基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜法檢測(cè)空腸彎曲菌及李斯特菌

屠博文，吉俊敏，杜 強(qiáng)，黎俊宏，唐宏兵，熊吉濱，韓曉冬

基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜法檢測(cè)空腸彎曲菌及李斯特菌

屠博文1，吉俊敏1，杜 強(qiáng)1，黎俊宏1，唐宏兵1，熊吉濱2，韓曉冬3

（1.常州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 常州 213022；2.泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心，江蘇 泰州 225300；3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210093）

目的：通過(guò)VITEK MS微生物檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)及市售活雞來(lái)源的空腸彎曲菌和單核細(xì)胞性李斯特菌進(jìn)行激光解析飛行質(zhì)譜鑒定，建立兩種致病菌的質(zhì)譜鑒定方法。方法：從樣品中分離獲得疑似的空腸彎曲菌和單核細(xì)胞性李斯特菌，經(jīng)不同配比的基質(zhì)液處理后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。通過(guò)分析檢出菌特征峰及相對(duì)豐度差異來(lái)評(píng)價(jià)不同配比基質(zhì)液對(duì)兩種致病菌檢測(cè)的影響。結(jié)果：空腸彎曲菌和李斯特菌對(duì)基質(zhì)液配比要求具有明顯差異，前者不需要經(jīng)過(guò)甲酸裂解，而對(duì)三氟乙酸含量敏感，后者鑒定結(jié)果受到甲酸裂解制約。基質(zhì)液含水量控制在體積分?jǐn)?shù)30%可以有效避免特征峰缺失并提高檢出率。結(jié)論：控制基質(zhì)液的含水量、基質(zhì)濃度和三氟乙酸含量可以增加空腸彎曲菌和李斯特菌的特征峰數(shù)量，增強(qiáng)相對(duì)豐度，提高致病菌檢出率?；|(zhì)液配比優(yōu)化研究有助于增強(qiáng)食源性致病菌快速鑒定能力，有助于提高疾病預(yù)防和食源性風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的時(shí)效性。

VITEK MS微生物檢測(cè)系統(tǒng)；空腸彎曲菌；單核細(xì)胞性李斯特菌；基質(zhì)液配比；微生物質(zhì)譜檢測(cè)方法

隨著食源性監(jiān)測(cè)工作的全覆蓋，從食品中檢出的致病菌種類(lèi)和數(shù)量增加，快速檢測(cè)技術(shù)運(yùn) 用于食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作成為食源性監(jiān)測(cè)的亮點(diǎn)?；|(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)是微生物快速檢測(cè)技術(shù)的新成員，越來(lái)越多的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)使得質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)更加準(zhǔn)確和可靠[1-2]，核糖體蛋白是MALDI-TOF-MS的主要分子標(biāo)志物[3-4]，此外酶、外膜蛋白及毒性蛋白等構(gòu)成了物種水平特征峰標(biāo)志物[5]。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證明微生物質(zhì)譜檢測(cè)的種水平識(shí)別能力在80%～100%[6-7]。

空腸彎曲菌是一種的重要食源性人獸共患病原菌[8-9]，很多動(dòng)物可正常攜帶彎曲菌，通過(guò)食物鏈傳遞給人而致病。大量研究表明家禽是該菌重要的傳染源，禽肉食用與空腸彎曲菌的傳播緊密相關(guān)[10]。空腸彎曲菌感染后能夠引起急性腸炎、格林巴利綜合癥、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等多種疾病[11]。由于生物量少、培養(yǎng)條件苛刻、暴露在高氧環(huán)境后極易死亡，空腸彎曲菌在日常食源性風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作中極難檢出?？漳c彎曲菌在體外極易進(jìn)入休眠態(tài)，需要通過(guò)活化培養(yǎng)方能檢出?？漳c彎曲菌的食源性檢測(cè)是食源性風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作中的難點(diǎn)。李斯特菌也是一種重要的人畜共患病原菌，低溫環(huán)境下仍極易污染食品，引起急性腹瀉、發(fā)熱、腦膜炎、敗血癥等疾病，死亡率極高[12]。由于單核細(xì)胞性李斯特菌是引起人李斯特菌病的元兇，在食品檢測(cè)過(guò)程中尤為受到關(guān)注。

目前，以上兩種致病菌臨床鑒定主要通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法和PCR法檢測(cè)，使用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的案例在國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)[13-14]。VITEK MS微生物鑒定的準(zhǔn)確性和檢測(cè)容量取決于質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中該種微生物圖譜的完整性和兼容性[15-16]。分析并補(bǔ)充難培養(yǎng)和難檢測(cè)致病菌的圖譜數(shù)據(jù)有助于提高該種微生物的快速檢測(cè)效率。VITEK MS是一種全自動(dòng)微生物快速鑒定系統(tǒng)，微生物檢出質(zhì)量與菌種類(lèi)別、培養(yǎng)條件、基質(zhì)液配比及蛋白結(jié)晶化操作流程都有很大的關(guān)系。本研究對(duì)不同配方基質(zhì)液作用下的空腸彎曲菌和李斯特菌進(jìn)行MALDI-TOF-MS峰值分析，對(duì)比各自的質(zhì)譜峰形差異，一方面以此尋找關(guān)鍵的生物標(biāo)識(shí)峰，另一方面確定兩種微生物最適的基質(zhì)液配比。研究不同配比基質(zhì)液對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的影響，有助于完善基于VITEK MS系統(tǒng)的食源性致病菌快速檢測(cè)方法，提高檢出效率并有效完成食源性致病菌快速檢測(cè)任務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據(jù)《中國(guó)人民共和國(guó)食品安全法》及《食品微生物及其致病因子監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》的要求，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)及市售活雞進(jìn)行致病菌檢測(cè)；標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌ATCC8739美國(guó)ATCC菌種保藏中心。

甲酸（批號(hào)：251364）、乙腈（批號(hào)：271004）、乙醇（批號(hào)：1012768）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，批號(hào)：1C41k054） 美國(guó)Sigma公司；α-氰-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，α-CHCA，批號(hào)：16553） 法國(guó)生物梅里埃公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（批號(hào)：150422） 科瑪嘉生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VITEK MS MALDI-TOF質(zhì)譜儀、WGZ-200麥?zhǔn)蠞岫葍x 法國(guó)生物梅里埃公司；GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)及樣品制備

表1 不同實(shí)驗(yàn)組的質(zhì)譜基質(zhì)液配比Table 1 Composition of matrix solutions for mass spectrometry

按照GB/T 4789.9—2014《食品微生物檢驗(yàn) 空腸彎曲菌檢驗(yàn)》方法分離純化獲得的空腸彎曲菌，接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂，42 ℃培養(yǎng)48 h。按照GB/T 4789.30—2016《食品微生物檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》的方法分離純化獲得單核細(xì)胞性李斯特菌，接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂，30 ℃培養(yǎng)24 h，各自獲得對(duì)應(yīng)的菌落以便進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。挑取兩種菌株單個(gè)純菌落，按照表1分組用0.85%生理鹽水稀釋成菌懸液，配成麥?zhǔn)蠞岫?.0～3.5的菌懸液。吸取5.0 μL的菌懸液滴加至質(zhì)譜靶板對(duì)應(yīng)孔中，常溫干燥5 min。按照表1所示配方在C3、C4、L3和L4組樣品孔中滴加1.0 μL的甲酸溶液處理干燥10 min，隨后加入不同配比的基質(zhì)液，干燥10 min待測(cè)。

1.3.2 VITEK MS鑒定

參數(shù)調(diào)整：激光強(qiáng)度47 Hz，每孔采樣率100 次，分子質(zhì)量范圍2 000～20 000 D，有效檢測(cè)范圍3 000～16 000 D，峰值調(diào)整模式為線性。

質(zhì)控校準(zhǔn)：選取大腸桿菌ATCC8739作為質(zhì)控菌。采用RUO軟件對(duì)采集的樣品圖譜進(jìn)行比對(duì)分析，與Myla肽指紋數(shù)據(jù)庫(kù)中的對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株的超級(jí)圖譜和參考圖譜進(jìn)行多重比對(duì)，以檢出率表示為鑒定結(jié)果。指紋圖譜對(duì)比分析調(diào)用Myla數(shù)據(jù)庫(kù)中的超級(jí)圖譜和參考圖譜與樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組樣品菌進(jìn)行3 次重復(fù)鑒定，將每組質(zhì)譜峰圖荷質(zhì)比及相對(duì)豐度分別統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算同一個(gè)荷質(zhì)比的平均豐度值及方差，通過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（14.0）計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組之間的相似性，統(tǒng)計(jì)特征峰和缺失峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜分析結(jié)果

VITEK MS中以檢出率為檢測(cè)結(jié)果可靠性的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。其中低于80.00%的認(rèn)為檢出結(jié)果較不可靠，80.00%～90.00%為檢出結(jié)果較可靠，有待進(jìn)一步判別，高于90.00%表示檢測(cè)結(jié)果可靠，高于99.00%則表示檢測(cè)結(jié)果極可靠。

通過(guò)不同配比的基質(zhì)液處理待測(cè)菌，其質(zhì)譜檢出率存在差異（表2）。檢出結(jié)果及檢出率可見(jiàn)，革蘭氏陰性菌空腸彎曲菌質(zhì)譜鑒定結(jié)果受到基質(zhì)液配比差異的影響較小，其中L1～L4組的乙醇、水及乙腈比例與空腸彎曲菌的檢出率和結(jié)果沒(méi)有明顯關(guān)聯(lián)，但C1、C2和C3組的TFA體積分?jǐn)?shù)則與檢出率呈現(xiàn)正相關(guān)，TFA體積分?jǐn)?shù)不小于0.5%時(shí)，檢出率達(dá)到99.99%。

表2 不同配比的基質(zhì)液處理后鑒定結(jié)果及檢出率差異Table 2 Results of bacterial identifi cation and detections rates with different matrix solutions

而革蘭氏陽(yáng)性菌李斯特菌的檢測(cè)則受到較大的影響。首先，甲酸處理與否直接影響檢出結(jié)果和檢出率，未處理導(dǎo)致只能檢出為李斯特菌屬而無(wú)法鑒定到種水平。L3和L4組結(jié)果可見(jiàn)，基質(zhì)液含水可以顯著提高檢出率。檢測(cè)結(jié)果顯示其中C3及L4組的檢出率均大于99%，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果極可靠。

2.2 肽質(zhì)量圖譜分析結(jié)果

經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定得到空腸彎曲菌（圖1）和單核細(xì)胞性李斯特菌的質(zhì)量圖譜（圖2）。將所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)中的特征峰峰值（m/z）及相對(duì)豐度值（峰高）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同峰值的豐度值進(jìn)行計(jì)算，得到不同基質(zhì)液配比作用下特征峰及相對(duì)豐度值的質(zhì)譜峰圖譜。

圖1 空腸彎曲菌經(jīng)不同配比基質(zhì)液處理后的質(zhì)譜圖譜Fig. 1 Mass spectra for Campylobacter jejuni with different matrix solutions

圖2 單核細(xì)胞性李斯特菌經(jīng)不同配比基質(zhì)液處理后的質(zhì)譜圖譜Fig. 2 Mass spectra for Listeria monocytogenes with different matrix solutions

圖3 不同配比基質(zhì)液處理空腸彎曲菌后質(zhì)量圖譜特征峰及相對(duì)豐度對(duì)比Fig. 3 Characteristic peaks and relative abundance for Campylobacter jejuni with different matrix solutions

空腸彎曲菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析顯示（圖3），各組的質(zhì)譜峰圖譜極其相似，各組檢出峰未出現(xiàn)缺失現(xiàn)象。其中C3組特征峰m/z 4 365、4 776、6 158、7 035、7 082、8 461、9 553的相對(duì)峰強(qiáng)度較其他組更高，其中高峰值區(qū)的特征峰具有更高的峰強(qiáng)度，而低峰值區(qū)則沒(méi)有顯著的差異（P＜0.05）?；|(zhì)液的含水量對(duì)空腸彎曲菌質(zhì)譜峰形有一定的影響，C4組含水較高可能由此降低了高峰值特征峰的相對(duì)峰強(qiáng)度，使得檢出率小幅度下降。CHCA體積分?jǐn)?shù)的高低對(duì)質(zhì)譜結(jié)果的影響不明顯，而TFA體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.5%可以增加空腸彎曲菌的檢出率，而TFA體積分?jǐn)?shù)高于0.5%后檢出峰相對(duì)峰強(qiáng)度增強(qiáng)不明顯（結(jié)果未給出）。甲酸裂解處理后峰值強(qiáng)度沒(méi)有明顯增強(qiáng)，空腸彎曲菌不能通過(guò)甲酸裂解處理提高檢出。m/z 4 365、5 267、5 498、7 035的相對(duì)峰強(qiáng)度較高，可能是空腸彎曲菌的特異性生物標(biāo)志峰。

圖4 不同配比基質(zhì)液處理單核細(xì)胞性李斯特菌后質(zhì)量圖譜特征峰及豐度值對(duì)比Fig. 4 Characteristic peaks and relative abundance for Listeria monocytogenes with different matrix solutions

單核細(xì)胞性李斯特菌的質(zhì)譜峰圖譜與空腸彎曲菌不同（圖4）。所有組的圖譜呈現(xiàn)明顯的中高峰值區(qū)聚集現(xiàn)象，低峰值區(qū)的峰相對(duì)強(qiáng)度很低。L3和L4組的特征峰m/z 4 519、4 877、6 009、6 389、6 717、7 404和7 591的峰相對(duì)強(qiáng)度較高，峰形更突出，可見(jiàn)甲酸裂解后的實(shí)驗(yàn)組其各特征峰峰強(qiáng)度均有顯著的提高，甲酸處理是革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)譜鑒定的關(guān)鍵。L3組基質(zhì)液無(wú)水，導(dǎo)致m/z 3 714、5 118和5 172等特征峰缺失，而L1組基質(zhì)液中缺乏并未出現(xiàn)類(lèi)似空腸彎曲菌的檢出率下降的現(xiàn)象，可見(jiàn)TFA體積分?jǐn)?shù)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性李斯特菌的影響較低。m/z 4 324、4 877和9 755特征峰峰強(qiáng)度較高，可以作為單核細(xì)胞性李斯特菌質(zhì)譜檢測(cè)的特異性生物標(biāo)志。

以此配方對(duì)其他菌種進(jìn)行了質(zhì)譜分析（表3），發(fā)現(xiàn)檢出菌都呈現(xiàn)C3和L4組實(shí)驗(yàn)組檢出率較高的現(xiàn)象。大部分革蘭氏陽(yáng)性菌樣品未用甲酸處理都難以檢出。肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌及蠟樣芽孢桿菌使用改進(jìn)后的基質(zhì)液處理后，檢出率沒(méi)有得到顯著改善（表3）。

表3 革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌使用基質(zhì)液配方與檢出率Table 3 Detection rates of Gram positive and negative bacteria using matrix solutions

3 討 論

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)和鑒定是耗時(shí)又復(fù)雜的，由于不穩(wěn)定的試劑、血清及培養(yǎng)條件的影響，鑒定結(jié)果往往具有顯著的人為差異。采用自動(dòng)化鑒定技術(shù)及快速鑒定技術(shù)，可以有效的減少人為、環(huán)境和培養(yǎng)條件帶來(lái)的誤差，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒定。李斯特菌和空腸彎曲菌感染是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的食源性疾病之一。空腸彎曲菌致病性具有很強(qiáng)的隱蔽性，它通過(guò)正常攜帶不致病方式隱藏在禽類(lèi)腸道等內(nèi)臟中，能夠在厭氧條件生長(zhǎng)，這些特征都極大的干擾了檢測(cè)工作[17-19]。單核細(xì)胞性李斯特菌的致病性很強(qiáng)，冷凍食品中的單增細(xì)胞性李斯特菌對(duì)與免疫力低下的病人具有很強(qiáng)的致病性病死率較高，是全球重點(diǎn)關(guān)注的食源性致病菌[20-23]。建立快速、準(zhǔn)確的疑難致病菌檢測(cè)和鑒定方法，尤其是針對(duì)性的快速鑒定方法，對(duì)保證食品安全和人類(lèi)健康具有重要意義。目前針對(duì)這兩種致病菌的方法很多，我國(guó)檢測(cè)領(lǐng)域目前常用的檢測(cè)技術(shù)有傳統(tǒng)表型鑒定、生化反應(yīng)鑒定和特異性平板篩選等。但由于這兩種致病菌培養(yǎng)慢，條件苛刻，較難檢出，傳統(tǒng)微生物鑒定技術(shù)不具備明顯的優(yōu)勢(shì)。

新型微生物質(zhì)譜技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)直接檢出單菌落種屬水平信息。文獻(xiàn)報(bào)道的VITEK MS微生物質(zhì)譜分析的準(zhǔn)確率在92.5%～99.0%之間，顯著高于API生化分析法（78.5%）、顯色培養(yǎng)鑒定法（59.3%）[24-26]。VITEK MS能快速、準(zhǔn)確、高效地鑒定微生物。其中較為突出的是傳統(tǒng)方法很難鑒定到種的酵母菌和真菌。據(jù)報(bào)道通過(guò)VITEK MS檢測(cè)1058株酵母實(shí)驗(yàn)中，只有3%未檢出，1%檢出錯(cuò)誤，有12 株菌株信息在VITEK MS數(shù)據(jù)庫(kù)中缺失。通過(guò)ITS測(cè)序?qū)Ρ?，發(fā)現(xiàn)VITEK MS的檢出率達(dá)到96%[27]。大部分實(shí)驗(yàn)報(bào)道中，VITEK MS未能檢出微生物的原因主要是數(shù)據(jù)庫(kù)中圖譜較少或缺失。隨著該技術(shù)的廣泛推廣應(yīng)用，質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)將得到不斷補(bǔ)充完善，鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確和可靠[28-30]。

通過(guò)對(duì)空腸彎曲菌及李斯特菌質(zhì)譜鑒定基質(zhì)液的比較分析，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株前處理優(yōu)化對(duì)于微生物質(zhì)譜分析至關(guān)重要。革蘭氏陽(yáng)性菌李斯特菌及陰性菌空腸彎曲菌對(duì)基質(zhì)液要求不同，李斯特菌需要甲酸破壁處理卻對(duì)TFA含量要求較低，而空腸彎曲菌的基質(zhì)液則需要將TFA體積分?jǐn)?shù)提高至0.5%以上方能顯著提高檢出，而無(wú)需甲酸破壁處理。質(zhì)譜基質(zhì)液含水量控制在30%能夠減少特征峰缺失，有效地提高檢出率。為了降低成本，質(zhì)譜分析用空腸彎曲菌基質(zhì)液最優(yōu)配方為：V（乙醇）∶V（乙腈）∶ V（水）=1∶1.5∶1，2.5% CHCA，0.2%～0.5% TFA；李斯特菌基質(zhì)液最優(yōu)配方為：V（乙醇）∶V（乙腈）∶V（水）=1∶1∶1，1.0% CHCA。陽(yáng)性菌：取麥?zhǔn)蠞岫?.0～3.5的菌液1.0 μL置于10 μL離心管，加入0.5 μL甲酸溶液破壁5 min，吸出混合液涂布于點(diǎn)樣孔。加入1.0 μL的陽(yáng)性菌基質(zhì)液，25 ℃干燥10 min。陰性菌：取麥?zhǔn)蠞岫?.0～1.5的菌液1.0 μL置于10 μL離心管直接涂布于點(diǎn)樣孔。加入1.5 μL的陰性菌基質(zhì)液，25 ℃干燥10 min。制定待測(cè)菌株的質(zhì)譜檢測(cè)處理流程（圖5），可以完善常見(jiàn)食源性致病菌快速檢測(cè)的平臺(tái)，更有效地應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處理。通過(guò)改進(jìn)基質(zhì)液，針對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌進(jìn)行區(qū)別處理，可以顯著提高食源性致病菌的檢出率。但是某些致病菌的質(zhì)譜檢測(cè)依然困難，VITEK MS很難檢出志賀菌，同時(shí)肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌和蠟樣芽孢桿菌的質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度較低。根據(jù)菌株特性推測(cè)，菌株的生長(zhǎng)特征可能制約著質(zhì)譜檢測(cè)的檢出。肺炎克雷伯菌具有很強(qiáng)的黏性，而CHCA基質(zhì)液處理后結(jié)晶化程度較差，由此可能導(dǎo)致質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度下降。蠟樣芽孢桿菌和肺炎鏈球菌菌落干燥，且硬度較高，需要進(jìn)行更有效的破壁處置。食源性致病菌在VITEK MS鑒定過(guò)程中對(duì)基質(zhì)液的要求有差異，優(yōu)化基質(zhì)液配比和處理程序可以優(yōu)化食源性致病菌質(zhì)譜檢測(cè)效率，提高質(zhì)譜微生物鑒定的優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步對(duì)不同食源性致病菌質(zhì)譜鑒定過(guò)程中基質(zhì)液的優(yōu)化配比進(jìn)行研究十分必要。

圖5 革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌VITEK MS檢測(cè)流程Fig. 5 Flow chart for VITEK MS detection process of Gram positive and negative bacteria

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Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry for the Detection of Campylobacter jejuni and Listeria monocytogenes

TU Bowen1, JI Junmin1, DU Qiang1, LI Junhong1, TANG Hongbing1, XIONG Jibin2, HAN Xiaodong3
(1. Changzhou Centers for Disease Control and Prevention, Changzhou 213022, China;2. The Vaccine Engineering Center of Taizhou Medical Hi-tech Industrial Park, Taizhou 225300, China;3. School of Medical, Nanjing University, Nanjing 210093, China)

Objective∶ To establish a matrix-assisted laser desorption ionization time of fl ight mass spectrometry (MALDITOF-MS) method to detect Campylobacter jejuni and Listeria monocytogenes in environmental samples from a chicken farm and samples from commercial live chickens using VITEK MS. Methods∶ The suspicious colonies of both bacteria were separated from the samples, and then suspended in matrix solutions consisting of mixtures of different proportions of ethanol, acetonitrile and water before identifi cation by MALDI-TOF-MS. The effect of matrix solution composition on the bacterial detection was evaluated by examining the differences in characteristic peak value and relative abundance. Results∶Signifi cantly different matrix solutions were needed for the detection of Campylobacter jejuni and Listeria monocy togenes;the former did not require cracking by formic acid and was sensitive to trifl uoroacetic acid (TFA), but the latter were just the opposite. A 30% water content in matrix solution (V/V) could avoid the lack of characteristic peak and enhance the detection rate. Conclusion∶ Control of the water content in matrix solution, TFA concentration and matrix concentration can enhance the number and relative abundance of characteristic peaks, and detection rate. The optimized matrix solution enables the rapid identifi cation of foodborne pathogens, which was able to improve the timeliness of disease prevention and food-borne risk monitoring.

VITEK MS microbe identification system; Campylobacter jejuni; Listeria monocytogenes; matrix solution composition; mass spectrometric detection of microbes

R446.5

A

1002-6630（2017）20-0262-06

2016-10-27

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20150250）；江蘇省衛(wèi)生計(jì)生委科研項(xiàng)目（Y2015016）；

常州市科技項(xiàng)目（CE20165042）

屠博文（1984—），男，助理研究員，博士，主要從事病原微生物質(zhì)譜檢測(cè)和院內(nèi)感染超級(jí)細(xì)菌的基因分型研究。

E-mail：tbwchangzhou@163.com

屠博文, 吉俊敏, 杜強(qiáng), 等. 基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜法檢測(cè)空腸彎曲菌及李斯特菌[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20):262-267. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720038. http://www.spkx.net.cn

TU Bowen, JI Junmin, DU Qiang, et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time of fl ight mass spectrometry for the detection of Campylobacter jejuni and Listeria monocytogenes[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 262-267. ( in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720038. http∶//www.spkx.net.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720038