙一定濃度的NH3,這一濃度稱為氨氣補償點，由質外體NH4+濃度和質外體pH值計算而來。其變化趨勢與質外體pH值一致，均隨葉齡的增長而下降[12]。在葉齡50 d時，中煙100葉片氨氣補償點達42.13 nmol/mol,是NC89的3.98倍，直到葉齡70 d時中煙100仍然為NC89的2.01倍，各葉齡時期差異均達到極顯著水平。說明中煙100與NC89相比有著更大的氨氣揮發(fā)潛力，體內氮素營養(yǎng)物質降解產生的NH4+更多以氨氣的形式揮發(fā)出去。

表5 不同烤煙品種葉片質外體NH4+濃度、pH值和氨氣補償點

2.5不同烤煙品種GS同工酶蛋白亞基含量與氮代謝生理指標間的相關性分析

相關性分析表明，中煙100的GS1蛋白亞基含量與NR活性呈極顯著負相關，與葉片NH4+濃度、葉片總氮含量呈極顯著正相關關系，與葉片可溶性蛋白含量呈顯著正相關關系，而與質外體NH4+濃度呈顯著負相關關系。GS2蛋白亞基含量與谷氨酸脫氫酶活性、葉片NH4+濃度、葉片總氮含量和質外體pH值呈顯著負相關關系，與NR活性呈顯著正相關關系。與可溶性蛋白含量、質外體NH4+濃度和氨氣補償點呈極顯著負相關關系。

NC89各項指標的相關性分析與中煙100較為相似，所不同的是NC89的GS1蛋白亞基含量與NR活性和葉片總氮含量呈顯著相關性，GS2蛋白亞基含量與可溶性蛋白和質外體NH4+濃度呈顯著相關性。上述相關性分析說明葉片NH4+濃度、總氮和可溶性蛋白含量與GS1同工酶有顯著或極顯著的正相關關系，而質外體生理指標即氨氣揮發(fā)潛力與GS2同工酶有顯著或極顯著的負相關關系。

表6 GS同工酶蛋白亞基含量與氮代謝生理指標間的相關性分析

注：*、**分別表示相關性達到0.05、0.01的顯著水平。

3 討論

烤煙是一種以收獲葉片為主的特殊經濟作物，生產中進行現(xiàn)蕾打頂從而打破了原有的庫源關系，生長重心調整到保留下的葉片的生長發(fā)育上來[22]。植物在生育后期主要通過2條途徑降低葉片總氮含量，一是通過葉片質外體以氨氣揮發(fā)的形式轉移到外界環(huán)境中；二是轉移到生殖器官或者其他葉片中實現(xiàn)再利用，不同基因型之間存在差異。

GS同工酶GS1主要定位于細胞液中，其在葉片衰老時期的功能主要是降解氮素的轉移再利用[23-24]。在糧食作物和擬南芥上的研究表明，GS1對籽粒產量有重要貢獻[25]。Martin等對玉米的Gln1-3和Gln1-4突變體類型進行了研究，發(fā)現(xiàn)Gln1-3突變體的穗粒數(shù)減少，Gln1-4突變體的粒重變小[26]。付捷等研究也發(fā)現(xiàn)，較高的氮素重新利用能力是氮高效利用小麥品種重要的生理基礎之一[27]。在本研究中，2個品種葉片GS1蛋白亞基含量在成熟期持續(xù)增加，說明GS1酶活性持續(xù)升高。中煙100相對于NC89而言具有較低的GS1酶活性。成熟衰老時期GS酶活性的降低主要是由于GS2同工酶活性的下降[24]。本研究中，2個品種的GS2蛋白亞基含量持續(xù)減少，說明GS2酶活性持續(xù)降低。中煙100的GS2酶活性在各葉齡時期均低于NC89，最終表現(xiàn)為中煙100各時期GS酶活性均較弱。為了防止NH4+過量產生毒害作用，NH4+主要向質外體轉移，同時中煙100具有相對較高的質外體pH值,有利于NH4+形成氨氣揮發(fā)出去，因此中煙100具有較大的氨氣揮發(fā)能力。

相關性分析表明，GS1酶活性與葉片NH4+濃度、總氮、可溶性蛋白呈正相關關系，中煙100生育后期的GS1酶活性較低，因此具有較低的葉片氮素含量，煙葉不易貪青晚熟。由于質外體pH值和質外體NH4+濃度沒有相關性，在GS同化轉移氮素能力較弱的情況下通過質外體調控形成的氨氣揮發(fā)途徑，可能也是消除葉片氨害積累的一種生理機制。同時由相關性分析可知，GS2酶活性與質外體NH4+濃度、質外體pH值和氨氣補償點呈負相關。中煙100的GS2酶活性較低，因此具有較高的氨氣揮發(fā)潛力。這可能是中煙100具有較強耐氮肥能力的重要原因之一。

而NC89在生育后期具有較高的GS1和GS2酶活性。由于煙草打頂導致的源庫關系轉變，衰老葉片降解的氮素營養(yǎng)物質向其他葉片特別是葉齡較小的葉片轉移，同時由于GS2酶活性高，對轉移來的氮素的同化能力也較強。衰老降解的氮素被重新利用，這也是NC89的葉片常常具有較高的總氮和可溶性蛋白含量的原因。由于NH4+多數(shù)被同化再利用，導致其向質外體轉移較少，同時質外體pH值也相對較低，NH4+不易轉變成氨氣揮發(fā)到環(huán)境中去。這可能是NC89在高氮條件下易貪青晚熟的重要原因之一。

4 結論

研究了豫中煙區(qū)主栽品種成熟期的氮代謝酶活性以及葉片和質外體生理指標的差異。研究表明，耐氮肥性煙草品種中煙100氮素再利用能力弱，氮素營養(yǎng)物質降解速度快，NH4+向質外體轉移能力強，氨氣揮發(fā)量大。而不耐氮肥品種NC89與其恰好相反。葉片2種GS同工酶和質外體生理機制的差異綜合決定了不同烤煙品種氮素代謝能力和衰老特性。葉片GS1和GS2的蛋白亞基含量可能用來表征煙葉成熟期的氮素代謝狀況，并可以為耐氮肥品種的選育提供理論依據。

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(責任編輯：曾小軍)

StudyonCharacteristicsofNitrogenMetabolisminMatureLeavesofMainFlue-curedTobaccoVarietiesinCentralHenan

WANG Qun1, LIU Hua-bing2, CHEN Fei3, HE Peng4, HAN Xiao-zhe5, YANG Bing-zhao6*

(1. Department of Tobacco, Tobacco Company of Inner Mongolia Autonomous Region, Hohhot 010020, China; 2. China Tobacco Zhejiang Industrial Limited Company, Hangzhou 310000, China; 3. Bijie Redrying Factory, Guizhou Tobacco Redrying Limited Company, Bijie 551700, China; 4. Shenzhen Tobacco Industrial Limited Company of Guangdong Province, Shenzhen 518109, China; 5. Shenzhen Bolton Spice Limited Company of Guangdong Province, Shenzhen 518055, China; 6. China Tobacco Henan Industrial Limited Company, Zhengzhou 450099, China)

S572

A

1001-8581(2017)10-0067-06

2017-07-24

河南濃香型優(yōu)質烤煙品種篩選與工業(yè)應用研究(HNZY102013002)。

王群，煙葉分級技師，主要從事煙葉分級和煙葉品質研究。*通訊作者：楊丙釗。