河南省副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

朱文豪，徐引弟，方劍玉，王治方，張青嫻，焦文強，李海利，許 峰

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

河南省副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

朱文豪1，2，徐引弟1，2，方劍玉1，2，王治方1，2，張青嫻1，2，焦文強1，2，李海利1，2，許 峰1，2

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

從河南省內(nèi)不同縣市的部分豬場送檢疑似感染副豬嗜血桿菌病病料中分離鑒定到9株致病菌。為防治疾病傳播，控制疫情蔓延，對分離菌株進行病理剖檢、細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定以及PCR鑒定和藥敏試驗。結果表明，分離到的致病菌為副豬嗜血桿菌。藥敏試驗顯示9株分離菌株對氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢他啶、氟苯尼考、阿奇霉素、阿莫西林高敏；對壯觀霉素、左氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感；對克林霉素、阿米卡星、卡那霉素、恩諾沙星不敏感或耐藥；對紅霉素、羅紅霉素、新霉素、四環(huán)素、強力霉素敏感性不穩(wěn)定，表現(xiàn)不一。

豬；副豬嗜血桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

副豬嗜血桿菌病是近幾年危害養(yǎng)豬業(yè)比較嚴重的豬病之一，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）引起的一種傳染病。該病主要發(fā)生在斷奶仔豬和保育豬，發(fā)病率為10%～15%，嚴重時死亡率高達50%[1]。副豬嗜血桿菌是革蘭氏陰性菌，屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，其形態(tài)長絲狀小短桿。副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的一種常在菌，具有條件致病性，主要危害2～28周齡仔豬和生長豬，特別是在5～8周齡保育仔豬上，可引發(fā)較為嚴重的身體多部位疾病，以關節(jié)炎性腫、腦膜炎和纖維素性多發(fā)性漿膜炎為特征病變[2]。該病近幾年流行比較廣泛，發(fā)病后死亡率比較高，治療緩慢，愈后恢復時間長，給養(yǎng)殖場帶來巨大經(jīng)濟損失。臨床上，該病表現(xiàn)為氣喘咳嗽、發(fā)熱、精神沉郁、消瘦、被毛凌亂、跛行以及共濟失調(diào)等癥狀，個別還有神經(jīng)癥狀。剖檢多見有胸肺粘連，胸腔內(nèi)蓄積淡黃色液體；跗關節(jié)現(xiàn)黏性混濁積液。本試驗結合最近養(yǎng)殖場情況，對副豬嗜血桿菌進行研究。針對該病的流行情況進行細菌分離，并對分離到的致病性菌株進行鑒定和耐藥性檢測，篩選敏感藥物，以便指導養(yǎng)殖場合理用藥，為控制副豬嗜血桿菌病的發(fā)生提供綜合防制措施，為廣大獸醫(yī)工作者提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采自2016年9月份以來河南省不同縣市部分養(yǎng)殖戶送檢豬只，共22份。無菌條件下抽取關節(jié)積液、心包液、腹水和臟器等做為病料進行試驗。

1.1.2 主要試劑 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）由廣州鼎國生物有限公司提供；乳牛血清購自北京四季青生物試劑有限公司；巧克力瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術有限公司；DNA提取試劑盒等購自大連寶生物公司；生化微量發(fā)酵管和藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 使用胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基（Becton Dickinson），另含終濃度5%的乳牛血清，0.001%NAD；巧克力瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.4 供試動物 30只小白鼠由鄭州大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 將病料接種于添加終濃度為0.001%NAD和5%乳牛血清的TSA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h。

1.2.2 病原菌的純化培養(yǎng)及形態(tài)鑒定 挑取胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上生長的透明的、水樣飽滿圓形可疑菌落，接種于TSA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)。把純化后的菌株挑取單個菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯中在搖床中37℃，180 r/min培養(yǎng)24～48 h；將疑似菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢，觀察其生長形態(tài)及特征[3]。

1.2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象觀察 將純化菌落接種于5%乳牛血清無NAD的TSA培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)基上水平劃線，用金黃色葡萄球菌垂直劃線點種其上，37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察在金黃色葡萄球菌周圍是否出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。

1.2.4 生化試驗 挑取經(jīng)純培養(yǎng)的可疑菌落并分別接種于乳糖、果糖、甘露醇、麥芽糖等生化反應管中，37℃培養(yǎng)48 h后觀察試驗結果并記錄[4]。

1.2.5 PCR鑒定 根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA基因（M75065）序列設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預期擴增產(chǎn)物的大小為821 bp，上游引物 A1：5'－GGCTTCGTCACCCTCTGT－3'；下游引物 A2：5'－GTGATGAGGAAGGGTGGTGT－3'。提取分離細菌的DNA PCR反應體系總 25 μL：2xTaq PCR Master Mix 12.5 μL，4 μL 模板 DNA，引物 A1、A2 各 1 μL，6.5 μL 滅菌超純水。反應條件：預變性94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、56 ℃退火 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；延伸72℃5 min。以滅菌超純水為陰性對照，取10 μL PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并分析結果。

1.2.6 小鼠致病性試驗 將PCR鑒定結果陽性的菌株接種于0.001%NAD和5%乳牛血清的TSB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，用無菌生理鹽水5倍稀釋，試驗組小白鼠皮下接種0.6 mL，對照組小白鼠皮下注射0.6 mL無菌生理鹽水，24 h后觀察小鼠情況。將死亡小白鼠剖檢，采集小白鼠肺和脾臟并進行病料處理，接種于0.001%NAD和5%乳牛血清的TSA培養(yǎng)基上，觀察結果，涂片鑒定或者PCR鑒定。

1.2.7 藥敏試驗 將分離純化好的菌落均勻涂抹接種到0.001%NAD和5%乳牛血清的TSA培養(yǎng)基上，將不同的藥敏片粘貼于培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)36～48 h，測量各藥敏片抑菌環(huán)直徑，抑菌圈直徑≥25 mm為高敏，15～25 mm為中敏，≤14 mm為不敏感或耐藥[5]。

2 結果與分析

2.1 剖檢病理變化

剖檢病豬能夠發(fā)現(xiàn)病變以關節(jié)炎、胸膜炎、腹膜炎最為常見。心臟、肝臟、脾臟、肺臟以及腸道等器官表面有纖維素樣滲出；部分病變部位，如心包、胸腔或腹腔可見淡黃色混濁液蓄積；跗關節(jié)內(nèi)有黏性混濁積液。

2.2 細菌培養(yǎng)及形態(tài)觀察

采集22份病樣進行培養(yǎng)，分離到9株細菌。將純化的菌株分別在普通瓊脂、營養(yǎng)肉湯、麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)未見細菌生長；在0.001%NAD和5%乳牛血清的TSA培養(yǎng)基上和巧克力瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，均有菌落生長。形態(tài)呈無色透明或灰白色半透明、露珠狀、圓潤扁平的小菌落。挑選菌落抹片革蘭氏染色油鏡下觀察，可見革蘭氏染色為陰性、具有多種不同的形態(tài)，呈單個的球桿狀、長桿狀、細長桿及絲狀細小桿菌（圖1）。以上符合副豬嗜血桿菌的菌落和細菌形態(tài)[3，6-7]。

圖1 油鏡下HPS的革蘭氏染色形態(tài)

2.3 衛(wèi)星試驗

通過劃線接種金黃色葡萄球菌，出現(xiàn)在金黃色葡萄球菌線兩側有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長，并且距離金黃色葡萄球菌由近及遠菌落生長由大變小至未見生長，同時由多變少，呈現(xiàn)出“衛(wèi)星現(xiàn)象”，符合副豬嗜血桿菌的培養(yǎng)特性。

2.4 生化試驗

將分離的細菌接種到生化管，37℃培養(yǎng)48 h結果顯示接觸酶試驗陽性，氧化酶、脲酶、吲哚及硝酸鹽還原試驗均為陰性；可以發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、半乳糖等，不發(fā)酵乳糖、山梨醇、葡萄糖酸鹽、甘露醇，符合副豬嗜血桿菌的生化鑒定特點。

2.5 小鼠致病性試驗

試驗組小白鼠24 h后出現(xiàn)死亡，對照組正常。將死亡小白鼠采集病料，分離純化細菌得到透明、露珠狀細小可疑菌落，經(jīng)PCR鑒定為副豬嗜血桿菌。

2.6 PCR鑒定結果

對分離到的9株菌株進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在821 bp處出現(xiàn)特異性條帶（圖2），表明所分離到的9株菌株為副豬嗜血桿菌。

圖2 分離菌株的PCR鑒定

2.7 藥敏試驗結果

從表1我們可以得出：分離菌株對氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢他啶、氟苯尼考、阿奇霉素、阿莫西林高敏；對壯觀霉素、左氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感；對克林霉素、阿米卡星、卡那霉素、恩諾沙星不敏感或耐藥；對紅霉素、羅紅霉素、新霉素、四環(huán)素、強力霉素敏感性不穩(wěn)定，表現(xiàn)不一。

表1 藥敏試驗結果

3 討論

從研究結果表明，副豬嗜血桿菌病現(xiàn)在流行比較廣泛，已經(jīng)成為養(yǎng)豬業(yè)普遍存在，危害較大的細菌病之一。過去，副豬嗜血桿菌被認為是一種隨機入侵的次要病原，在與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌等協(xié)同作用時才引發(fā)臨床癥狀[6，8]。

在本試驗中，病原采集主要在發(fā)熱期的病豬進行耳緣靜脈或前腔靜脈采集血液；發(fā)病豬死后，采集心血、心包液、胸水、腹水、纖維蛋白性滲出物、肺、肝臟等作為病料。通過分離病原時發(fā)現(xiàn)，對患病豬只剖殺采集病原，以及死亡12 h內(nèi)采集病原進行病原分離，可提高病原的分離率，同時注意病料不可冷凍，否則無法采集病原。在本試驗采集病料進行病原菌的分離時發(fā)現(xiàn)患病豬只的腎臟、脾臟、肝臟等內(nèi)臟器官等部位采集的病料較難分離出病原菌，而在腫大的關節(jié)液、心包積液和肺支氣管等部位分離病原的檢出率較高，說明關節(jié)、心臟、肺臟是副豬嗜血桿菌重要的感染器官。同時，在病料采集時問詢戶主是否使用抗生素，如果有使用則病原采集率較低。

在細菌培養(yǎng)過程中，由于副豬嗜血桿菌擁有莢膜，對培養(yǎng)基要求較高，必須使用TSA和TSB含量高的培養(yǎng)基，這樣可以大幅縮短培養(yǎng)時間。該菌生長較為緩慢且菌落細小，24 h內(nèi)只能長出針尖大小的菌落，不仔細觀察不易發(fā)現(xiàn)，36～48 h后可挑出菌落，進行下一步試驗。目前，副豬嗜血桿菌的治療主要以抗菌藥物為主，本試驗中使用19種藥物進行藥敏試驗，其中分離菌株對氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢他啶、氟苯尼考、阿奇霉素、阿莫西林高敏，藥敏試驗結果與他人報道有所不同[9-10]。分析認為可能與畜主使用抗菌藥物有關，不同的抗菌藥使得臨床藥敏試驗產(chǎn)生不同的結果。這種差異也說明了地方分離菌株對敏感藥物的篩選在對本地區(qū)副豬嗜血桿菌病的預防及治療具有重要的指導性作用。也有學者進行中藥藥敏試驗，結果表明金銀花及其復方制劑對副豬嗜血桿菌抑制作用明顯[11]。

結合本次試驗結果，對發(fā)病豬場使用高敏藥物治療。通過回訪追蹤發(fā)現(xiàn)，大部分豬場經(jīng)常使用抗生素，對母豬及豬群進行預防性混飼給藥，使其攜帶的耐藥菌株代代相傳，使耐藥性變得越來越嚴重，對其菌株的分離以及后續(xù)的藥敏試驗增加難度。因此在臨床上，應避免盲目用藥，務必結合豬場之前用藥情況，同時參考藥敏試驗結果選取用藥。其用藥原則是平時使用較少的，藥敏試驗高敏的，組織分布濃度高且穿透性強的抗菌藥物。同時，有條件鑒定血清型的豬場可以根據(jù)副豬嗜血桿菌的血清型注射相符的商品疫苗，以達到最佳治療效果。

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（編輯：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2017)05-0102-03

2017-06-30

河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新項目（2017zc50）

朱文豪（1979-），男，河南西平人，助理研究員，碩士，研究方向為動物微生物免疫學.E-mail：hnwenhao@163.com