低氧對(duì)大鼠血清bFGF、 VEGF的表達(dá)和肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的影響 #

李小靜，劉川川，劉輝琦，劉 杰，曹學(xué)鋒，吳 穹，王生蘭*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院；青海 西寧 810001)

低氧對(duì)大鼠血清bFGF、 VEGF的表達(dá)和肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的影響#

李小靜1，劉川川2，劉輝琦1，劉 杰1，曹學(xué)鋒1，吳 穹1，王生蘭1*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院；青海 西寧 810001)

目的通過(guò)研究低氧對(duì)大鼠血清bFGF、VEGF的表達(dá)和肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的影響，來(lái)初步揭示肺動(dòng)脈高壓的形成機(jī)制。方法取30只健康雄性SD大鼠，將其隨機(jī)分成六組：對(duì)照組、低氧1天組、低氧7天組、低氧14天組、低氧21天組和低氧30天組。除對(duì)照組外，其余五組大鼠分別放在低壓氧艙(模擬海拔5000米)1、7、14、21、30天。取各組大鼠血清及肺動(dòng)脈，運(yùn)用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中bFGF、VEGF的表達(dá)量，通過(guò)透射電鏡觀察肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果與對(duì)照組相比，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠血清bFGF的表達(dá)量逐漸升高，變化具有顯著性差異(P<0.05)；急性低氧時(shí)(低氧1天)，血清VEGF含量較對(duì)照組明顯升高，變化具有顯著性差異(P<0.05)，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)(低氧7、14、21、30天)，血清VEGF含量較對(duì)照組呈逐漸下降趨勢(shì)。電鏡結(jié)果顯示，低氧可導(dǎo)致肺動(dòng)脈有不同程度的損傷，主要表現(xiàn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞核染色質(zhì)聚集、空泡化，甚至內(nèi)皮細(xì)胞脫落；平滑肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)核染色質(zhì)聚集或邊集，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，線(xiàn)粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。結(jié)論低氧環(huán)境中，bFGF的表達(dá)明顯升高，VEGF的表達(dá)在急性缺氧時(shí)明顯升高隨后有下降趨勢(shì)，表明bFGF參與低氧性病理生理改變的形成，VEGF變化與急性缺氧有關(guān)，低氧可導(dǎo)致肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變。

bFGF VEGF 低氧 透射電鏡

高原特殊的高海拔地理特征造成了天然的低氧環(huán)境特點(diǎn)。氧分壓隨著海拔高度的升高逐漸降低，引起機(jī)體組織受損，嚴(yán)重時(shí)可引起高原特發(fā)性疾病的產(chǎn)生。急性低氧可造成高原性腦水腫和肺水腫的發(fā)生發(fā)展，長(zhǎng)期慢性低氧能導(dǎo)致高原性心臟病和高原紅細(xì)胞增多癥的發(fā)生。

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension，PH)的主要病理生理變化是肺血管結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，此變化與PASMC的異常增殖密切相關(guān)。WHO定義PH的診斷標(biāo)準(zhǔn)：在海平面靜息狀態(tài)下，肺動(dòng)脈平均壓(MPAP)大于25 mmHg，在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下大于30 mmHg。低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是肺動(dòng)脈高壓疾病中最為多見(jiàn)的一種類(lèi)型，是臨床心肺疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的病理環(huán)節(jié)。HPH指正常人移居高原環(huán)境后，低氧致肺小動(dòng)脈功能改變或器質(zhì)性變化，從而引起肺動(dòng)脈壓力增高。有研究表明，HPH 的形成機(jī)制涉及多個(gè)方面，如細(xì)胞或離子通道機(jī)制，血管活性物質(zhì)失衡或血管反應(yīng)性機(jī)制等。近年來(lái)又有學(xué)者證明低氧可使PASMC發(fā)生增殖、遷移，從而使肺血管壁增厚，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)，最終發(fā)展為PH[1-4]。另有研究表明，PH的形成可能和相關(guān)細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的作用有關(guān)。本研究通過(guò)探討低氧對(duì)大鼠血清bFGF、VEGF表達(dá)的影響，以及通過(guò)觀察肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的變化來(lái)初步揭示PH的形成機(jī)制，為高原性心血管疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器選擇

大鼠VEGF、bFGF ELISA試劑盒購(gòu)自CUSABIO生物科技有限公司；日立H-600IV型透射電鏡購(gòu)自日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康雄性SD大鼠48只購(gòu)于甘肅中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001)。將大鼠隨機(jī)分成六組，每組8只，分別為對(duì)照組、低氧1天組、低氧7天組、低氧14天組、低氧21天組和低氧30天組。對(duì)照組：飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室(西寧，海拔2260m)；低氧組分成五組，每組8只，分別為低氧1天組、低氧7天組、低氧14 天組、低氧21天組和低氧30天組，每組低氧動(dòng)物分別置于低壓氧艙(模擬海拔5000米)中1、7 、14 、21 、30天，每天給予低壓低氧處理20 小時(shí)。

1.3 血清bFGF、VEGF含量檢測(cè)

用ELISA法檢測(cè)血清bFGF、VEGF含量：從大鼠腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置2小時(shí)，離心(1000r/m)20分鐘，取上層血清分裝(200μL)，置-20 ℃冰箱保存。按照大鼠VEGF、bFGF ELISA試劑盒操作說(shuō)明步驟執(zhí)行。在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。計(jì)算樣品含量的平均值。

1.4 肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)觀察

用透射電鏡觀察肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)：將SD大鼠麻醉，剖開(kāi)，取出新鮮肺組織，切成小塊(1mm×1mm×1mm)立即投入3%戊二醛固定液中進(jìn)行預(yù)固定(24小時(shí)，4℃)，用磷酸緩沖液(pH 7.4，0.2mol/L)洗滌3次，每次15分鐘，再放入1%四氧化鋨中再固定(2小時(shí))，用磷酸緩沖液(pH 7.4，0.2mol/L)再次清洗3次，每次15分鐘，分別經(jīng)50%、70%、90%丙酮脫水15分鐘、100%丙酮脫水20分鐘，用環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑包埋，制作超薄、半薄切片，行鈾-鉛雙染色，通過(guò)透射電鏡觀察肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件作統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05 。

2 結(jié)果

2.1 不同低氧組SD大鼠血清bFGF、VEGF含量的變化

與對(duì)照組相比，隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)(低氧1、7、14、21、30天)，大鼠血清bFGF的表達(dá)量呈逐漸升高趨勢(shì)，差異有顯著性(P<0.05)；急性低氧時(shí)(低氧1天)，血清VEGF表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)，隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)(低氧7、14、21、30天)，血清VEGF表達(dá)量較對(duì)照組呈逐漸下降趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表1。

Table 1 Changes of serum bFGF and VEGF in SD rats with different hypoxia groups(±s)

a：與對(duì)照組比較變化有顯著性(P<0.05)，b：與低氧1天組比較變化有顯著性(P<0.05)，c：與低氧7天組比較變化有顯著性(P<0.05)，d：與低氧14天組比較變化有顯著性(P<0.05)，e：與低氧21天組比較變化有顯著性(P<0.05).

2.2 不同低壓低氧組SD大鼠肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的變化

透射電鏡可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞有核染色質(zhì)聚集或邊集，出現(xiàn)空泡甚至脫落，線(xiàn)粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張(圖1)。表明低氧可導(dǎo)致不同程度的肺動(dòng)脈損傷。

N為對(duì)照組，A為低壓低氧1天組，B為低壓低氧7天組，C為低壓低氧14天組，D為低壓低氧21組， E為低壓低氧30天組

圖1不同低壓低氧組SD大鼠肺動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的變化圖
Figure1TheultrastructuralchangesofpulmonaryarteriesinSDratswithdifferenthypobaricandhypoxiccondition

3 討論

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，又稱(chēng)血管通透性因子，是涉及血管生成的重要信號(hào)蛋白，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生。VEGF生物學(xué)功能為通過(guò)旁分泌方式作用于肺小動(dòng)脈內(nèi)膜，引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大、增殖，誘導(dǎo)血管生成因子產(chǎn)生，從而引起血管內(nèi)膜增厚、新生血管形成、肺血管發(fā)生重構(gòu)。隨著病情的發(fā)生發(fā)展，血管中膜和內(nèi)膜增厚、彈性下降，肺細(xì)小動(dòng)脈肌化，使血管狹窄甚至閉塞，最終導(dǎo)致HPH的形成[5]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF 在急性低氧早期(低氧1天)的表達(dá)水平顯著升高，但隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降。其原因可能是VEGF 在急性低氧早期的表達(dá)水平顯著升高，但隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)達(dá)到習(xí)服后逐漸下降至正常水平[6]。而急性缺氧時(shí)VEGF異常升高使血管通透性增加，導(dǎo)致大量血漿蛋白漏出血管外，超出機(jī)體的代償能力，引起肺水腫[7]。VEGF逐漸升高可誘發(fā)新生血管形成而不會(huì)引起肺水腫，有利于提高機(jī)體對(duì)高原缺氧的適應(yīng)能力。

常氧時(shí)VEGF表達(dá)量甚微，起到維持血管密度平衡的作用，而缺氧時(shí)VEGF表達(dá)量會(huì)明顯升高。多數(shù)文獻(xiàn)證明低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)對(duì)參與肺動(dòng)脈高壓的調(diào)控起到重要作用。HIF-1為氧平衡的重要調(diào)控介質(zhì)，由α亞基和β亞基構(gòu)成，HIF-1α亞基是關(guān)鍵的氧調(diào)節(jié)元件，其蛋白穩(wěn)定性受細(xì)胞內(nèi)氧濃度的影響，決定HIF-1的活性，HIF-1β不是氧調(diào)節(jié)元件，但只有HIF-1β亞基和HIF-1α亞基聚合后才能發(fā)揮HIF-1α的氧調(diào)節(jié)作用。常氧狀態(tài)時(shí)，HIF-1α被蛋白水解酶迅速降解，因此在細(xì)胞中基本檢測(cè)不到HIF-1α亞基的表達(dá)；低氧狀態(tài)時(shí)，HIF-1α蛋白降解系統(tǒng)被抑制，HIF-1α轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β亞基結(jié)合形成HIF-1[8，9]，與VEGF基因(HIF-1α的下游靶基因)的缺氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合，使VEGF表達(dá)量增加[10]。在缺氧程度加重并持續(xù)進(jìn)行時(shí)，HIF-1α亞基可與p53基因結(jié)合，使后者穩(wěn)定性增強(qiáng)[11]，p53促進(jìn)了泛素蛋白水解酶系統(tǒng)對(duì)HIF-1α的降解，造成了后者量的減少，從而減少了HIF-1α與VEGF基因的HRE結(jié)合，使VEGF下降。

大量文獻(xiàn)認(rèn)為bFGF參與了低氧性肺血管的重構(gòu)過(guò)程，從而導(dǎo)致HPH的發(fā)生發(fā)展。因此，本實(shí)驗(yàn)探討了低氧對(duì)大鼠血清bFGF表達(dá)的影響。bFGF是FGF超家族成員，是由154個(gè)氨基酸組成的多肽，存在于多種細(xì)胞和組織中，可由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌，既是生長(zhǎng)因子，也是絲裂原，最主要的生物學(xué)功能是通過(guò)細(xì)胞表面的受體刺激多種細(xì)胞分裂和增殖，具有極強(qiáng)的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和平滑肌細(xì)胞的增殖作用，參與了新生血管的形成和內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)[12]。張嫚[13]在研究中證明了正常情況下血清中存在低水平的bFGF，而在低氧時(shí)，肺血管內(nèi)皮受損，破壞了細(xì)胞的完整性，進(jìn)而釋放出bFGF。蔣凌志等[14]通過(guò)研究證明，在低氧介導(dǎo)的培養(yǎng)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞形成毛細(xì)血管過(guò)程中，可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分泌bFGF，低氧時(shí)肺組織bFGF及其受體充分表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠血清bFGF的表達(dá)量隨低氧時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)，與大多數(shù)文獻(xiàn)結(jié)果一致。楊生岳[15]等研究表明，其機(jī)制可能是長(zhǎng)期的進(jìn)行性低氧血癥，引起血清bFGF水平和MPAP逐漸增高。致慢性肺心病形成。低氧通過(guò)促進(jìn)肺血管壁bFGF mRNA表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)bFGF的表達(dá)增加。另外，低氧也可通過(guò)增加硫酸肝素結(jié)合部位，易化bFGF與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，并通過(guò)依賴(lài)HIF-1α過(guò)程上調(diào)硫酸肝素的結(jié)合，使內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)bFGF反應(yīng)增強(qiáng)；bFGF可刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子合成分泌，促進(jìn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，造成肺血管結(jié)構(gòu)重建 ，導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力持續(xù)升高并出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的損害，最終導(dǎo)致HPH的形成。由此可以認(rèn)為 ，HPH的形成與低氧所致bFGF的表達(dá)增加密切相關(guān)。

肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)在參與HPH的形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)透視電鏡圖顯示，低氧導(dǎo)致PAEC和PASMC核染色質(zhì)聚集，出現(xiàn)空泡、脫落，線(xiàn)粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低氧導(dǎo)致了肺動(dòng)脈不同程度的損傷。低氧損傷后，血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞皺縮，線(xiàn)粒體腫脹破裂，細(xì)胞凋亡增加[16]，且低氧對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成的損傷還包括存活率的降低和通透性增高、質(zhì)膜小泡增多等[17]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。陳靈紅[18]認(rèn)為低氧下?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量不足引起溶酶體內(nèi)的一些貯存物質(zhì)消耗、降解，可能是脂質(zhì)體和空泡增加的原因。

Tjen-A-Looi S[19]認(rèn)為，低氧可引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞異常肥大、增殖加速和凋亡異常，使肺血管內(nèi)皮細(xì)胞密度增大，導(dǎo)致肺動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，使肺動(dòng)脈管腔狹窄。另有研究表明，低氧使血管調(diào)節(jié)因子和血管活性物質(zhì)的合成和分泌失衡，導(dǎo)致血管滲透壓升高、抗氧化能力降低等多種低氧性疾病和損傷的發(fā)生發(fā)展[20-21]。Wright JL[22]也認(rèn)為，低氧使PAEC分泌功能失調(diào)、舒血管活性物質(zhì)下降、縮血管活性物質(zhì)異常增多，致低氧性肺血管收縮，使肺血管壁細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建，最終產(chǎn)生HPH。因?yàn)榉蝿?dòng)脈大血管中動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞的連接是通過(guò)復(fù)雜的黏附結(jié)構(gòu)(如縫隙連接蛋白)組成，細(xì)胞間連接較緊密，缺氧時(shí)縫隙連接蛋白重新分布，從而增加了肺血管的通透性[23，24]，其抗氧化能力降低，導(dǎo)致肺血管內(nèi)膜損傷，產(chǎn)生增殖作用，嚴(yán)重者致血管內(nèi)液滲出、肺血管結(jié)構(gòu)重建等，最終引發(fā)HPH。

有研究表明，PASMC的增殖和凋亡的相對(duì)比值是引起肺血管結(jié)構(gòu)重塑的關(guān)鍵。低氧狀態(tài)時(shí)，PASMC從高分化的收縮型轉(zhuǎn)換為未分化的合成型[25]，遷移至肺血管內(nèi)膜，分泌增殖大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致HPAH的肺血管重塑。大量文獻(xiàn)表明，PASMC的增殖在肺血管重建過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，其機(jī)制與多種信號(hào)通路的傳導(dǎo)有關(guān)，如RhOA/ROCK信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)低壓氧艙模擬海拔5 000米的高原低氧環(huán)境，研究高原低氧對(duì)大鼠血清bFGF、VEGF的表達(dá)量影響，及通過(guò)透視電鏡觀察肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的變化，初步揭示了肺動(dòng)脈高壓形成的可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓形成機(jī)制復(fù)雜，可能有較多的相關(guān)因素同時(shí)參與，需進(jìn)行更加系統(tǒng)深入的研究。

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EffectofhypoxiaontheexpressionofbFGF，VEGFandtheultrastructuralchangesofpulmonaryarteryinrats#

LI Xiao-jing，LIU Chuan-chuan，LIU Hui-qi，LIU Jie，CAO Xue-feng，WU Qiong，WANG Sheng-lan1*

(1.Department of Pathophysiology，Qinghai University Medical College； 2.Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining，Qinghai，810001，China)

ObjectiveTo investigate the effects of hypoxia on the expression of bFGF，VEGF and the structure of pulmonary artery in rats，and to reveal the mechanism of pulmonary hypertension.MethodsThirty healthy male SD rats were randomly divided into 6 groups：Control group，hypoxia 1 day group，hypoxia 7 day group，hypoxia 14 day group，hypoxia 21 day group and hypoxia 30 day group.In addition to Control group，the other five groups were placed in simulated hypoxic chamber of 5 000 meters above sea level for 1，7，14，21 and 30 days，respectively，and the serum and pulmonary arteries of each group were taken.The expressions of bFGF and VEGF in serum were detected by ELISA，and ultrastructural changes of pulmonary arteries were observed by transmission electron microscope.ResultsCompared with the control group，the expression of bFGF in serum increased gradually with the prolongation of hypoxia time(P<0.05)，the expression of VEGF in acute hypoxia group was significantly higher than that in control group(P<0.05)，with the prolongation of hypoxia time(7，14，21，30 days)，serum VEGF levels were decreased compared with the control group.Electron microscopic results showed that hypoxia can lead different degrees of pulmonary artery damage，mainly for the endothelial cell nuclear chromatin aggregation，endothelial cell vacuoles，endothelial cell shedding.Smooth muscle cells，nuclear chromatin aggregation or edge set，cytoplasmic vacuoles，mitochondrial swelling，rough endoplasmic reticulum expansion，etc.ConclusionIn hypoxia environment，the expression of bFGF is increased，the expression of VEGF is increased in acute hypoxia and then decreased，the results show that bFGF is involved in the formation of hypoxic pathophysiological changes.The changes of VEGF are related to the regulation of acute hypoxia. Hypoxia can lead to the structural changes of pulmonary artery endothelial cells and smooth muscle cells.

bFGF VEGF Hypoxia Transmission electron microscopy

R363

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.03.004

2017-5-8

#：國(guó)家自然科學(xué)基金(81160031)；*：通信作者，碩士，教授，E-mail：zlw6996@163.com 李小靜(1991～)，女，漢族，湖北籍，在讀碩士研究生