解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)XZ-1發(fā)酵條件的優(yōu)化

楊冬靜,趙永強(qiáng),孫厚俊,張成玲,徐 振,謝逸萍

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131)

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)XZ-1發(fā)酵條件的優(yōu)化

楊冬靜,趙永強(qiáng),孫厚俊,張成玲,徐 振,謝逸萍*

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131)

采用單因素試驗和正交試驗,對解淀粉芽孢桿菌菌株XZ-1的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：XZ-1的發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽分別為糊精、蛋白胨和氯化鉀；其培養(yǎng)基最佳組分為糊精10 g/L,蔗糖5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉7 g/L;最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基初始pH值6,發(fā)酵溫度27 ℃,發(fā)酵時間36 h,裝液量100 mL/250 mL,接種量3%,轉(zhuǎn)速150 r/min。

解淀粉芽孢桿菌;單因素試驗;正交試驗;發(fā)酵條件;優(yōu)化

Abstract： The fermentation medium components and fermentation conditions forBacillusamyloliquefaciensstrain XZ-1 were optimized through single-factor test and orthogonal test. The results illustrated that the optimal carbon source, nitrogen source and inorganic salt in fermentation medium for XZ-1 were dextrin, peptone and potassium chloride, respectively. The best medium components included dextrin 10 g/L, sucrose 5 g/L, peptone 10 g/L and sodium chloride 7 g/L. The optimized fermentation conditions were initial pH-value 6 for medium, fermentation temperature 27 ℃, fermentation time 36 h, liquid medium volume 100 mL/250 mL, inoculum size 3%, and rotate speed 150 r/min.

Keywords：Bacillusamyloliquefaciens; Single-factor test; Orthogonal test; Fermentation condition; Optimization

隨著我國經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展、人們生活水平的不斷提高,人們的消費(fèi)觀念已經(jīng)逐漸轉(zhuǎn)變,對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)從單純追求高產(chǎn),到今天已經(jīng)在追求優(yōu)質(zhì)安全。由于化學(xué)藥劑防治帶來的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留嚴(yán)重影響了人類的健康,因此生物防治以其無毒、無殘留、對環(huán)境友好等優(yōu)勢吸引了國內(nèi)外大量植?？蒲泄ぷ髡叩淖⒁?。其中,解淀粉芽孢桿菌是眾多生防菌種中的一種,是自然界中廣泛存在的一種細(xì)菌,它繁殖迅速,對人畜無毒無害,與環(huán)境友好,且可產(chǎn)生芽孢并由此具有較強(qiáng)的耐逆性[1]。已有的研究結(jié)果表明,解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌親緣關(guān)系很近,可產(chǎn)生脂肽類和蛋白類抗菌物質(zhì),具有廣譜抗細(xì)菌和抗真菌活性[2-3],已得到廣泛的生產(chǎn)和應(yīng)用,如德國ABiTEP GmbH 公司已將解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensFZB42登記并產(chǎn)業(yè)化[4]。此外,解淀粉芽孢桿菌還能提高植物的抗鹽能力,如Chen等(2017)研究表明解淀粉芽孢桿菌菌株SQR9通過產(chǎn)生亞精胺可誘導(dǎo)擬南芥和玉米產(chǎn)生抗鹽性[5]?？梢?解淀粉芽孢桿菌已成為農(nóng)作物安全生產(chǎn)的重要資源之一。

本課題組從江蘇省徐州市銅山區(qū)班井村甘薯種植地分離篩選出解淀粉芽孢桿菌菌株XZ-1,該菌株具有廣譜抗真菌活性,對草莓炭疽病菌、絲瓜炭疽病菌、甘薯干腐病菌、小麥全蝕病菌、大豆菌核病菌、大蒜葉枯病菌、甜瓜枯萎病菌以及小麥紋枯病菌等病原真菌均有較強(qiáng)的拮抗活性(另文發(fā)表)。鑒于此，我們采用單因素試驗設(shè)計和正交試驗設(shè)計,進(jìn)一步對解淀粉芽孢桿菌XZ-1開展了發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化研究,以期為該菌株的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試菌株

解淀粉芽孢桿菌XZ-1從江蘇省徐州市銅山區(qū)班井村甘薯根際土壤中分離,經(jīng)本課題組篩選鑒定后保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,葡萄糖2.5 g,蒸餾水1000 mL,用于XZ-1活化以及發(fā)酵液的制備;該培養(yǎng)基于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min,備用[6]。

1.3菌體生物量的測定

采用酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan GO, USA),取300 μL發(fā)酵液于酶標(biāo)板中,以液體培養(yǎng)基為對照,測定OD600值；以O(shè)D600值作為判斷菌體生物量大小的標(biāo)準(zhǔn),若OD600值越大則菌量越大[7]。

1.4培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

碳源:分別用5 g/L的蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、檸檬酸、木糖和糊精替代NB發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖,制成培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。分別取50 μL種子發(fā)酵液，接種到各種含不同碳源的液體培養(yǎng)基中,在250 mL三角瓶中裝液體培養(yǎng)基的量為150 mL,在28 ℃、180 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24 h后取出,用酶標(biāo)儀測定OD600值；每個處理3次重復(fù),篩選出最佳碳源。

氮源:分別用10 g/L的蛋白胨、尿素、NH4Cl、酵母提取物、NH4NO3、(NH4)2SO4和酵母膏代替NB培養(yǎng)基中的蛋白胨和牛肉膏,其他接種、培養(yǎng)和測定方法同上；每個處理3次重復(fù),篩選出最佳氮源。

無機(jī)鹽:分別在NB培養(yǎng)基中加5 g/L的氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、硫酸鋅、硫酸銅和硫酸鐵,其他接種、培養(yǎng)和測定方法同上；每個處理3次重復(fù),篩選出最佳無機(jī)鹽。

多因素正交試驗:盡管以氯化鉀為無機(jī)鹽條件下發(fā)酵液的OD600值顯著高于以氯化鈉為無機(jī)鹽條件下的,但是市場上氯化鉀的價格約為氯化鈉價格的2倍,因此考慮到生產(chǎn)成本問題,筆者在單因素試驗篩選出最佳碳源糊精和蔗糖、最佳氮源蛋白胨以及無機(jī)鹽氯化鈉的基礎(chǔ)上，采用如表1所示的L9(34)正交表進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化試驗,培養(yǎng)基pH值為7.0,發(fā)酵溫度為28 ℃,在轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h,每個處理3次重復(fù)，以O(shè)D600值分析4因素3水平對菌體生物量的影響,以確定最佳的培養(yǎng)基配方[8]。

1.5發(fā)酵條件的優(yōu)化

培養(yǎng)基初始pH值:在優(yōu)化得到的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別對培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、裝液量、接種量以及轉(zhuǎn)速進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。用0.1 mol/LHCl和0.1 mol/L NaOH將培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)成5、6、7、8、9、10,每個處理裝液量為150 mL,然后接種50 μL種子發(fā)酵液,在轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵溫度28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，最后測定OD600值。發(fā)酵溫度設(shè)置21、24、27、30、34、37 ℃;發(fā)酵時間設(shè)置12、36、48、60、72、96 h;裝液量設(shè)置在250 mL三角瓶中分別裝培養(yǎng)基50、75、100、125、150、175 mL;按體積分?jǐn)?shù)將接種量設(shè)置為1%、3%、5%、7%、9%、10%;轉(zhuǎn)速設(shè)置90、120、150、180、210、240 r/min。在其他條件不變的情況下，改變某一發(fā)酵條件進(jìn)行試驗,分別測定和記錄OD600值,每組試驗重復(fù)3次[9]。

表1 L9(34)正交試驗設(shè)計

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)和作圖,采用生物統(tǒng)計分析軟件DPS進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基成分的篩選

由圖1可見：在供試的7種碳源中,當(dāng)以糊精作為碳源時XZ-1的生長量最大,其發(fā)酵液的OD600值達(dá)到0.662；在其他碳源條件下XZ-1的生長量從大到小依次為蔗糖0.642、麥芽糖0.387、葡萄糖0.332、木糖0.318、檸檬酸0.210和可溶性淀粉0.177。由于以蔗糖作為碳源時XZ-1發(fā)酵液的OD600值與以糊精為碳源時的沒有極顯著差異,因此考慮用糊精和蔗糖作為復(fù)合碳源。

圖中不同大寫字母表示1%極顯著差異。

從圖2可以看出：在供試的7種氮源中,當(dāng)以蛋白胨作為氮源時XZ-1的生長量最大,其OD600值高達(dá)0.825,極顯著高于其他6種氮源條件下XZ-1的生長量；在其他6種氮源下XZ-1發(fā)酵液的OD600值從大到小依次為酵母提取物0.802、酵母膏0.579、硫酸銨0.335、氯化銨0.299、硝酸銨0.275、尿素0.242,因此,選擇以蛋白胨作為最佳氮源。

圖2 不同氮源對解淀粉芽孢桿菌XZ-1生長的影響

由圖3可見：在供試的7種無機(jī)鹽中,當(dāng)以氯化鉀和氯化鈉作為無機(jī)鹽時,XZ-1的生長量居前兩位,其OD600值分別為0.743和0.702;在硫酸鐵、氯化鎂和氯化鈣作為無機(jī)鹽的條件下,XZ-1的生長量其次,其OD600值分別為0.581、0.578和0.548;硫酸鋅和硫酸鐵則顯著抑制XZ-1的生長。結(jié)合考慮生產(chǎn)成本,我們選擇氯化鈉作為無機(jī)鹽進(jìn)行后續(xù)的正交試驗。

圖3 不同無機(jī)鹽對解淀粉芽孢桿菌XZ-1生長的影響

2.2優(yōu)化培養(yǎng)基成分的正交試驗結(jié)果

以從2.1中篩選出的糊精(或蔗糖)、蛋白胨和氯化鈉分別作為最佳碳源、氮源和無機(jī)鹽,按照表1的設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)基成分的正交試驗。由表2和表3可見,不同水平的糊精對XZ-1的生長量有一定的影響,具體表現(xiàn)為糊精的濃度越高,XZ-1的生長量越低,極差為0.099;不同水平的蔗糖對XZ-1的生長量也有一定的影響,隨著蔗糖濃度從5 g/L增加到10 g/L,XZ-1的生長量逐漸增加,但是隨著蔗糖濃度從10 g/L進(jìn)一步增加到15 g/L,XZ-1的生長量反而下降,極差為0.071;不同水平的蛋白胨對XZ-1生長量的影響也表現(xiàn)為先升后降,極差為0.065; XZ-1的生長量隨著氯化鈉濃度的增加而增加,極差為0.130。結(jié)合正交試驗結(jié)果,認(rèn)為菌株XZ-1的發(fā)酵培養(yǎng)基的最適成分為:糊精10 g/L、蔗糖5 g/L、蛋白胨10 g/L和氯化鈉7 g/L。

表2 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分的正交試驗統(tǒng)計結(jié)果

注：括號外為各因素的水平值，括號內(nèi)為各因素的實際值(g/L)。

表3 培養(yǎng)基組分正交試驗評價結(jié)果(發(fā)酵液OD600值)

2.3XZ-1培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基的初始pH值 從圖4-1可見：在初始pH值為5、6時,XZ-1菌株的生長量居前2位；在pH值為6時,XZ-1發(fā)酵液的OD600值達(dá)到0.830,極顯著高于其他pH條件下的；隨著pH在6～10范圍內(nèi)逐漸增加,發(fā)酵液的OD600值逐漸下降；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值達(dá)到9以上時,該菌株的生長量極低。因此,可將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)節(jié)在6左右。

2.3.2 培養(yǎng)溫度 從圖4-2可以看出：當(dāng)培養(yǎng)溫度為27 ℃時,XZ-1的生長量極顯著高于其他溫度下的；XZ-1在其他幾個溫度下的發(fā)酵液生長量表現(xiàn)為30 ℃>24 ℃>34 ℃>21 ℃>37 ℃。所以,該菌株最佳的發(fā)酵溫度為27 ℃。

2.3.3 培養(yǎng)時間 圖4-3表明：XZ-1菌株在培養(yǎng)時間為12～36 h時,其發(fā)酵液的OD600值顯著升高,當(dāng)搖培36 h時發(fā)酵液的OD600值高達(dá)1.172;當(dāng)繼續(xù)增加搖培時間時,菌株的生長量逐漸下降。由此推測該菌株從36 h之后逐漸進(jìn)入生長衰退期,因此,我們認(rèn)為該菌株的最佳發(fā)酵時間為36 h。

2.3.4 裝液量 不同裝液量的試驗結(jié)果如圖4-4所示,在250 mL三角瓶中,XZ-1的生長量起初隨著裝液量的增加而增加,當(dāng)裝液量達(dá)到100 mL時,XZ-1發(fā)酵液的OD600值最高,為0.923;此后隨著裝液量繼續(xù)增加,XZ-1發(fā)酵液的OD600值逐漸下降。說明XZ-1的生長對通氣量有一定的要求,通氣量過大或過小都不利于該菌株的生長。由此,我們認(rèn)為XZ-1的最佳裝液量為在250 mL三角瓶中裝液100 mL。

2.3.5 接種量 XZ-1的生長也在一定程度上受接種量的影響,結(jié)果如圖4-5所示,當(dāng)接種量從1%增加到3%時,XZ-1發(fā)酵液的OD600值逐漸上升,當(dāng)接種量為3%時,XZ-1發(fā)酵液的OD600值達(dá)到最高(0.829);此后隨著接種量的繼續(xù)增加,XZ-1發(fā)酵液的OD600值逐漸下降。因此我們認(rèn)為XZ-1的最佳接種量為3%。

2.3.6 轉(zhuǎn)速 從圖4-6可以看出,搖床的轉(zhuǎn)速對XZ-1的生長有較大的影響,當(dāng)轉(zhuǎn)速低于150 r/min 時,該菌株的生長量較小;當(dāng)轉(zhuǎn)速在150 r/min時,該菌株的生長量達(dá)到峰值,其發(fā)酵液的OD600為0.860;當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)升高后,其OD600值又逐漸下降。因此,XZ-1的最適轉(zhuǎn)速為150 r/min。

圖4 不同發(fā)酵條件對解淀粉芽孢桿菌生長的影響

3 討論與結(jié)論

發(fā)酵培養(yǎng)是生防菌應(yīng)用推廣的工業(yè)基礎(chǔ),而發(fā)酵技術(shù)是制備生物產(chǎn)品的重要手段,其中發(fā)酵培養(yǎng)基成分、發(fā)酵液的溶氧量、發(fā)酵液的pH值、發(fā)酵時間以及搖床轉(zhuǎn)速等多種因素對發(fā)酵產(chǎn)品均有較大的影響。近年來，關(guān)于生防菌株發(fā)酵培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究報道有很多[10,13],其中關(guān)于解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化的報道也不少,如洪鵬等(2013)研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖和蔗糖為解淀粉芽孢桿菌菌株HF-01生長的最佳碳源,有機(jī)氮源有利于該菌株菌體的生長，而銨態(tài)氮源不利于該菌體的生長,其最適pH值為6.0～ 6.5,最適發(fā)酵時間為48 h[14];章小洪等(2012)研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌菌株BW-13的最佳碳源為玉米粉,最佳氮源為蛋白胨,最佳金屬離子為Mn2+,發(fā)酵液最佳pH值為5.0,最佳裝液量為30 mL/250 mL,最佳接種量為4%,最佳發(fā)酵溫度為28 ℃,最佳轉(zhuǎn)速為200 r/min,最佳發(fā)酵時間為144 h[15]。據(jù)盧彩鴿等(2015)報道，解淀粉芽孢桿菌菌株MH71的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分為玉米粉36.6 g/L,葡萄糖14.0 g/L,牛肉膏3.2 g/L,蛋白胨7.0 g/L, NaCl 1.33 g/L, K2HPO40.8 g/L, MgSO4·7H2O 0.4 g/L, CaCO38.0 g/L；其最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,培養(yǎng)基初始pH值7.0,最佳接種量3%,最佳裝液量100 mL/500 mL,最佳發(fā)酵時間72 h[16]。這些結(jié)果與本研究得出的部分結(jié)果有所差異,可見,由于菌株的來源不同,菌株本身的生物學(xué)特性存在差異,其發(fā)酵培養(yǎng)條件不能一概而論。因此,選擇適合菌株本身生長的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件,有利于增加菌體產(chǎn)量,使菌株的生防潛力得到充分的發(fā)揮。

本文采用單因素試驗設(shè)計和正交試驗設(shè)計方法,對解淀粉芽孢桿菌菌株XZ-1的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明：XZ-1發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源為糊精,最佳氮源為蛋白胨,最佳無機(jī)鹽為氯化鉀；最佳培養(yǎng)基組分為糊精10 g/L,蔗糖5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉7 g/L; XZ-1的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH值6,發(fā)酵溫度27 ℃,發(fā)酵時間36 h,裝液量100 mL/250 mL,接種量3%,轉(zhuǎn)速150 r/min。

此外,受環(huán)境和不同發(fā)酵條件的影響,生防菌的抑菌能力往往存在較大的差異。下一步我們還將開展不同發(fā)酵培養(yǎng)基成分以及不同發(fā)酵條件對XZ-1發(fā)酵液抑菌活性的影響研究,為該生防菌株的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

OptimizationofFermentationConditionsforBacillusamyloliquefaciensStrainXZ-1

YANG Dong-jing, ZHAO Yong-qiang, SUN Hou-jun, ZHANG Cheng-ling, XU Zhen, XIE Yi-ping*

(Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area in Jiangsu / Key Laboratory of Sweet Potato Biology and Genetic Improvement of Agricultural Ministry, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xuzhou 221131, China)

S482.292

A

1001-8581(2017)10-0035-05

2017-06-02

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-11-B-09)。

楊冬靜(1983─),女,四川射洪人,助理研究員,碩士,主要從事植物病理學(xué)研究。*通訊作者:謝逸萍。