雙固相萃取柱凈化-超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定貝類組織中全氟羧酸及其前體物質(zhì)

國(guó) 佼，郭萌萌，吳海燕，翟毓秀，牟海津，盧立娜，譚志軍,*

雙固相萃取柱凈化-超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定貝類組織中全氟羧酸及其前體物質(zhì)

國(guó) 佼1,2，郭萌萌2,3，吳海燕2,3，翟毓秀2,3，牟海津1，盧立娜2,3，譚志軍2,3,*

（1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢 測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

建立同 時(shí)測(cè)定貝類中13 種全氟羧酸類化合物、6 種氟調(diào)聚飽和酸和3 種氟調(diào)聚不飽和酸的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品經(jīng)90%乙腈溶液超聲提取，Oasis WAX和Envi-Carb雙固相萃取柱凈化，Kinetex XB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）分離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子模式掃描，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。22 種目標(biāo)物在各自相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相 關(guān)系數(shù)不低于0.995，定量限為0.03～1.67 ng/g?；|(zhì)加標(biāo)回收率在63.05%～127.18%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.70%～17.1%。本方法實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜貝類基質(zhì)（肌肉、肝臟、外套膜、鰓、性腺等）中PFCAs及其前體物質(zhì) 的同時(shí)測(cè)定， 采用雙柱凈化方式，大大降低了雜質(zhì)成分的干擾，部分化合物的靈敏度優(yōu)于現(xiàn)有方法，適用于貝類樣品中PFCAs及其前體物質(zhì)的監(jiān)控分析，為研究PFCAs前體物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化提供了新技術(shù)手段。

全氟羧酸及其前體物質(zhì)；貝類；固相萃??；超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

全氟羧酸類化合物（perfl uoroalkyl carboxylic acids，PFCAs）為環(huán)境介質(zhì)中廣泛存在、極具代表性的一類全氟化合物，具有多臟器毒性和潛在致癌性[1-3]。與其他全氟化合物相比，PFCAs分布更廣且是多種前體物質(zhì)在環(huán)境和生物體中的最終轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其造成的環(huán)境和健康問(wèn)題，已引起國(guó)際社會(huì)的高度關(guān)注[4-5]。而除PFCAs自身外，PFCAs前體物質(zhì)為生物體內(nèi)PFCAs污染的間接來(lái)源，其中氟調(diào)聚物是PFCAs間接來(lái)源的重要組成部分[6]。研究發(fā)現(xiàn)，PFCAs毒性閾值主要取決于氟化碳鏈長(zhǎng)度、種類和α-β碳鍵的不飽和程度[7-8]，其毒性隨著其碳鏈長(zhǎng)度增加而增強(qiáng)[9]。而且，PFCAs的前體物質(zhì)，如氟調(diào)聚飽和酸（fluorotelomer saturated carboxylic acids，F(xiàn)TCAs）和氟調(diào)聚不飽和酸（fluorotelomer unsaturated carboxylic acids，F(xiàn)TUCAs）的毒性甚至遠(yuǎn)大于PFCAs（毒性大小順序?yàn)椋篎TCAs＞FTUCAs＞PFCAs）[7,10]。由于PFCAs及其前體物質(zhì)可能同時(shí)存在于同一生物體內(nèi)，這種復(fù)合污染所帶來(lái)的聯(lián)合毒性已引起了研究者的密切關(guān)注[11-12]。而雙殼貝類作為海洋POPs污染指示物，對(duì)PFCAs表現(xiàn)出高選擇性的蓄積作用[13]，相關(guān)檢出率達(dá)72%以上[14]。因此，建立一個(gè)涵蓋多組分PFCAs及其前體物質(zhì)的準(zhǔn)確、靈敏的高效檢測(cè)方法，對(duì)于雙殼貝類中PFCAs及其前體物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化和聯(lián)合毒性等相關(guān)研究具有重要意義。

現(xiàn)有方法中，多采用有機(jī)溶劑提取，弱陰離子交換（weak anion exchange，WAX）固相萃取 或 分散石墨化炭黑凈化[15-17]，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[18-19]分析生物樣品中的痕量全氟化合物。但是針對(duì)環(huán)境和生物樣品中PFCAs及其前體物質(zhì)的同時(shí)分析方法相對(duì)較少，而且已有方法多存在分析物種類不全、靈敏度和回收率低等缺陷。如Taniyasu等[20]采用KOH消解提取結(jié)合WAX固相萃取柱凈化的方法對(duì)水、血液和肝臟樣品中PFCA s及其前體物質(zhì)進(jìn)行分析，由于凈化方法無(wú)法有效消除基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致部分前體物質(zhì)回收率偏低。而雙柱串聯(lián)的凈化方式可有效解決這一問(wèn)題，已用于復(fù)雜基質(zhì)中全氟化合物的分析[14,21-22]。Zabaleta等[18]在全氟化合物分析方法的基礎(chǔ)上，將雙柱凈化方式用于魚的肝臟、肌肉中PFCAs及其前體物質(zhì)的痕量分析，但不足之處是采用了兩種洗脫梯度進(jìn)行洗脫分析，未實(shí)現(xiàn)真正意義上的同時(shí)測(cè)定，且部分目標(biāo)物的檢出限仍處于較高水平，無(wú)法滿足 痕量水平上PFCAs及其前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究的需要。

本研究選取雙殼貝類的不同組織（肌肉、肝臟、外套膜、鰓、性腺）和全貝為生物基質(zhì)，采用超聲提取結(jié)合WAX和Envi-carb雙柱串聯(lián)固相萃取凈化的前處理方法，并優(yōu)化PFCAs及其前體物質(zhì)同時(shí)測(cè)定的儀器條件，實(shí)現(xiàn)了13 種PFCAs及其9 種前體物質(zhì)（6 種FTCAs和3 種FTUCAs）的同步提取和同時(shí)測(cè)定。該方法靈敏度、準(zhǔn)確度高，適用于貝類組織復(fù)雜基質(zhì)樣品中PFCAs及其前體物質(zhì)的痕量分析，為全氟化合物及其前體物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化特征、安全評(píng)價(jià)等相關(guān)研究提供了新技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貝類樣品：2016年1— 4月，隨機(jī)在黃海青島海域和大連海域共采集45 個(gè)雙殼貝類樣品，種類為扇貝和牡蠣，分解為肌肉、肝臟、外套膜、鰓、性腺等不同組織，所有組織和樣品經(jīng)冷凍干燥后于-20 ℃保存，用于實(shí)際樣品的測(cè)試和方法驗(yàn)證。

甲醇、乙腈（LC-MS級(jí)） 美國(guó)Merck公司；乙酸銨（HPLC級(jí)）、Supelclean ENVI-Carb固相萃取柱、氨水（ACS級(jí)） 美國(guó)Sigma Aldrich公司；甲酸、超純水（LC-MS級(jí)） 美國(guó)賽默飛世爾公司；Oa sis WAX固相萃取柱（150 mg，6 mL） 美國(guó)Waters公司；丙酮（HPLC級(jí)） 美國(guó)J.T.Baker公司；其他未作特殊說(shuō)明的試劑均為分析純。

22 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及6 種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（純度均大于99%）均購(gòu)自于加拿大Wellington Labortories公司：1）PFCAs：全氟丁酸（perfluorobutanoic acid，PFBA）、全氟戊酸（perfluoropentanoic acid，PFPeA）、全氟己酸（perfluorohexanoic acid，PFHxA）、全氟庚酸（perfluoroheptanoic acid，PFHpA）、全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）、全氟壬酸（perfluorononanoic acid，PFNA）、全氟癸酸（perfluorodecanoic acid，PFDA）、全氟十一烷酸（perfluoroundecanoic acid，PFUdA）、全氟十二烷酸（perfluorododecanoic acid，PFDoA）、全氟十三烷酸（perfluorotridecanoic acid，PFTrDA）、全氟十四烷酸（perfluorotetradecanoic acid，PFTeDA）、全氟十六烷酸（perfluorohexadecanoic acid，PFHxDA）、全氟十八烷酸（perfl uorooctadecanoic acid，PFODA）；2）PFCAs前體物質(zhì)：6∶2氟調(diào)聚酸（6∶2 fluorotelomer carboxylic acid，6∶2 FTCA）、8∶2氟調(diào)聚酸（8∶2 FTCA）、10∶2氟調(diào)聚酸（10∶2 FTCA）、3∶3氟調(diào)聚酸（3∶3 FTCA）、5∶3氟調(diào)聚酸（5∶3 FTCA）、7∶3氟調(diào)聚酸（7∶3 FTCA）、6∶2氟調(diào)聚不飽和酸（6∶2 Fluorotelomer unsaturated carboxylic acid，6∶2 FTUCA）、8∶2氟調(diào)聚不飽和酸（8∶2 FTUCA）、10∶2氟調(diào)聚不飽和酸（10∶2 FTUCA）；3）內(nèi)標(biāo)物質(zhì)：[13C4]-全氟辛酸（MPFOA）、[13C2]-6∶2氟調(diào)聚酸（M6∶2 FTCA）、[13C2]-8∶2氟調(diào)聚酸（M8∶2 FTCA）、[13C2]-10∶2氟調(diào)聚酸（M10∶2 FTCA）、[13C2]-6∶2氟調(diào)聚不飽和酸（M6∶2 FTUCA）、[13C2]-8∶2氟調(diào)聚不飽和酸（M8∶2 FTUCA）。

1.2 儀器與設(shè)備

Prominence UFLC液相色譜 日本Shimadzu公司；5500 QTRAP四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜 美國(guó)AB Sciex公司；Elmasonic E300超聲清洗機(jī) 德國(guó)艾爾瑪公司；T18 basic型均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；真空冷凍干燥機(jī)丹麥Scanlaf公司；XW-80A旋渦混合器 上海醫(yī)大儀器廠；Himac CR 22GⅡ高速離心機(jī) 日本Hitachi公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國(guó)Organomation公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；57250-U固相萃取裝置美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

1.3.1.1 提取

稱取0.50 g勻質(zhì)后的凍干樣品，于15 mL聚丙烯（polypropylene，PP）離心管中，加入內(nèi)標(biāo)物（1 ng）和5 mL 90%乙腈溶液，渦旋混勻，在30 ℃超聲萃取15 min，頻率50 kHz，6 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至15 mL PP離心管中，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，40 ℃氮吹至約1 mL，待凈化。

1.3.1.2 凈化

二級(jí)節(jié)點(diǎn)有寧德市蕉城區(qū)霍童溪，七都溪，金溪，飛鸞溪流域各支流，洪口水庫(kù)，虎貝水庫(kù)以及著名景點(diǎn)黃鞠灌溉工程景點(diǎn)的景點(diǎn)科普宣傳牌示，共7處。

WAX固相萃取柱使用前依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，Envi-carb小柱預(yù)先用5 mL甲醇活化。將提取液用6 mL水稀釋后，以1 滴/s的流速通過(guò)WAX小柱，用1 mL 2%甲酸溶液和1 mL 5%甲醇溶液淋洗，再將Envi-carb小柱串聯(lián)至WAX固相萃取柱下方，向WAX柱中加入4 mL 2.5%的氨水-丙酮溶液洗脫目標(biāo)物，洗脫液在40 ℃氮吹至干，最后用50%甲醇溶液定容至0.25 mL，12 000 r/min離心5 min，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3.1.3 肝臟樣品

經(jīng)上述提取和凈化處理后，用50%甲醇溶液定容至1 mL，12 000 r/min離心5 min，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

為避免引入高背景值，實(shí)驗(yàn)全過(guò)程避免使用聚四氟乙烯材質(zhì)的色譜管路和器皿，且實(shí)驗(yàn)器皿使用前用甲醇充分清洗；同時(shí)，采用雜質(zhì)延遲法[23]，在混合器和進(jìn)樣器之間安裝延遲色譜柱，使液相系統(tǒng)的背景干擾組分與目標(biāo)組分分離。

1.3.2 色譜條件

Kinetex XB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；延遲柱：C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A：5%的甲醇溶液（含5 mmol/L乙酸銨），B：95%的甲醇溶液（含5 mmol/L乙酸銨）；洗脫梯度：0～1.5 min，10% B；1.6～2.0 min，10%～40% B；2.1～5.0 min，40%～60% B；5.1～14 min，60%～98% B；14.1～16.0 min，98% B；16.1～18.0 min，10% B。

1.3.3 質(zhì)譜條件

表1 22 種目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters for 22 target compounds

表2 內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)及其校正的目標(biāo)化合物Table 2 Mass spectral parameters for internal standards with corresponding calibra ted target analytes

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

為獲得較好的色譜分離效果和色譜峰形，實(shí)驗(yàn)選擇了Kinetex XB-C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm） 色譜柱作為分析柱，發(fā)現(xiàn)該色譜柱能 實(shí)現(xiàn)22 種目標(biāo)物的良好分離，且目標(biāo)化合物峰形對(duì)稱。

圖1 PFCAs（A）、FTCAs和FTUCAs（B）的提取離子色譜圖（5.0 ng.0 ng/mL）mLFig. 1 Extracted ion chromatograms of PFCAs (A), FTCAs and FTUCAs (B) (5.0 ng/mL)

實(shí)驗(yàn)考察流動(dòng)相梯度對(duì)于色譜行為的影響。Zabaleta等[24]指出 乙腈的加入會(huì)使靈敏度下降，因此液相系統(tǒng)采用甲醇體系作為流動(dòng)相，而在流動(dòng)相的水相中加入醋酸銨等揮發(fā)性電解質(zhì)，可以提高離子化效率, 在保持較好分離度的前提下獲得理想色譜峰形[25]。本實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相組成和比例分別為A：5%的甲醇溶液（含5 mmol/L 乙酸銨），B：95%的甲醇溶液（含5 mmol/L乙酸銨），以5 ng/mL的PFCAs標(biāo)準(zhǔn)溶液為例，以文獻(xiàn)中前體物質(zhì)測(cè)定的色譜條件[18]為基礎(chǔ)進(jìn)一步優(yōu)化洗脫條件。結(jié)果表明，在優(yōu)化后的洗脫條件下，目標(biāo)物分離效果更好。在保證有機(jī)溶劑起始濃度以及總洗脫時(shí)間相同的條件下，延長(zhǎng)了目標(biāo)物的出峰時(shí)間，從而降低了分析時(shí)間前段帶來(lái)的基質(zhì)干擾[26]，使22 種目標(biāo)物在18 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了PFCAs及其前體物質(zhì)的良好分離和同時(shí)測(cè)定（圖1）。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將PFCAs及其前體物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以針泵流動(dòng)注射方式注入，優(yōu)化ESI源負(fù)離子模式下的質(zhì)譜參數(shù)。通過(guò)四極桿Q1全掃描確定目標(biāo)母離子，以MRM模式優(yōu)化各化合物的子離子和碰撞能。源區(qū)參數(shù)主要考察脫溶劑氣溫度、噴霧電壓、氣簾氣流速等質(zhì)譜參數(shù)，其中，脫溶劑氣溫度對(duì)PFCAs和前體物質(zhì)的影響差異較大，n∶2 FTCAs對(duì)其溫度最為敏感，當(dāng)溫度從450 ℃升高至650 ℃時(shí)，n∶2 FTCA響應(yīng)值提高了3～8 倍；而隨著脫溶劑氣溫度的升高，PFCAs的響應(yīng)強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，結(jié)果與文獻(xiàn)[27]報(bào)道類似，最終確定脫溶劑氣溫度為500 ℃。當(dāng)噴霧電壓分別為-4、-4.5 kV和-5 kV時(shí)，目標(biāo)物在-4.5 kV時(shí)響應(yīng)值最高，最終確定噴霧電壓為-4.5 kV；當(dāng)氣簾氣流速分別為低、中和高時(shí)，目標(biāo)化合物在High級(jí)響應(yīng)最高。

在二級(jí)質(zhì)譜掃描中，對(duì)母離子進(jìn)行相應(yīng)子離子掃描，并選取豐度最強(qiáng)的離子作為定量離子，豐度次強(qiáng)的離子作為定性離子。13 種PFCAs含有羧基，主要發(fā)生CO2丟失，形成碎片離子峰[M-H-44]-；n∶2 FTUCA和3∶3 FTCA主要發(fā)生CO2和HF丟失，形成碎片離子峰[M-H-64]-；n∶2 FTCA主要發(fā)生CO2和2 HF丟失，形成碎片離子峰[M-H-84]-；5∶3 FTCA和7∶3 FTCA主要發(fā)生CO2和3 HF丟失，形成碎片離子峰[M-H-104]-。同時(shí)，優(yōu)化解簇電壓和碰撞能等參數(shù)。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如表1和表2所示。

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取劑的選擇

水產(chǎn)品基質(zhì)中PFCAs 及其前體物質(zhì)的檢測(cè)方法多采用乙腈[18,28-29]為提取劑，本實(shí)驗(yàn)以扇貝干粉樣品為例，選用2%甲酸-乙腈、乙腈、90%乙腈溶液、80%乙腈溶液分別作為提取劑進(jìn)行比較，如圖2所示，以2%甲酸-乙腈為提取劑時(shí)，提取出的干擾物較多，具有較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，多數(shù)目標(biāo)物的回收率在120%以上。采用乙腈、90%乙腈溶液和80%乙腈溶液為提取劑時(shí)，前體物質(zhì)FTCAs的提取率在69.9%～125%之間，但乙腈和80%乙腈溶液對(duì)PFDA、PFUdA、PFDoA、PFTrDA、PFTeDA的回收率僅為36.6%～84.3%，而90%乙腈溶液對(duì)這5 種化合物的回收率在56.5%～86.7%之間；然而這4 種提取劑對(duì)PFHxDA和PFODA的回收率均在60%左右，可能與基質(zhì)抑制效應(yīng)以及缺少相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物定量有關(guān)。

圖2 不同提取劑下目標(biāo)物的回收率（n==33）Fig. 2 Recoveries of target compounds with different extraction solvents (n = 3)

2.3.2 凈化方法的優(yōu)化

近年來(lái)，因WAX固相萃取柱采用離子交換和反相吸附的共同保留機(jī)制使其對(duì)于強(qiáng)酸性化合物（lg pKa＜5）有較強(qiáng)的保留作用，而被廣泛用于全氟化合物的凈化過(guò)程[16,24,30]。Zabaleta等[24]比較了HLB、WAX和MAX 3 種固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果也表明采用WAX柱凈化，樣品中全氟化合物的回收率在80%～120%之間。石墨化碳黑由微弱的范德華力結(jié)合，其表面特殊的六邊形結(jié)構(gòu)對(duì)于平面分子或者含有平面芳香型的分子具有強(qiáng)烈的吸附作用，而PFCAs類物質(zhì)并不與其結(jié)合，從而也可達(dá)到凈化目的。由于貝類樣品的基質(zhì)顏色較深，僅用WAX柱凈化不能去除色素等雜質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)擬在WAX柱凈化的基礎(chǔ)上，增加石墨化炭黑的凈化步驟，即在洗脫時(shí)，經(jīng)過(guò)WAX和Envi-carb雙固相萃取柱的復(fù)合凈化，以除去芳香族化合物和色素，并比較了有無(wú)Envi-carb固相萃取柱對(duì)凈化效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Envi-carb凈化后的洗脫液顏色明顯變淺（圖3），比較經(jīng)Envi-carb凈化前后的貝類肌肉的全掃描總離子流圖（圖4）可見(jiàn)，以基質(zhì)成分的強(qiáng)度估算，經(jīng)Envi-carb凈化后的基質(zhì)成分明顯減少，PFUdA、PFDoA和10∶2 FTUCA的回收率從58.71%～77.11%提高到92.9%～98.6%。

圖3 Envi-carb的凈化前后對(duì)比Fig. 3 Purifi cation effi ciency of Envi-carb

圖4 經(jīng)Envi-carb凈化前（A）和凈化后（B）扇貝肌肉樣品的總離子流圖比較Fig. 4 Total ion current (TIC) chromatograms of scallop muscle extract not purifi ed (A) and purifi ed (B) with Envi-carb

2.3.3 貝類肝臟樣品基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)估

本方法在測(cè)試貝類不同組織時(shí)，發(fā)現(xiàn)肝臟樣品中前體物質(zhì)FTCAs受基質(zhì)干擾嚴(yán)重、噪音高、雜質(zhì)多，抑制目標(biāo)物的離子化，難以進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量。實(shí)驗(yàn)采用稀釋提取濃縮液的方法以降低基質(zhì)效應(yīng)，并以空白樣品提取液和50%甲醇溶液配制一系列質(zhì)量濃度（2～20 ng/mL）的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以8∶2 FTCA為例，通過(guò)比較8∶2 FTCA的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，由圖5可以看出，溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線重合較好，結(jié)果表明，將定容體積提高到1 mL后能有效降低肝臟樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。在貝類肝臟樣品中加入2 ng目標(biāo)物，按照1.3.1節(jié)的前處理步驟，進(jìn)行提取濃縮后，并定容至1 mL，F(xiàn)TCAs的回收率由62.3%～102.5%提高到85.3%～123%。由圖6也可以看出，在稀釋萃取濃縮液后，肝臟樣品中8∶2 FTCA的響應(yīng)強(qiáng)度顯著提高。

圖5 稀釋后的8∶2 FTCA溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Standard curves for standard solutions and calibration curves for matrix-matched solutions of 8∶2 FTCA after dilution

圖6 肝臟中不同定容體積下8∶2 FTCA的提取離子色譜圖對(duì)比Fig. 6 Comparison of MRM chromatograms for 8∶2 FTCA in liver(2 ng/mL) with difference volumes of reconstitution

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系和靈敏度

表3 22 種目標(biāo)物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear range, regression equation, correlation coeffi cient,detection limits and quantitation limits for 22 target compounds

取適量PFCAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，配制一系列質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)條件下依次測(cè)定，以分析物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。采用雜質(zhì)延遲法，儀器的背景干擾得到了有效控制。在空白樣品中添加低質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.1節(jié)步驟進(jìn)行樣品前處理后進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比不小于3確定各組分的檢出限，以信噪比不小于10確定各組分定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，22 種目標(biāo)物的線性良好，定量限為0.03～1.67 ng/g，本方法適用于貝類樣品中PFCAs及其前體物質(zhì)的定量分析。

2.4.2 準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別選取扇貝和牡蠣的肌肉、肝臟和全貝作為空白基質(zhì)，分別添加相當(dāng)于樣品基質(zhì)2、5 ng/g和10 ng/g的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組做6 個(gè)平行，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，扣除本底值后計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。在扇貝肌肉和全貝中的平均回收率分別為67.76%～123.11%，肝臟中的平均回收率為63.05%～127.18%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.70%～15.6%和6.27%～17.1%；在牡蠣肌肉和全貝的平均回收率為68.29%～121.03%，肝臟中的平均回收率為64.68%～119.33%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.70%～15.6%和7.35%～16.7%。以上結(jié)果說(shuō)明，該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好（表4），滿足日常水產(chǎn)品中PFCAs及其前體物質(zhì)的監(jiān)測(cè)要求。

表4 全貝中PFCAs的回收率和精確度（n=6）Table 4 Recoveries and precision of PFCAs spiked in shellfi sh （n=6）

2.5 貝類樣品中PFCAs及其前體物質(zhì)污染情況

應(yīng)用本方法分析了采自于黃海青島和大連海域45 個(gè)雙殼貝類樣品的PFCAs及其前體物質(zhì)的污染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PFCAs在雙殼貝類中的污染呈現(xiàn)出一種普遍性趨勢(shì)，其中PFOA檢出率高達(dá)90%以上，且平均含量最高，達(dá)5.34 ng/g；PFNA、PFTrDA、PFUdA和PFTeDA等PFCAs類的檢出率也超過(guò)80%，但均處于痕量水平。前體物質(zhì)方面；同時(shí)，多種前體物質(zhì)均有檢出，其中7∶3 FTCA的平均含量最高（2.33 ng/g）。貝類肝臟樣品中的PFOA和7∶3 FTCA的色譜圖如圖7所示。不同貝類組織間（肌肉、性腺、外套膜、內(nèi)臟、鰓）表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，如PFOA平均含量由高到低依次為肝臟＞性腺＞鰓＞外套膜＞肌肉。結(jié)果證明，本方法在保證靈敏度和準(zhǔn)確度的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了PFCAs及其前體物質(zhì)的同時(shí)定量分析，方法涉及的檢測(cè)指標(biāo)豐富，且采用多步凈化方式，極大程度降低了芳香族化合物和色素等雜質(zhì)成分的干擾，適用于復(fù)雜基質(zhì)中多種PFCAs及其前體物質(zhì)的同時(shí)定性、定量分析。

圖7 貝類樣品中PFOA（A）和7∶3 FTCA（B）的MRM色譜圖Fig. 7 MRM chromatograms of PFOA and 7∶3 FTCA detected in bivalve shellfi sh

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用雙固相萃取柱串聯(lián)凈化策略，即在洗脫時(shí)增加Envi-carb小柱凈化步驟，極大程度降低雜質(zhì)成分干擾，明顯改善基質(zhì)抑制效應(yīng)，且部分化合物回收率有所提升，在不損失目標(biāo)成分的前提下，實(shí)現(xiàn)了22 種PFCAs及其前體物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定，同時(shí)采用稀釋提取濃縮液的方式，提高了肝臟等復(fù)雜基質(zhì)樣品中目標(biāo)物的定性和定量能力，準(zhǔn)確度和靈敏度均滿足日常水產(chǎn)品監(jiān)測(cè)要求。該方法的建立為研究復(fù)雜基質(zhì)中PFCAs及其前體物質(zhì)的復(fù)合污染特征提供了新的技術(shù)手段。

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Simultaneous Determination of Perfl uorinated Acids and Their Precursors in Bivalve Shellfi sh by Double SPE Columns Purifi cation and Ultra Fast Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GUO Jiao1,2, GUO Mengmeng2,3, WU Haiyan2,3, ZHAI Yuxiu2,3, MOU Haijin1, LU Lina2,3, TAN Zhijun2,3,*
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China;2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China;3. Key Laboratory of Testing and Evaluatio n for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Qingdao 266071, China)

A method for the simultaneous identification and quantification of thirteen perfluoroalkyl carboxylic acids(PFCAs), six fluorotelomer saturated carboxylic acids (FTCAs) and three fluorotelomer unsaturated carboxylic acids(FTUCAs) in bivalve shellfish tissues was developed using ultra fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UFLC-MS/MS). Samples were extracted with acetonitrile-water (90∶10, V/V), and the extract was cleaned up by solid-phase extraction (SPE) using Oasis WAX SPE coupled in-line to ENVI-Carb. Then, the separation was performed on a Kinetex XB-C18column (2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm) with gradient elution using a mixture of 95% methanol solution containing 5 mmol/L ammonium acetate and 5% methanol solution contai ning 5 mmol/L ammonium acetate as the mobile phase. Mass spectrometry was carried out unde r the multiple reaction monitoring (MRM) mode wit h negative electrospray ionization and the internal standard method was employed for quantifi cation. The calibration curves for 22 analytes were linear well with correlation coeffi cient over 0.995. The limits of quantifi catio n ranged from 0.03 to 1.67 ng/g. The average spiked rec overies for 22 analytes were between 63.05% and 127.18%, wit h relative standard deviations (RSDs) from 4.70% to 17.1%. This m ethod was succes sfully applied for the simulta neous determination of 13 P F CAs and 9 potential precursors in bivalve shellfi sh tissue sam ples.

perfluorinated acids and their precursors; bivalve shellfish; sol id-p hase extraction (SP E); ultra f ast liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UFLC-MS/MS)

O652.1

A

1002-6630（2017）20-0248-08

2016-11-03

國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2014FY230100）

國(guó)佼（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橛袡C(jī)污染物安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)。E-mail：guoam630@outlook.com

*通信作者：譚志軍（1978—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：tanzj@ysfri.ac.cn

國(guó)佼, 郭萌萌, 吳海燕, 等. 雙固相萃取柱凈化-超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè) 定貝類組織中全氟羧酸及其前體物質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20)∶ 248-255. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720036. http∶//www.spkx.net.cn

GUO Jiao, GUO Mengmeng, WU Haiyan, et al. Simultaneous determination of perfl uorinated acids and their precursors in bivalve shellfi sh by double SPE columns purifi cation and ultra fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science,2017, 38(20)∶ 248-255. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720036. http∶//www.spkx.net.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630- 201720036