基于ISSR標記的獼猴桃品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建

張安世， 韓臣鵬， 齊秀娟， 張中海

(1. 焦作師范高等?？茖W(xué)校理工學(xué)院， 河南 焦作 454000； 2. 鄭州綠博園管理中心， 河南 鄭州 451470；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所， 河南 鄭州 450009)

基于ISSR標記的獼猴桃品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建

張安世1，①， 韓臣鵬2， 齊秀娟3， 張中海1

(1. 焦作師范高等?？茖W(xué)校理工學(xué)院， 河南 焦作 454000； 2. 鄭州綠博園管理中心， 河南 鄭州 451470；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所， 河南 鄭州 450009)

采用ISSR標記對中華獼猴桃(ActinidiachinensisPlanch.)、美味獼猴桃〔A.chinensisvar.deliciosa(A. Chev.) A. Chev.〕、軟棗獼猴桃〔A.arguta(Sieb. et Zucc.) Planch. ex Miq.〕和毛花獼猴桃(A.erianthaBenth.)的32個樣本進行了遺傳多樣性分析，并以ISSR標記為基礎(chǔ)構(gòu)建了DNA指紋圖譜。結(jié)果表明：篩選的10個多態(tài)性高且條帶清晰的引物共擴增出200個條帶(位點)，其中，多態(tài)性位點195個，多態(tài)性位點百分率(PPL)達97.50%；各引物的多態(tài)性信息含量(PIC)以及供試樣本的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s多樣性指數(shù)(I)的總均值分別為0.908 0、1.980 0、1.356 9、0.225 5和0.361 3，4個獼猴桃種間的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.414 6，基因流(Nm)為0.705 9，且32個樣本間的Na、Ne、H和I值差異極顯著(P<0.001)。供試32個樣本間的遺傳相似系數(shù)(GS)為0.565 0～0.965 0，平均值為0.716 4；基于GS值進行UPGMA聚類分析，在GS值為0.76處將32個樣本分為4組，基本對應(yīng)供試的4個獼猴桃種類，其中，第Ⅰ組的大多數(shù)樣本屬于美味獼猴桃品種，第Ⅱ組的樣本均屬于中華獼猴桃品種，第Ⅲ組的樣本屬于毛花獼猴桃品種，第Ⅳ組的樣本均屬于軟棗獼猴桃品種。分子方差分析結(jié)果表明：4個獼猴桃的種間變異占總變異的40.84%，種內(nèi)變異占總變異的59.16%。研究結(jié)果表明：供試的獼猴桃品種間遺傳分化程度較高，基因交流頻率較低，且總遺傳變異的近60%存在于種內(nèi)，說明供試的獼猴桃品種具有較豐富的遺傳多樣性。另外，根據(jù)10個ISSR引物的擴增結(jié)果，篩選出引物UBC818、UBC824、UBC854和UBC895擴增的15個多態(tài)性位點構(gòu)建的DNA指紋圖譜可用于供試32個獼猴桃樣本的鑒定。

獼猴桃； ISSR標記； 遺傳多樣性； 聚類分析； DNA指紋圖譜

Abstract： Genetic diversity of 32 samples ofActinidiachinensisPlanch.，A.chinensisvar.deliciosa(A. Chev.) A. Chev.，A.arguta(Sieb. et Zucc.) Planch. ex Miq. andA.erianthaBenth. were analyzed by using ISSR marker， and DNA fingerprinting was constructed based on ISSR marker. The results show that 200 bands (loci) are amplified by 10 primers screened with high polymorphic and clear band， in which， there are 195 polymorphic loci with percentage of polymorphic loci (PPL) of 97.50%. The overall averages of polymorphism information content (PIC) of each primer， observed number of alleles (Na)， effective number of alleles (Ne)， Nei’s gene diversity index (H) and Shannon’s diversity index (I) of samples tested are 0.908 0， 1.980 0， 1.356 9， 0.225 5 and 0.361 3， respectively. The genetic differentiation coefficient (Gst) and gene flow (Nm) of four species inActinidiaLindl. are 0.414 6 and 0.705 9， respectively. The differences inNa，Ne，HandIvalues among 32 samples are extremely significant (P<0.001). The genetic similarity coefficient (GS) among 32 samples tested is 0.565 0-0.965 0 with average of 0.716 4. UPGMA cluster analysis is carried out according to GS value， and 32 samples are divided into four groups at GS value of 0.76， which correspond to the four species inActinidiatested. Among them， most of samples in group Ⅰ belong to cultivars ofA.chinensisvar.deliciosa， samples in group Ⅱ belong to cultivars ofA.chinensis， sample in group Ⅲ belongs to cultivar ofA.eriantha， and samples in group Ⅳ belong to cultivars ofA.arguta. The results of molecular variance analysis show that interspecies variation of four species inActinidiaaccounts for 40.84% of the total variation， while intraspecies variation accounts for 59.16% of the total variation. It is suggested that cultivars ofActinidiaspp. tested have high degree of genetic differentiation and low gene exchange frequency， and nearly 60% of the total genetic variation is existed in species， indicating that there is abundant genetic diversity in cultivars ofActinidiaspp. tested. In addition， 15 polymorphic loci amplified by primers UBC818， UBC824， UBC854 and UBC895 are screened based on amplification result of ten ISSR primers， and DNA fingerprinting is constructed， which can be used to identify 32 samples ofActinidiaspp. tested.

Keywords：Actinidiaspp.； ISSR marker； genetic diversity； cluster analysis； DNA fingerprinting

獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)植物為多年生藤本，雌雄異株；現(xiàn)有54種21變種[1]，絕大部分為中國特有種類，故亦稱為中國半特有屬[2]。該屬部分種類的果實為知名水果，在中國的種植面積和市場需求不斷擴大，其中，中華獼猴桃(A.chinensisPlanch.)和美味獼猴桃〔A.chinensisvar.deliciosa(A. Chev.) A. Chev.〕種植最為廣泛，軟棗獼猴桃〔A.arguta(Sieb. et Zucc.) Planch. ex Miq.〕在部分地區(qū)也已開始商業(yè)栽培。在獼猴桃種植業(yè)發(fā)展過程中，人們已經(jīng)根據(jù)不同的需求培育出大量的栽培品種，特別是近年來隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，異地間的品種交換日趨頻繁，導(dǎo)致獼猴桃品種混雜[3]，存在“同名異物”或“同物異名”的現(xiàn)象，不利于獼猴桃品種的推廣應(yīng)用和鑒定，因此，有必要對不同獼猴桃品種的遺傳特性進行深入研究。

ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記技術(shù)[4]具有引物通用性強、利用率高、操作簡便和重復(fù)性強等優(yōu)點，在植物的遺傳多樣性、系統(tǒng)進化、DNA指紋圖譜及核心種質(zhì)構(gòu)建等方面已得到廣泛的應(yīng)用[5-9]，目前，ISSR標記已成功應(yīng)用于獼猴桃種質(zhì)資源研究[10-11]。為明晰國產(chǎn)獼猴桃品種的起源，探尋準確區(qū)分獼猴桃品種遺傳特性的方法，作者借鑒前人的研究結(jié)果，以國產(chǎn)32個獼猴桃樣本(包括5個品種的雄株)為研究對象，利用ISSR標記進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建DNA指紋圖譜，以期為獼猴桃種質(zhì)資源的保護利用和新品種選育等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料均來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所獼猴桃選種圃(地理坐標為東經(jīng)113°42′36″、北緯34°42′36″)，共4種32個樣本(包括27個品種的雌株和5個品種的雄株)，分別為美味獼猴桃品種‘徐香’(‘Xuxiang’)、‘金魁’(‘Jinkui’)、‘金魁’雄株、‘皖翠’(‘Wancui’)、‘金碩’(‘Jinshuo’)、‘中獼2號’(‘Zhongmi 2’)、‘海艷’(‘Haiyan’)、‘米良1號’(‘Miliang 1’)、‘海沃德’(‘Hayward’)和‘布魯諾’(‘Bruno’)；中華獼猴桃品種‘翠玉’(‘Cuiyu’)、‘紅陽’(‘Hongyang’)、‘黃陽’(‘Huangyang’)、‘黃陽’雄株、‘晚紅’(‘Wanhong’)、‘楚紅’(‘Chuhong’)、‘早金’(‘Hort16A’)、‘金艷’(‘Jinyan’)、‘瓊漿’(‘Qiongjiang’)、‘豫皇1號’(‘Yuhuang 1’)和‘湘吉紅’(‘Xiangjihong’)；軟棗獼猴桃品種‘紅寶石星’(‘Ruby star’)、‘紅寶石星’雄株、‘軟紅’(‘Ruanhong’)、‘紅貝’(‘Hongbei’)、‘紅貝’雄株、‘華紅1號’(‘Huahong 1’)、‘華紅2號’(‘Huahong 2’)、‘魁綠’(‘Kuilü’)和‘桓優(yōu)1號’(‘Huanyou 1’)；毛花獼猴桃(A.erianthaBenth.)品種‘華特’(‘Huate’)和‘華特’雄株。所有供試植株株齡均為7 a，每個樣本隨機選取3株，每株采集2枚健康的幼葉，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存、備用。

主要儀器：Biofuge Primo R型冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)、PTC-200型 PCR儀(美國Bio-Rad公司)、NanoDrop 1000紫外分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)和G：BOX-HR凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene公司)。主要試劑2×TaqMasterMix(含TaqDNA聚合酶、2×TaqPCR buffer、3 mmol·L-1MgCl2和400 μmol·L-1dNTP Mix)和DL2000 DNA Marker均購自北京康為世紀生物科技有限公司；ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的序列，由金唯智生物科技(北京)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 每個樣本取3枚幼葉，混合，采用改良CTAB法[12]提取基因組DNA，并用質(zhì)量體積分數(shù)0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 1000紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度。用TE緩沖液將DNA稀釋至20 ng·μL-1，于-20 ℃保存、備用。

1.2.2 ISSR-PCR擴增 選用40個ISSR引物進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系總體積10.0 μL，包含0.4 μL DNA、1.0 μL引物、5.0 μL 2×TaqMasterMix和3.6 μL RNase-Free water。擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min、退火1 min(退火溫度依引物而定)、72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)40次；最后于72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物于4 ℃保存，并用質(zhì)量體積分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

對上述40個ISSR引物的擴增條帶進行比較，從中篩選出10個多態(tài)性高且條帶清晰的引物，并對各引物的擴增條帶進行統(tǒng)計分析，有條帶記為“1”、無條帶記為“0”，并據(jù)此構(gòu)建“1”和“0”矩陣。利用POPGENE 1.32軟件進行32個獼猴桃樣本的遺傳多樣性參數(shù)分析，計算多態(tài)性位點百分率(PPL)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s多樣性指數(shù)(I)、基因流(Nm)和遺傳分化系數(shù)(Gst)以及遺傳相似系數(shù)(GS)和遺傳距離(GD)，并利用SPSS 17.0軟件對Na、Ne、H和I值進行非參數(shù)Kruskal Wallis Test獨立樣本檢驗。采用GenALEx 6.5軟件進行分子方差分析(AMOVA)。參照黃秀等[13]的方法計算各引物的多態(tài)性信息含量(PIC)，采用NTSYS-pc 2.0軟件構(gòu)建UPGMA聚類圖；同時，參照張林等[14]的方法構(gòu)建32個獼猴桃樣本的DNA指紋圖譜，并采用G：BOX-HR凝膠成像系統(tǒng)中的Genetool軟件計算各條帶的片段長度。

2 結(jié)果和分析

2.1 ISSR擴增結(jié)果及遺傳多樣性分析

采用10個多態(tài)性高且條帶清晰的引物對32個獼猴桃樣本進行ISSR分析，擴增結(jié)果見表1。由表1可以看出：10個引物共擴增出200個條帶(位點)，其中，多態(tài)性位點有195個，多態(tài)性位點百分率(PPL)為97.50%，表明這些引物具有較高的多態(tài)性。10個引物中，引物UBC835(2)擴增的位點總數(shù)最多(27個)，引物UBC820擴增的位點總數(shù)最少(14個)，平均每個引物擴增的位點總數(shù)為20個。引物UBC854的擴增圖譜見圖1。該引物共擴增出20個條帶，擴增出的DNA片段長度為220～2 163 bp，且均為多態(tài)性條帶，PPL值為100.00%；類似的引物還有UBC815、UBC818、UBC824和UBC835(2)，其擴增的位點也均為多態(tài)性位點。

表1基于10個ISSR引物對27個獼猴桃品種32個樣本的遺傳多樣性分析1)

Table1Analysisongeneticdiversityof32samplesof27cultivarsofActinidiaspp.basedontenISSRprimers1)

引物編號Primercode引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')t/℃NNPPPL/%PICNaNeHIUBC815CTCTCTCTCTCTCTCTG52.42121100.000.91402.00001.35920.23040.3740UBC818CACACACACACACACAG52.42121100.000.91452.00001.39120.23440.3687UBC820GTGTGTGTGTGTGTGTC52.4141392.860.88672.00001.43160.26050.4057UBC824TCTCTCTCTCTCTCTCG52.42020100.000.91932.00001.36910.23960.3841UBC835(1)AGAGAGAGAGAGAGAGCC53.8201995.000.91971.95001.38960.24860.3930UBC835(2)AGAGAGAGAGAGAGAGTC56.12727100.000.92692.00001.35040.21640.3469UBC840GAGAGAGAGAGAGAGATT51.6151493.330.89701.93331.49020.28910.4401UBC841GAGAGAGAGAGAGAGACC53.8222195.450.92011.95451.38450.23940.3778UBC854TCTCTCTCTCTCTCTCAG53.82020100.000.91252.00001.30530.20510.3364UBC895AGAGTTGGTAGCTCTT-GATC56.4201995.000.86921.95001.15160.11870.2218總計Total200195總均值Overallaver-age20.019.597.500.90801.98001.35690.22550.3613

1)t： 退火溫度Annealing temperature； N： 位點總數(shù)Total number of loci； NP： 多態(tài)性位點數(shù)Number of polymorphic loci； PPL： 多態(tài)性位點百分率Percentage of polymorphic loci；PIC： 多態(tài)性信息含量Polymorphism information content；Na： 觀測等位基因數(shù)Observed number of alleles；Ne： 有效等位基因數(shù)Effective number of alleles；H： Nei’s 基因多樣性指數(shù)Nei’s gene diversity index；I： Shannon’s多樣性指數(shù)Shannon’s diversity index.

由表1還可以看出：基于10個引物的ISSR擴增結(jié)果分析了32個獼猴桃樣本的遺傳多樣性參數(shù)，其中，多態(tài)性信息含量(PIC)均值為0.869 2～0.926 9，總均值為0.908 0；觀測等位基因數(shù)(Na)均值為1.933 3～2.000 0，總均值為1.980 0；有效等位基因數(shù)(Ne)均值為1.151 6～1.490 2，總均值為1.356 9；Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)均值為0.118 7～0.289 1，總均值為0.225 5；Shannon’s多樣性指數(shù)(I)均值為0.221 8～0.440 1，總均值為0.361 3。4個獼猴桃種間的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.414 6，表明總遺傳變異的41.46%存在于種間，58.54%存在于種內(nèi)?；蛄?Nm)為0.705 9，表明4個獼猴桃種間的遺傳分化程度較高，基因交流頻率較低。

分子方差分析結(jié)果表明(表2)：4個獼猴桃的種間變異占總變異的40.84%，種內(nèi)變異占總變異的59.16%，與Gst值的分析結(jié)果對應(yīng)，說明4個獼猴桃種間存在較為豐富的遺傳多樣性。對Na、Ne、H和I值的檢驗結(jié)果顯示：供試的32個獼猴桃樣本間的遺傳多樣性水平存在極顯著差異(X2=35.753，P<0.001)，表明基于這10個ISSR引物的擴增結(jié)果計算的各項遺傳多樣性參數(shù)均能切實反映獼猴桃品種間的遺傳多樣性水平。

M： DNA marker； 1-3，5-11： 美味獼猴桃品種 Cultivars of Actinidia chinensis var. deliciosa (A. Chev.) A. Chev.； 4，12-21： 中華獼猴桃品種 Cultivars of A. chinensis Planch.； 22-30： 軟棗獼猴桃品種 Cultivars of A. arguta (Sieb. et Zucc.) Planch. ex Miq.； 31，32： 毛花獼猴桃品種 Cultivars of A. eriantha Benth. 1： ‘徐香’‘Xuxiang’； 2： ‘金魁’‘Jinkui’； 3： ‘金魁’(雄株)‘Jinkui’(male plant)； 4： ‘翠玉’‘Cuiyu’； 5： ‘皖翠’‘Wancui’； 6： ‘金碩’‘Jinshuo’； 7： ‘中獼2號’‘Zhongmi 2’； 8： ‘海艷’‘Haiyan’； 9： ‘米良1號’‘Miliang 1’； 10： ‘海沃德’‘Hayward’； 11： ‘布魯諾’‘Bruno’； 12： ‘紅陽’‘Hongyang’； 13： ‘黃陽’‘Huangyang’； 14： ‘黃陽’(雄株)‘Huangyang’(male plant)； 15： ‘晚紅’‘Wanhong’； 16： ‘楚紅’‘Chuhong’； 17： ‘早金’‘Hort16A’； 18： ‘金艷’‘Jinyan’； 19： ‘瓊漿’‘Qiongjiang’； 20： ‘豫皇1號’‘Yuhuang 1’； 21： ‘湘吉紅’‘Xiangjihong’； 22： ‘紅寶石星’‘Ruby star’； 23： ‘紅寶石星’(雄株)‘Ruby star’(male plant)； 24： ‘軟紅’‘Ruanhong’； 25： ‘紅貝’‘Hongbei’； 26： ‘紅貝’(雄株)‘Hongbei’(male plant)； 27： ‘華紅1號’‘Huahong 1’； 28： ‘華紅2號’‘Huahong 2’； 29： ‘魁綠’‘Kuilü’； 30： ‘桓優(yōu)1號’‘Huanyou 1’； 31： ‘華特’(雄株)‘Huate’(male plant)； 32： ‘華特’‘Huate’.圖1 引物UBC854對27個獼猴桃品種32個樣本的ISSR擴增圖譜Fig. 1 ISSR amplification pattern of 32 samples of 27 cultivars of Actinidia spp. by primer UBC854

表2基于ISSR標記的4個獼猴桃種類的分子方差分析結(jié)果

Table2ResultonmolecularvarianceanalysisonfourspeciesinActinidiaLindl.basedonISSRmarker

變異來源Sourceofvariation自由度Degreeoffreedom平方和Sumofsquare均方Meansquare方差Variance方差比例/%Percentageofvariance種間Interspecies3349.669116.55613.05640.84種內(nèi)Intraspecies28529.48718.91018.91059.16

2.2 UPGMA聚類分析

對32個獼猴桃樣本間的遺傳相似系數(shù)(GS)進行計算，結(jié)果表明：32個樣本間的GS值為0.565 0～0.965 0，平均值為0.716 4，變幅為0.400 0，說明供試的32個樣本間遺傳差異較大。其中，品種‘金魁’與其雄株的GS值最大(0.965 0)，親緣關(guān)系最近；而品種‘米良1號’與‘桓優(yōu)1號’、‘湘吉紅’與‘桓優(yōu)1號’、‘桓優(yōu)1號’與‘華特’雄株間的GS值均最小，僅為0.565 0，親緣關(guān)系最遠。

基于上述GS值對32個獼猴桃樣本進行UPGMA聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出：在GS值為0.76處，可將32個獼猴桃樣本分為4組。第Ⅰ組包括12個樣本，分別為品種‘徐香’、‘海艷’、‘米良1號’、‘中獼2號’、‘華特’、‘金魁’、‘金魁’雄株、‘皖翠’、‘海沃德’、‘布魯諾’、‘翠玉’和‘金碩’；第Ⅱ組包括10個樣本，分別為品種‘紅陽’、‘晚紅’、‘瓊漿’、‘黃陽’、‘早金’、‘黃陽’雄株、‘楚紅’、‘金艷’、‘豫皇1號’和‘湘吉紅’；第Ⅲ組僅包括 ‘華特’雄株1個樣本；第Ⅳ組包括9個樣本，分別為品種‘紅寶石星’、‘紅寶石星’雄株、‘軟紅’、‘紅貝’、‘紅貝’雄株、‘華紅2號’、‘魁綠’、‘華紅1號’和‘桓優(yōu)1號’。其中，第Ⅰ組的樣本除‘華特’和‘翠玉’外均屬于美味獼猴桃品種；第Ⅱ組的樣本均屬于中華獼猴桃品種；第Ⅲ組的樣本屬于毛花獼猴桃品種；第Ⅳ組的樣本均屬于軟棗獼猴桃品種，該聚類結(jié)果基本符合傳統(tǒng)分類結(jié)果。

對供試的32個獼猴桃樣本按照種類進行歸類，并計算4個獼猴桃種間的GS值和遺傳距離(GD)，結(jié)果見表3。由表3可以看出：4個獼猴桃種間的GS值為0.780 7～0.926 7，其中，中華獼猴桃與美味獼猴桃的GS值為0.926 7，親緣關(guān)系最近，與美味獼猴桃是中華獼猴桃的一個變種的分類地位一致；毛花獼猴桃與中華獼猴桃、美味獼猴桃和軟棗獼猴的GS值分別為0.895 1、0.895 4和0.780 7，相對于軟棗獼猴桃，毛花獼猴桃與中華獼猴桃和美味獼猴桃的親緣關(guān)系更近，與上述聚類結(jié)果基本一致。

1-3，5-11： 美味獼猴桃品種 Cultivars of Actinidia chinensis var. deliciosa (A. Chev.) A. Chev.； 4，12-21： 中華獼猴桃品種 Cultivars of A. chinensis Planch.； 22-30： 軟棗獼猴桃品種 Cultivars of A. arguta (Sieb. et Zucc.) Planch. ex Miq.； 31，32： 毛花獼猴桃品種 Cultivars of A. eriantha Benth. 1： ‘徐香’‘Xuxiang’； 2： ‘金魁’‘Jinkui’； 3： ‘金魁’(雄株)‘Jinkui’(male plant)； 4： ‘翠玉’‘Cuiyu’； 5： ‘皖翠’‘Wancui’； 6： ‘金碩’‘Jinshuo’； 7： ‘中獼2號’‘Zhongmi 2’； 8： ‘海艷’‘Haiyan’； 9： ‘米良1號’‘Miliang 1’； 10： ‘海沃德’‘Hayward’； 11： ‘布魯諾’‘Bruno’； 12： ‘紅陽’‘Hongyang’； 13： ‘黃陽’‘Huangyang’； 14： ‘黃陽’(雄株)‘Huangyang’(male plant)； 15： ‘晚紅’‘Wanhong’； 16： ‘楚紅’‘Chuhong’； 17： ‘早金’‘Hort16A’； 18： ‘金艷’‘Jinyan’； 19： ‘瓊漿’‘Qiongjiang’； 20： ‘豫皇1號’‘Yuhuang 1’； 21： ‘湘吉紅’‘Xiangjihong’； 22： ‘紅寶石星’‘Ruby star’； 23： ‘紅寶石星’(雄株)‘Ruby star’(male plant)； 24： ‘軟紅’‘Ruanhong’； 25： ‘紅貝’‘Hongbei’； 26： ‘紅貝’(雄株)‘Hongbei’(male plant)； 27： ‘華紅1號’‘Huahong 1’； 28： ‘華紅2號’‘Huahong 2’； 29： ‘魁綠’‘Kuilü’； 30： ‘桓優(yōu)1號’‘Huanyou 1’； 31： ‘華特’(雄株)‘Huate’(male plant)； 32： ‘華特’‘Huate’.圖2 基于ISSR標記分析結(jié)果的27個獼猴桃品種32個樣本的UPGMA聚類圖Fig. 2 UPGMA dendrogram of 32 samples of 27 cultivars of Actinidia spp. based on analysis result of ISSR marker

表3基于ISSR標記分析結(jié)果的4個獼猴桃種間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離1)

Table3GeneticsimilaritycoefficientandgeneticdistanceamongfourspeciesinActinidiaLindl.basedonanalysisresultofISSRmarker1)

種類2)Species2)各種間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離GeneticsimilaritycoefficientandgeneticdistanceamongdifferentspeciesACDACAAAEACD—0.92670.82140.8951AC0.0761—0.81090.8954AA0.19680.2096—0.7807AE0.11080.11050.2475—

1)遺傳相似系數(shù)和遺傳距離分別位于橫線上、下方 Genetic similarity coefficient and genetic distance are located above and under the line， respectively.

2)ACD： 美味獼猴桃Actinidiachinensisvar.deliciosa(A. Chev.) A. Chev.； AC： 中華獼猴桃A.chinensisPlanch.； AA： 軟棗獼猴桃A.arguta(Sieb. et Zucc.) Planch. ex Miq.； AE： 毛花獼猴桃A.erianthaBenth.

2.3 DNA指紋圖譜構(gòu)建

對前述10個ISSR引物的擴增結(jié)果進行分析和篩選，選取引物UBC818、UBC824、UBC854和UBC895的擴增位點中具有不同特異性的15個多態(tài)性位點，構(gòu)建了32個獼猴桃樣本的DNA指紋圖譜，結(jié)果見圖3。

由圖3可見：在引物UBC818擴增的5個多態(tài)性位點中，‘紅貝’、‘紅貝’雄株和‘華特’雄株3個樣本的位點具有特異性；在引物UBC824擴增的2個多態(tài)性位點中，僅‘華特’雄株的位點具有特異性；在引物UBC854擴增的5個多態(tài)性位點中，‘中獼2號’、‘海沃德’、‘布魯諾’和‘紅寶石星’雄株4個樣本的位點具有特異性；而在引物UBC895擴增的3個多態(tài)性位點中，32個樣本的位點均不具有特異性。對4個引物擴增的15個多態(tài)性位點進行綜合分析，供試的32個樣本均具有特異的位點圖譜，因此，根據(jù)引物UBC818、UBC824、UBC854和UBC895擴增的15個多態(tài)性位點構(gòu)建的DNA指紋圖譜可用于供試32個獼猴桃樣本的鑒定。

1-3，5-11： 美味獼猴桃品種 Cultivars of Actinidia chinensis var. deliciosa (A. Chev.) A. Chev.； 4，12-21： 中華獼猴桃品種 Cultivars of A. chinensis Planch.； 22-30： 軟棗獼猴桃品種 Cultivars of A. arguta (Sieb. et Zucc.) Planch. ex Miq.； 31，32： 毛花獼猴桃品種 Cultivars of A. eriantha Benth. 1： ‘徐香’‘Xuxiang’； 2： ‘金魁’‘Jinkui’； 3： ‘金魁’(雄株)‘Jinkui’(male plant)； 4： ‘翠玉’‘Cuiyu’； 5： ‘皖翠’‘Wancui’； 6： ‘金碩’‘Jinshuo’； 7： ‘中獼2號’‘Zhongmi 2’； 8： ‘海艷’‘Haiyan’； 9： ‘米良1號’‘Miliang 1’； 10： ‘海沃德’‘Hayward’； 11： ‘布魯諾’‘Bruno’； 12： ‘紅陽’‘Hongyang’； 13： ‘黃陽’‘Huangyang’； 14： ‘黃陽’(雄株)‘Huangyang’(male plant)； 15： ‘晚紅’‘Wanhong’； 16： ‘楚紅’‘Chuhong’； 17： ‘早金’‘Hort16A’； 18： ‘金艷’‘Jinyan’； 19： ‘瓊漿’‘Qiongjiang’； 20： ‘豫皇1號’‘Yuhuang 1’； 21： ‘湘吉紅’‘Xiangjihong’； 22： ‘紅寶石星’‘Ruby star’； 23： ‘紅寶石星’(雄株)‘Ruby star’(male plant)； 24： ‘軟紅’‘Ruanhong’； 25： ‘紅貝’‘Hongbei’； 26： ‘紅貝’(雄株)‘Hongbei’(male plant)； 27： ‘華紅1號’‘Huahong 1’； 28： ‘華紅2號’‘Huahong 2’； 29： ‘魁綠’‘Kuilü’； 30： ‘桓優(yōu)1號’‘Huanyou 1’； 31： ‘華特’(雄株)‘Huate’(male plant)； 32： ‘華特’‘Huate’.圖3 基于4個ISSR引物(UBC818、UBC824、UBC854和UBC895)擴增結(jié)果的27個獼猴桃品種32個樣本的DNA指紋圖譜Fig. 3 DNA fingerprinting of 32 samples of 27 cultivars of Actinidia spp.based on amplification result by four ISSR primers (UBC818， UBC824， UBC854 and UBC895)

3 討論和結(jié)論

ISSR標記具有良好的穩(wěn)定性和較高的多態(tài)性，已經(jīng)成為研究植物遺傳多樣性的主流技術(shù)之一，應(yīng)用范圍較廣[15]。本研究中，利用ISSR標記分析了32個獼猴桃樣本的遺傳多樣性，結(jié)果顯示：篩選出的10個引物共擴增出200個條帶(位點)，其中，多態(tài)性位點有195個，多態(tài)性位點百分率(PPL)達97.50%，高于鄒游等[10]和劉娟等[11]對獼猴桃的同類研究結(jié)果，也高于采用其他分子標記對獼猴桃的相關(guān)研究結(jié)果[16-18]，這種現(xiàn)象與不同研究者采用的ISSR引物以及供試樣本的品種甚至植株生長狀況等方面的差異有關(guān)。

多態(tài)性信息含量(PIC)也是衡量引物多態(tài)性信息含量水平(高：PIC>0.50；適中：0.25

從GS值以及聚類分析結(jié)果看，基于ISSR標記結(jié)果獲得的GS值以及聚類分析結(jié)果基本可以將供試的32個獼猴桃樣本按照親本來源進行歸類，而中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴和毛花獼猴桃4個種間的GS值也顯示其親緣關(guān)系符合傳統(tǒng)分類，說明ISSR標記可用于獼猴桃品種的遺傳關(guān)系研究。但基于ISSR標記的聚類結(jié)果與供試獼猴桃品種親本的傳統(tǒng)分類歸屬也略有差異，例如，‘翠玉’為中華獼猴桃品種，但卻與美味獼猴桃的品種聚在同一組中，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與中華獼猴桃和美味獼猴桃的親緣關(guān)系的復(fù)雜性有關(guān)。美味獼猴桃曾作為中華獼猴桃的硬毛品種，兩者具有較高的遺傳相似性[20-21]，有學(xué)者建議將兩者歸并為一個種[17]，而且在《Flora of China》[22]中已對此進行了分類處理，將美味獼猴桃處理為中華獼猴桃的一個變種，說明二者的親緣關(guān)系很近。另外，毛花獼猴桃品種‘華特’與其雄株并未聚在一起，‘華特’與美味獼猴桃的品種聚在同一組，而其雄株單獨成組，品種‘華特’與其雄株均為野生選種，不屬于一個姊妹系，兩者未能聚在一起可能與此有關(guān)，也可能與ISSR標記本身的局限性有關(guān)，需要結(jié)合形態(tài)學(xué)以及其他分子標記技術(shù)進行深入研究。另外，從品種的育種親本來源看，供試的美味獼猴桃品種中，品種‘中獼2號’的母本為品種‘米良1號’[23]，因此，二者聚在一起；品種‘皖翠’是品種‘海沃德’的自然芽變品種[24]，而品種‘布魯諾’與‘海沃德’均源自1904年新西蘭從湖北宜昌引進的同一批種子[25]，這3個品種也聚在一起，體現(xiàn)出部分供試樣本來源地域一致性的特征。由聚類分析結(jié)果還可見：美味獼猴桃品種‘金魁’與其雄株、軟棗獼猴桃品種‘紅貝’與其雄株均首先聚在一起，而軟棗獼猴桃品種‘紅寶石星’與其雄株也表現(xiàn)出很近的親緣關(guān)系，與龔俊杰[26]的研究結(jié)果類似。

依據(jù)形態(tài)學(xué)特征的品種鑒定很難區(qū)分表型極為相似的品種。DNA分子標記具有不受環(huán)境因子和時空條件影響且高效、快捷等優(yōu)點，可直接反映品種間的遺傳差異，已成為品種鑒定的有效方法之一。ISSR標記在植物品種鑒定和DNA指紋圖譜構(gòu)建方面都有成功應(yīng)用，如：鄭宇等[27]利用6個ISSR標記產(chǎn)生的8個多態(tài)性位點繪制了ISSR指紋圖譜，可準確區(qū)分比利時杜鵑(RhododendronhybridumHort.)的11個栽培品種(系)；索志立等[28]利用4個ISSR引物構(gòu)建了紫斑牡丹〔Paeoniarockii(S. G. Haw et Lauener) T. Hong et J. J. Li〕與牡丹(P.suffruticosaAndrews)種間雜交后代及其親本的DNA指紋圖譜，從而在DNA分子水平上推測了紫斑牡丹的品種起源，且與早期的形態(tài)學(xué)觀測結(jié)果相印證；張林等[14]利用2個ISSR引物構(gòu)建了DNA指紋圖譜，能夠準確鑒定62個朱頂紅〔Hippeastrumrutilum(Ker-Gawl.) Herb.〕品種。本研究選用4個ISSR引物的15個多態(tài)性位點構(gòu)建了32個獼猴桃樣本的DNA指紋圖譜，每個樣本均具有各自特異的組合位點，可作為獼猴桃品種間分類和鑒定的依據(jù)。

綜上所述， 供試的32個獼猴桃樣本間均具有較豐富的遺傳多樣性，其遺傳關(guān)系基本符合傳統(tǒng)分類結(jié)果，部分品種還體現(xiàn)出一定的來源地域一致性的特征；而利用4個ISSR引物擴增的15個多態(tài)性位點構(gòu)建的DNA指紋圖譜可準確區(qū)分供試的獼猴桃樣本。

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(責(zé)任編輯： 郭嚴冬)

GeneticdiversityanalysisandfingerprintingconstructionofcultivarsofActinidiaspp.basedonISSRmarker

ZHANG Anshi1，①， HAN Chenpeng2， QI Xiujuan3， ZHANG Zhonghai1

(1. School of Science， Jiaozuo Teachers College， Jiaozuo 454000， China； 2. Zhengzhou Green Museum Administrative Center， Zhengzhou 450000， China； 3. Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， China)，J.PlantResour. &Environ.， 2017，26(3)： 19-26

S663.4； Q946-33

A

1674-7895(2017)03-0019-08

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.03.03

2016-12-22

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程專項(CAAS-ASTIP-2015-ZFRI)

張安世(1965—)，男，河南博愛人，碩士，教授，主要從事植物分子生物學(xué)方面的研究。

①通信作者E-mail： aszhang1212@163.com