• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于單鏈抗體的呋喃唑酮 酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

    2017-10-11 11:36:36陳蔭楠陳東海林海虹石賢愛
    食品科學 2017年20期
    關(guān)鍵詞:呋喃唑酮單鏈單克隆

    陳 倩,陳蔭楠,2,陳東海,林海虹,石賢愛,3,*

    基于單鏈抗體的呋喃唑酮 酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

    陳 倩1,陳蔭楠1,2,陳東海1,林海虹1,石賢愛1,3,*

    (1.福州大學生物科學與工程學院,福建 福州 350108;2.泉州醫(yī)學高等專科學?;A(chǔ)醫(yī)學部,福建 泉州 362000;3.福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點實驗室,福建 福州 350108)

    目的:為快速檢測呋喃唑酮(furazolidone,F(xiàn)ZD)在動物性食品中的殘留量。方法:基于單鏈抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附實驗法建立了FZD檢測方法。結(jié)果:最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL,最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶500,一抗最佳反應(yīng)時間為60 min,二抗最佳反應(yīng)時間為45 min,四甲基聯(lián)苯胺最佳顯色時間為20 min。FZD檢測試劑盒在10~100 ng/mL范圍具有較好的線性關(guān)系,IC50值為13.01 ng/mL,檢出限為1.28 ng/mL,回收率為73.38%~84.52%。結(jié)論:與抗FZD單克隆抗體相比,所建立的檢測試劑盒檢測范圍更廣,且具有很高的靈敏度以及很好的特異性和穩(wěn)定性。

    呋喃唑酮;單鏈抗體;酶聯(lián)免疫檢測

    藥物殘留一直是影響食品安全的問題之一。硝基呋喃類藥物是一種人工合成的廣譜抗菌藥物[1-2],因具有良好的抗球蟲及抗菌作用[3],曾被廣泛應(yīng)用于家禽、水產(chǎn)等動物傳染病的預(yù)防與治療[4-5]。呋喃唑酮(furazolidone,F(xiàn)ZD)是硝基呋喃類藥物的一種,由于其具有嚴重的致癌、致突變等毒副作用[6],我國在2002年將其列為在動物飼養(yǎng)中禁止使用的藥物,規(guī)定在動物性食品中不得檢出[7-8]。

    目前,用于檢測FZD在動物性食品中殘留量的方法主要有分光光度法、高效液相色譜法[9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]、酶聯(lián)免疫吸附實驗法(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)[12-13]、熒光免疫法等。傳統(tǒng)的儀器法雖然能進行精確的定量檢測,但成本高,前處理繁瑣、操作復(fù)雜,無法滿足快速檢測大批量樣品的要求[14]?;诳乖贵w反應(yīng)的ELISA等快速免疫分析方法因其操作簡單、成本低和特異性強等優(yōu)點[15],成為快速檢測農(nóng)獸藥殘留相關(guān)研究的熱點。如Zhu Huaping等[16]通過間接競爭ELISA來檢測FZD及其代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ),檢測限為2.0 mg/L和2.5 mg/L。宋娟等[17]建立了間接競爭ELISA法來測定食品中呋喃它酮代謝物的含量,半抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration,IC50)值為1.86 ng/mL,樣品加標回收率為75.6%~112.2%。石賢愛等[18]在抗3-(4-羧基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑烷酮(3-{[(4-carboxyphenyl)methylene]-amino}-2-oxazolidinone,CPAOZ)和抗AOZ的單克隆抗體的基礎(chǔ)上,分別建立了ELISA檢測試劑盒。其中CPAOZ檢測試劑盒在1.0~100.0 ng/mL范圍具有較好的線性,IC50值為14.6 ng/mL,檢測限為6.56 ng/mL;AOZ檢測試劑盒在0.5~12.5 ng/mL范圍具有良好線性,IC50值為3.9 ng/mL,檢測限為0.45 ng/mL。陳蔭楠等[19]建立了抗FZD單克隆抗體的ELISA檢測方法,其檢測范圍為10~500 ng/mL,IC50值為0.06 μg/mL,檢出限為6.92 ng/mL。

    然而,使用該方法的前提是需要獲得相應(yīng)的抗體,其制備主要采用免疫動物獲得多克隆抗體血清或雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體。但是,多克隆抗體其免疫球蛋白類別及亞類不均一,特異性較差,無法實現(xiàn)穩(wěn)定的大批量生產(chǎn)[4]。而單克隆抗體雖然具有組分單一、靈敏度高、特異性強等明顯優(yōu)勢[20],但制備技術(shù)較復(fù)雜,周期長,應(yīng)用范圍受到局限。單鏈抗體是通過人工合成的親水性、柔性連接肽(Linker)將抗體重鏈可變區(qū)(variable region of heavy chain,VH)和輕鏈可變區(qū)(variable region of light chain,VL)連接形成重組抗體[21-22],它不包含抗體恒定區(qū),但仍能表現(xiàn)出和抗原的結(jié)合活性。相比于完整的單克隆抗體,單鏈抗體具有分子質(zhì)量小[23],免疫性低,穿透力強的特點[24-25],使其應(yīng)用范圍更廣,經(jīng)濟效益更大,是近年來的研究熱點[26-27]。如張倩[28]成功制備了具有良好免疫原性的抗鯽魚IgM單鏈抗體,并建立了間接ELISA檢測方法,重復(fù)性實驗的變異系數(shù)均小于10%,所建立的方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。本實驗建立了基于抗FZD單鏈抗體的間接競爭ELISA檢測法,并將其與基于單克隆抗體的相關(guān)方法進行比較,從而為實現(xiàn)FZD的低成本、可重復(fù)的免疫快速檢測提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    FZD單鏈抗體、呋喃唑酮雞卵清白蛋白偶聯(lián)物(furazolidone coupled with ovalbumin,F(xiàn)ZD-OVA)本實驗室制備保存(單鏈抗體制備方法同文獻[29]);FZD、呋喃它酮(furaltadone,F(xiàn)TD)、呋喃妥因(nitrofurantion,NFT)、呋喃西林(nitrofurazone,NFZ)、氨基脲(semicarbazide,SEM)、AOZ 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;HRP標記的抗His-tag抗體英國Abcam公司;HRP標記羊抗小鼠IgG(H+L) 美國Thermo公司;四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB) 北京天根公司;魚飼料 福建天馬公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SH-1000全波長酶標儀 日本Corona公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DHK-501A超級恒溫水槽 上海精宏公司;XH-C旋渦混合器 常州邁科諾儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 可溶性ScFv抗體的親和力分析

    通過間接競爭ELISA法分析純化后的單鏈抗體的親和力。1)用10 μg/mL FZD-OVA包被酶標板,4 ℃過夜;傾去包被液,含0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline with 0.05% Tween-20,PBST)洗滌3 次,5 min/次;5%的脫脂奶封閉過夜,洗滌。2)加一抗:將標準品溶液倍比稀釋后與經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)稀釋的ScFv抗體等體積混合,37 ℃孵育2 h后加板,100 μL/每孔,同時設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照組,37 ℃孵育2 h;傾去混合液,洗滌3 次;3)加二抗:每孔加入HRP標記的抗His-tag抗體(1∶5 000)100 μL,37 ℃孵育1 h,洗滌方法同上。4)顯色:每孔加入100 μL TMB,37 ℃避光反應(yīng)30 min。每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4溶液,終止反應(yīng),用酶標儀測定波長450 nm處吸光度(A450nm)。5)結(jié)果判定:結(jié)合率為縱坐標,以FZD的質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標,繪制競爭曲線,以A450nm值判斷抗FZD單鏈抗體與FZD的競爭反應(yīng)情況,判斷單鏈抗體的特異性。以抗FZD特異性抗體對FZD的競爭抑制率為縱坐標,以FZD質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標,繪制標準競爭曲線。在標準競爭曲線上計算出抑制率為50%時混合液中FZD的標準質(zhì)量濃度作為競爭抑制率IC50。結(jié)合率、抑制率按公式(1)、(2)計算:

    式中:A為加入不同質(zhì)量濃度的底物FZD的吸光度(A450nm);A0為不加底物FZD的吸光度(A450nm);A空白為不加底物FZD、不加抗血清的吸光度(A450nm)。

    抑制率/%=100%-結(jié)合率 (2)

    1.3.2 ScFv抗體的交叉反應(yīng)性分析

    分別將FTD、NFT、NFZ、SEM以及AOZ這5 種結(jié)構(gòu)類似物標準液倍比稀釋,每個質(zhì)量濃度取50 μL與等體積的ScFv抗體于37 ℃反應(yīng)2 h,其余步驟同間接競爭ELISA。最后以FTD、NFT、NFZ、SEM和AOZ的IC50與FZD的IC50百分比可得該單鏈抗體與各結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率按公式(3)計算:

    式中:IC50,FZD為當FZD對抗血清抑制率為50%時,F(xiàn)ZD的標準質(zhì)量濃度/(ng/mL);IC50,結(jié)構(gòu)類似物為當FZD結(jié)構(gòu)類似物對抗血清抑制率達到50%時,F(xiàn)ZD結(jié)構(gòu)類似物的標準質(zhì)量濃度/(ng/mL)。

    1.3.3 抗FZD酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

    1.3.3.1 最佳包被抗原及單鏈抗體工作質(zhì)量濃度的確定

    采用方陣實驗法,將重氮法制備的FZD-OVA作為包被抗原和抗FZD單鏈抗體分別做系列稀釋,抗原質(zhì)量濃度分別稀釋為10、5、2、1、0.2 μg/mL,按100 μL/孔包被在酶標板中,4 ℃過夜;用脫脂奶37 ℃封閉3 h;將單鏈抗體作100、200、500、1 000、2 000倍稀釋后加入酶標板中。其余步驟同1.3.1節(jié)。根據(jù)檢測得到的A值,確定實驗最佳的包被抗原和單鏈抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

    1.3.3.2 一抗最佳反應(yīng)時間的確定

    包被酶標板,4 ℃過夜,洗滌3 次后加脫脂奶封閉3 h。洗滌后,分別加入高濃度抗體(稀釋5倍)、低濃度抗體(稀釋20 倍)、陰性抗體(空質(zhì)粒表達的蛋白)、空白(PBS)(均設(shè)3 個平行)。設(shè)定一抗反應(yīng)時間分別為30、60、120 min。其余步驟同間接ELISA方法。根據(jù)讀取的A450nm,比較各個時間段對結(jié)果的影響,確定一抗的最佳作用時間。

    1.3.3.3 二抗最佳反應(yīng)時間的確定

    包被,封閉,選擇一抗的最佳反應(yīng)時間進行反應(yīng),一抗的梯度與1.3.3.2節(jié)中相同。分別設(shè)定二抗的反應(yīng)時間為30、45、60 min。其余步驟同間接ELISA方法。根據(jù)讀取的A450nm,比較各個時間段對結(jié)果的影響,確定二抗最佳時間。

    1.3.3.4 TMB顯色時間的確定

    在最優(yōu)的抗原抗體工作質(zhì)量濃度、一抗反應(yīng)時間、二抗反應(yīng)時間條件下,分別設(shè)定顯色時間為加入TMB后37 ℃反應(yīng)5、10、20、30 min。

    1.3.3.5 檢測方法的檢出限分析

    從包被的10 塊板中隨機選擇10 個孔,加入50 μL零標準品和50 μL稀釋到工作質(zhì)量濃度的抗FZD單鏈抗體,應(yīng)用建立的間接競爭ELISA法進行測定。求得10 個孔的標準品標準差,在標準曲線上對應(yīng)3倍標準差/A0的標準品質(zhì)量濃度即為此方法的檢出限,標準差按公式(4)、(5)計算:

    式中:Ai為第i孔底物FZD的吸光度(A450nm);A0為i 個孔吸光度(A450nm)的平均值。

    1.3.3.6 間接競爭ELISA檢測方法的精密度測試

    取3 個不同質(zhì)量濃度的FZD標準品,進行間接競爭ELISA分析,每個質(zhì)量濃度每天做1 次分析,綜合5 次測定的抑制率,求出變異系數(shù)。

    1.3.3.7 樣品加標回收率

    高血壓(hypertension)是體循環(huán)中的動脈血壓升高為主要特點,(收縮壓≥140毫米汞柱,舒張壓≥90毫米汞柱),可以出現(xiàn)靶器官的損害,如心、腦、腎等器官的功能出現(xiàn)器質(zhì)性損害的臨床綜合征[1-2]。高血壓患者大多數(shù)與自身體質(zhì)密切相關(guān),體質(zhì)學說屬于中醫(yī)范疇,頁數(shù)與辨證論治理論,先天性缺陷和體質(zhì)與后天吸收氣血精津液共同組成人的本源,直接影響人的疾病的預(yù)后情況[3-5]。所以必須根據(jù)患者自身條件和體質(zhì)采取特異性中醫(yī)護理方式對患者疾病的控制有著不可忽視的作用。本研究以辨體論治作為護理的基礎(chǔ)和前提,觀察體質(zhì)護理對高血壓病患者護理效果的評估,現(xiàn)報道如下。

    將空白魚飼料樣本研磨粉碎,過篩備用。取適量樣品于50 mL離心管中,按10.0、50.0、100.0 μg/g的添加量分別加入適量的FZD標準品。然后加入甲醇-乙腈(3∶7,V/V)提取液,劇烈振蕩30 min。靜置一段時間后,離心取上清液進行還原(方法同文獻[19])。待冷卻至室溫后采用間接競爭ELISA法進行檢測。最后,根據(jù)FZD競爭抑制標準曲線,計算加標回收率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ScFv抗體的親和力分析

    采用間接競爭ELISA法,檢測ScFv抗體的親和力。以FZD-OVA作為檢測抗原,與游離抗原FZD競爭結(jié)合抗體的結(jié)合位點。當FZD質(zhì)量濃度在10~100 ng/mL之間時,抑制率呈較好的線性關(guān)系,以FZD添加質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標,抑制率為縱坐標,擬合標準曲線后得到線性方程:y=42.24x+2.930 2(R2=0.990 2)。當抑制率為50%時,IC50值為13.01 ng/mL。陳蔭楠等[19]制備的單克隆抗體,其線性范圍為10~500 ng/mL,IC50值為60 ng/mL,與之相比(所采用的計算方法、樣品種類及樣品前處理方法均一樣),本實驗中所制備的單鏈抗體IC50值較小,靈敏度更高。

    2.2 ScFv抗體的交叉反應(yīng)性分析

    以FZD-OVA作為包被抗原,將FTD、NFT、NFZ、SEM和AOZ分別倍比稀釋,采用間接競爭ELISA法檢測,得出抗FZD單鏈抗體FZD-ScFv與各FZD結(jié)構(gòu)類似物的IC50值,計算出交叉反應(yīng)率,如表1所示,得出抗FZD單鏈抗體FZD-ScFv對5 種硝基呋喃抗生素的交叉反應(yīng)率均低于1%,有較好的特異性。但與陳蔭楠等[19]制備的單克隆抗體相比(交叉反應(yīng)率均低于0.01%),特異性稍差。

    表1 抗體與FZD結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)性的對比Table 1 Comparison in the cross-reactivity of antibodies against analoogguueess

    2.3 最佳反應(yīng)條件的確定

    2.3.1 最佳包被抗原及單鏈抗體工作質(zhì)量濃度的確定

    采用方陣滴定法來確定最佳的包被抗原濃度與抗體稀釋倍數(shù)。實驗采用間接非競爭ELISA測定,得出最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL,在此包被質(zhì)量濃度條件下,抗體稀釋倍數(shù)在1∶500時吸光度(A450nm)在1.0附近,故選擇1∶500作為抗體最佳稀釋倍數(shù)。

    2.3.2 一抗最佳反應(yīng)時間的確立

    用2 μg/mL的FZD-OVA包被酶標板,一抗分別為FZD-ScFv稀釋5 倍、FZD-ScFv稀釋20 倍、陰性對照(空質(zhì)粒表達的蛋白)、空白(PBS)4 個梯度。分別在37 ℃反應(yīng)30、60、120 min,二抗孵育1 h,TMB顯色30 min,如圖1所示。

    圖1 一抗反應(yīng)時間的考察Fig. 1 Optimum reaction time for primary antibody

    從圖1可以看出,隨著反應(yīng)時間的延長,吸光度也不斷升高。令RAbs=(A1-A0)/(A2-A0),其中A1為稀釋5 倍的吸光度,A2為稀釋20 倍的吸光度,A0為陰性的吸光度。陰性空質(zhì)粒表達的蛋白吸光度也隨時間增加,30min的吸光度為0.147,120min的吸光度為0.223。30、60、120 min時,RAbs值分別為1.34、1.52、1.42。RAbs,60min值最大,且空白對照低,因此,一抗反應(yīng)60 min最佳。

    2.3.3 二抗最佳反應(yīng)時間的確立

    一抗反應(yīng)60 min后,加入二抗37 ℃分別反應(yīng)30、45、60 min,如圖2所示。在這3 個時間段中,隨著二抗反應(yīng)時間的延長,吸光度不斷升高,60 min時吸光度達到最高值,但比較RAbs值發(fā)現(xiàn),RAbs,45min值最大,因此二抗最佳反應(yīng)時間為45 min。

    圖2 二抗反應(yīng)時間的考察Fig. 2 Optimum reaction time for secondary antibody

    2.3.4 TMB顯色時間的確立

    圖3 TMB反應(yīng)時間的考察Fig. 3 Optimum reaction time for TMB

    一抗反應(yīng)60 min,二抗反應(yīng)45 min,分別顯色5、10、20、30 min后,如圖3所示,單鏈抗體稀釋5 倍時,30 min時吸光度最高,為1.906。隨著顯色時間的延長,吸光度也出現(xiàn)了較大幅度的增加,但顯色20 min和30 min的吸光度差別不大,但RAbs,20min大于RAbs,30min,同時鑒于該試劑盒是用于快速檢測的,選擇20 min即可。

    2.3.5 檢出限分析

    從包被好的酶標孔板中隨機挑選10 孔,按建立好的間接競爭ELISA模式做零標準的實驗,求所得10 個A值的標準差,在標準曲線上對應(yīng)3 倍標準差/A0的標準品質(zhì)量濃度即為此方法的檢出限。由此得到3 倍標準差/A0位置相應(yīng)的抑制率和檢出限為7.47%和1.28 ng/mL,并與陳蔭楠等[19]制備的抗FZD單克隆抗體的相應(yīng)數(shù)值比較如表2所示。本實驗制備的抗FZD單鏈抗體檢出限更低,檢測范圍更廣,效果更佳。

    表2 檢出限測試對比Table 2 Comparison in the detection limit of detection kit among different antibodies

    2.3.6 間接競爭ELISA檢測方法的精密度結(jié)果

    重復(fù)做5 次FZD的競爭抑制曲線,每次做3 個質(zhì)量濃度,每個質(zhì)量濃度做3 個平行孔,以平行孔的均值作為每次每個質(zhì)量濃度條件下的抑制率,對比結(jié)果見表3。

    表3 精密度測試結(jié)果Table 3 Test of detection precision of detection kit based on single chain fragment antibody

    表4 精密度對比結(jié)果Table 4 Comparison in detection precision of detection kit among different antibodies

    結(jié)合表3、4可以看出,每個質(zhì)量濃度條件下的變異系數(shù)均小于10%,平均誤差為3.83%。這比陳蔭楠等[19]建立的檢測方法的平均誤差小,重復(fù)性更好。

    2.3.7 樣品加標回收率的測定結(jié)果

    往不含F(xiàn)ZD的飼料中分別加入FZD使其添加量為10.0、50.0、100.0 μg/g,樣品經(jīng)提取后進行ELISA檢測,每個添加量重復(fù)檢測3 次,計算加標回收率,結(jié)果見表5。數(shù)據(jù)顯示,F(xiàn)ZD樣品的加標回收率為73.38%~84.52%,變異系數(shù)6.81%~9.41%。而陳蔭楠等[19]所制得單克隆抗體的FZD樣品加標回收率為76.84%~88.31%,變異系數(shù)9.36%~15.79%,二者相比樣品加標回收率差別不大,但本實驗所制得FZD單鏈抗體變異系數(shù)更小。

    表5 FZD加標回收率結(jié)果Table 5 Recovery rates of FZD from samples of detection kit based on single chain fragment antibody

    表6 加標回收率對比結(jié)果Table 6 Comparison in recovery rate of detection kits among different antibodies

    3 結(jié) 論

    用純化后獲得的單鏈抗體建立的間接競爭ELISA檢測方法的檢測范圍為10~100 ng/mL,IC50值為13.01 ng/mL。與FZD結(jié)構(gòu)類似物(FTD、NFT、NFZ、SEM、AOZ)的交叉反應(yīng)率均小于1%,說明單鏈抗體的靈敏度和特異性均很高。

    建立了基于抗FZD單鏈抗體的間接競爭ELISA檢測方法,最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL,最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶500。在一抗反應(yīng)60 min、二抗反應(yīng)45 min、TMB顯色20 min條件下,計算得到檢出限為1.28 ng/mL。所建立的方法重現(xiàn)性較好,平均誤差為3.83%,加標回收率為73.38%~84.52%,變異系數(shù)為6.81%~9.41%。

    綜上所述,相比單克隆抗體,本實驗制備的單鏈抗體IC50值和檢出限較小,平均誤差較小,變異系數(shù)較小,樣品加標回收率差別不大,雖然交叉反應(yīng)率稍低于單克隆抗體,但足以滿足檢測的要求,且靈敏度更高,檢測范圍更廣,穩(wěn)定性較好。

    利用基因工程手段制備單鏈抗體免疫原性低,對人體不會引起抗異種蛋白反應(yīng),半衰期短,且分離純化方法簡單,制備所需時間短[30-31],同時抗體易于改造以用于不同用途。因此,基于單鏈抗體的免疫檢測方法具有更廣的應(yīng)用范圍和應(yīng)用前景。

    [1] 周克楠, 唐勇, 藍彩鳳, 等. 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體及其新型免疫層析檢測試紙條的制備[J]. 中國生物制品學雜志, 2014, 27(7)∶927-931. DOI∶10.13200/j.cnki.cjb.000454.

    [2] 陳威風, 陳敬鑫. 肉制品中硝基呋喃類藥物殘留的研究進展[J]. 肉類研究, 2011, 25(12)∶ 53-57. DOI∶10.3969/j.issn.1001-8123.2011.12.014.

    [3] 葛寶坤, 王云鳳, 賀信. 高效液相色譜法測定雞肉、水產(chǎn)品中呋喃西林和呋喃唑酮殘留量的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2002, 12(6)∶661-662. DOI∶10.3969/j.issn.1004-8685.2002.06.008.

    [4] 劉迎春, 蔣蔚, 陳永軍, 等. 呋喃它酮代謝物人工抗原及多克隆抗體的制備[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2013, 45(2)∶ 69-73.

    [5] 傅國, 李寧毅. 硝基呋喃類和硝基咪唑類藥物的研究進展 [J]. 青島大學醫(yī)學院學報, 2003, 39(4)∶ 486-488. DOI∶10.11712/qdyxy200304061.

    [6] ALI B H. Pharmacological, toxicol ogical and therapeutic properties of furazolidone∶ some recent research[J]. Veterinary Research Communications, 1999, 23(6)∶ 18-23. DO I∶10.1023/A∶1006333608012.

    [7] 李子穎, 鄭婷, 袁志剛, 等. 呋喃唑酮代謝物AOZ的抗體制備及初步應(yīng)用[J]. 食品科技, 2013, 38(4)∶ 309-313. DOI∶10.13684/j.cnki.spkj.2013.04.070.

    [8] 王烈喜, 陳黎斌, 姚玉靜. 呋喃妥因代謝物海特因單克隆抗體的制 備[J]. 廣東化工, 2015, 42(1)∶ 41-42. DOI∶10.3969/j.issn.1007-1865.2015.01.020.

    [9] KANIOU I, ZACHARIADIS G, KAL LIGAS G, et al. Separation and determination of carbadox, nitrofurazone, nitrofuratoin, furazolidone,furaltadone in their mixtures by thin layer and high performance liquid chromatography[J]. Journal of Liquid Chromatography, 2012, 17(6)∶1385-1398.

    [10] 朱堅. 高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測肉和水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的代謝物殘留量[J]. 質(zhì)譜學報, 2003, 24(增刊1)∶ 121-122.DO I∶10.3969/j.issn.1004-2997.2003.z1.061.

    [11] 劉輝, 梁德沛, 花鐵果, 等. 食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留檢測技術(shù)的研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報, 2013, 4(2)∶384-389.

    [12] 王重慶. 分子免疫學基 礎(chǔ)[M]. 北京∶ 北京大學出版社, 2008∶ 4.

    [13] 徐順清, 劉衡川. 免疫學檢驗[M]. 北京∶ 人民衛(wèi)生出版社, 2015∶ 15.

    [14] 任海濤, 沈玉棟, 徐振林, 等. 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附分析方法[J]. 分析化學研究報告, 20 15, 40(5)∶ 745-751.DOI∶10.3724/SP.J.1096.2012.10409.

    [15] LI J, LIU J, ZHANG H C, et al. Broad specificity indirect competitive immunoassay for determination of nitrofurans in animal feeds[J]. Analytica Chimica Acta, 2010, 678(1)∶ 1-6. DOI∶10.1016/j.aca.2010.07.025.

    [16] ZHU H P, L IU T T, LIU B, et al. Antigens synthesis and antibodies preparation for furazolidone and its metabolite 3-amino-2-oxazolidinone[J]. Chinese Chemical Lette rs, 2010, 21(9)∶ 1049-1052.DOI∶10.1016/j.cclet.2010.04.001.

    [17] 宋娟, 王玉珍, 鄧安平. 測定食品中呋喃它酮代謝物3-氨基-5-嗎啉甲基-2-惡唑烷酮的酶聯(lián)免疫吸附法[J]. 食品安全質(zhì)量檢測 學報,2012, 3(5)∶ 77-81.

    [18] 石賢愛, 裴世鋒, 李向楠, 等. 基于不同半抗原的呋喃唑酮代謝物免疫 檢測方法的建立與比較[J]. 食品科學, 2014, 35(8)∶ 174-180.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201408035.

    [19] 陳蔭楠, 陳華, 石賢愛, 等. 抗呋喃唑酮單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[J]. 食品科學, 2016, 37(3)∶ 157-163. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201603029.

    [20] 劉萍, 陳苗苗, 劉學榮, 等. 單克隆抗體研究進展[J]. 中國畜牧獸 醫(yī),2012, 39(1)∶ 67-70. DOI∶10.3969/j.issn.1671-7236.2012.01.016.

    [21] 郭海濤, 楊光勇, 何光志. 單鏈抗體的研究進展及其應(yīng)用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2015(13)∶ 76-79. DOI∶10.13881/j.cnki.hljxmsy.2015.1053.

    [22] 齊永華, 董永軍, 寧紅梅, 等. 單鏈抗體技術(shù)在農(nóng)獸藥殘留檢測方面的研究進展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2011, 42(9)∶ 7-11. DOI∶10.3969/j.issn.1005-9369.2011.09.002.

    [23] 劉燕. 單鏈抗體的研究進展及其應(yīng)用前景[J]. 2003, 37(11)∶ 42-44.DOI∶10.3969/j.issn.1002-1280.2003.11.012.

    [24] 李菁, 林彤, 宋帥, 等. 基因工程抗體研究進展[J]. 生物技術(shù)通報,2009, 25(10)∶ 40-44. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201603029.

    [25] 霍萍萍, 張聰敏, 趙寶華. 單鏈抗體制備技術(shù)及應(yīng)用的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志, 2011, 27(10)∶ 1154-1156. DOI∶10.13423/j.cnki.cjcmi. 006175.

    [26] 王秀紅, 周素芳. 基因工程抗體研究進展[J]. 生物技術(shù)通訊, 2007,18(2)∶ 304-306. DOI∶10.3969/j.issn.1009-0002.2007.02.039.

    [27] 馬穎, 鄒全明. 單鏈抗體及其在生物醫(yī)學中的應(yīng)用[J]. 免疫學雜志,2006, 22(增刊1)∶ 1-4. DOI∶10.3969/j.issn.1000-8861.2006.z1.001.

    [28] 張倩. 鯽魚IgM單鏈抗體的制備及嗜水氣單胞菌抗體間接ELISA檢測方法的建立[D]. 南京∶ 南京農(nóng)業(yè)大學, 2013. DOI∶10.7666/d.Y252734 1.

    [29] 田江紅. 核糖體展示人單鏈抗體庫的構(gòu)建及抗HCV NS5B蛋白的ScFv的篩選[D]. 西安∶ 第四軍醫(yī)大學, 2010.

    [30] 王溪橋. 大容量人源肝癌核糖體展示單鏈抗體庫的構(gòu)建[D]. 蘭州∶蘭州大學, 2010.

    [31] 韓亞萍. 大容量人源胃癌核糖體展示抗體庫的構(gòu)建、鑒定及篩選[D].蘭州∶ 蘭州大學, 2009.

    Establishment of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Method for Detecting Furazolidone Based on Single Chain Fragment Antibody

    CHEN Qian1, CHEN Yinnan1,2, CHEN Donghai1, LIN Haihong1, SHI Xian’ai1,3,*
    (1. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China;2. Basic Medicine Programme, Quanzhou Medical College, Quanzhou 362000, China;3. Fujian Key Laboratory of Medical Instrument and Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350108, China)

    Aim∶ This study aimed to develop an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method for detecting the residues of furazolidone (FZD) in animal food. Method∶ The indirect competitive ELISA method based on single chain fragment antibody was established. Result∶ The optimal antigen mass concentration was 2 μg/mL, and the optimal antibody dilution ratio was 1∶500, and the optimal reaction time of primary antibody, the optimal reaction time of secondary antibody and the optimal reaction time of TMB were 60 min, 45 min, and 20 min, respectively. The good linearity was seen in the range of 10-100 ng/mL of FZD, with the IC50value being 13.01 ng/mL, and the lowest detection limit (LOD) being 1.28 ng/mL, and the recovery rates being 73.38%-84.52%. Conclusion∶ Compared with the monoclonal antibody against FZD, the detection kit based on single chain fragment antibody displayed wider detection range, higher sensitivity, better specifi city and detection stability.

    furazolidone; single chain fragment antibody; enzyme-linked immunosorbent assay

    TS207.3

    A

    1002-6630(2017)20-0242-06

    陳倩, 陳蔭楠, 陳東海, 等. 基于單鏈抗體的呋喃唑酮酶聯(lián)免疫檢測方法的建立[J]. 食品科學, 2017, 38(20): 242-247.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720035. http://www.spkx.net.cn

    CHEN Qian, CHEN Yinnan, CHEN Donghai, et al. Establishment of enzyme-linked immunosorbent assay method for detecting furazolidone based on single chain fragment antibody[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 242-247. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720035. http∶//www.spkx.net.cn

    2017-01-06

    國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(201205022-3);福建省科技重大專項(2013NZ0003);福建省海洋與漁業(yè)廳重點項目(閩海漁合同[2010]2-27號)

    陳倩(1991—),女,碩士,研究方向為抗體研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化。E-mail:121131347@qq.com

    *通信作者:石賢愛(1971—),男,教授,博士,研究方向為高靈敏度生物檢測。E-mail:shixa@fzu.edu.cn

    DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720035

    猜你喜歡
    呋喃唑酮單鏈單克隆
    加味黃術(shù)湯聯(lián)合吲哚美辛呋喃唑酮栓治療肛裂術(shù)后疼痛、水腫的臨床觀察
    單克隆抗體在新型冠狀病毒和其他人冠狀病毒中的研究進展
    逐步添加法制備單鏈環(huán)狀DNA的影響因素探究*
    國家藥監(jiān)局發(fā)布停止生產(chǎn)銷售使用含呋喃唑酮復(fù)方制劑的公告[2019年02月15日 發(fā)布]
    中老年保健(2019年4期)2019-06-12 12:08:50
    呋喃唑酮復(fù)方制劑停用有因
    鹽酸克倫特羅生物素化單鏈抗體在大腸埃希氏菌中的表達
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    急性淋巴細胞白血病單鏈抗體(scFv)的篩選與鑒定
    草魚還在吃“禁藥”又被檢出危害殘留
    TSH受體單克隆抗體研究進展
    欧美日韩亚洲高清精品| 中文字幕制服av| 91字幕亚洲| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲男人天堂网一区| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品免费一区二区三区在线 | 免费少妇av软件| 久久精品国产a三级三级三级| 少妇粗大呻吟视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲欧美日韩高清在线视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久国产亚洲av麻豆专区| 色老头精品视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲片人在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久久久国内视频| a级毛片在线看网站| 久久香蕉激情| 国产精品成人在线| 国产精品久久电影中文字幕 | 欧美日韩av久久| 亚洲全国av大片| 人妻 亚洲 视频| 亚洲男人天堂网一区| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久亚洲真实| 很黄的视频免费| 大片电影免费在线观看免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲色图av天堂| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日韩免费av在线播放| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产主播在线观看一区二区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲美女黄片视频| 飞空精品影院首页| 波多野结衣一区麻豆| 欧美成狂野欧美在线观看| 电影成人av| 国产亚洲精品久久久久5区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 满18在线观看网站| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品乱久久久久久| 国产高清国产精品国产三级| 两个人看的免费小视频| 看片在线看免费视频| 757午夜福利合集在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 999久久久国产精品视频| 搡老岳熟女国产| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| ponron亚洲| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲视频免费观看视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 五月开心婷婷网| 欧美激情高清一区二区三区| 大型av网站在线播放| 日韩大码丰满熟妇| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久99一区二区三区| 亚洲综合色网址| a级毛片黄视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产精品免费一区二区三区在线 | 丝袜人妻中文字幕| 制服人妻中文乱码| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久久国产成人精品二区 | 免费黄频网站在线观看国产| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 美女福利国产在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久久久国内视频| 国产成人免费无遮挡视频| 好男人电影高清在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美乱码精品一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 亚洲精品自拍成人| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 免费看十八禁软件| 9色porny在线观看| 黄色 视频免费看| 国产午夜精品久久久久久| 女警被强在线播放| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久天堂一区二区三区四区| 99热国产这里只有精品6| 一级毛片高清免费大全| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品成人在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 飞空精品影院首页| 中文字幕制服av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产午夜精品久久久久久| av超薄肉色丝袜交足视频| 黄色片一级片一级黄色片| 在线播放国产精品三级| 高清欧美精品videossex| 老熟女久久久| cao死你这个sao货| 男女高潮啪啪啪动态图| 18禁观看日本| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 看片在线看免费视频| 村上凉子中文字幕在线| 国产黄色免费在线视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 成年动漫av网址| 日韩大码丰满熟妇| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产在线观看jvid| 国产精华一区二区三区| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲片人在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 大陆偷拍与自拍| 成年女人毛片免费观看观看9 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| e午夜精品久久久久久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 黄频高清免费视频| 欧美激情高清一区二区三区| 精品久久久久久,| 国产在线一区二区三区精| 在线观看一区二区三区激情| 欧美激情 高清一区二区三区| 免费观看人在逋| 亚洲精品自拍成人| 夜夜夜夜夜久久久久| 免费在线观看亚洲国产| www.熟女人妻精品国产| 色综合欧美亚洲国产小说| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 丝袜在线中文字幕| 搡老岳熟女国产| 成在线人永久免费视频| 一级作爱视频免费观看| 国产精品久久电影中文字幕 | 美女高潮到喷水免费观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲中文av在线| 国产熟女午夜一区二区三区| bbb黄色大片| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久人妻熟女aⅴ| 热99re8久久精品国产| 男人舔女人的私密视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产成人精品在线电影| 亚洲熟女精品中文字幕| 黄片播放在线免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产男女超爽视频在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美色视频一区免费| 国产又色又爽无遮挡免费看| 欧美午夜高清在线| 高清黄色对白视频在线免费看| 三级毛片av免费| 久久久久久久久免费视频了| 97人妻天天添夜夜摸| 麻豆成人av在线观看| 亚洲综合色网址| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| aaaaa片日本免费| 日日爽夜夜爽网站| 韩国精品一区二区三区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产精品九九99| 亚洲一区二区三区欧美精品| www.精华液| 搡老熟女国产l中国老女人| 无遮挡黄片免费观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 老鸭窝网址在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产在线观看jvid| 天堂√8在线中文| 国产精品成人在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 成人永久免费在线观看视频| 不卡一级毛片| 99久久人妻综合| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产精品永久免费网站| 91九色精品人成在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 国产欧美亚洲国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 欧美中文综合在线视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 色在线成人网| 精品国产乱码久久久久久男人| 最新在线观看一区二区三区| 无限看片的www在线观看| 午夜福利欧美成人| 亚洲成a人片在线一区二区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产1区2区3区精品| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 久热这里只有精品99| 美女 人体艺术 gogo| 一级黄色大片毛片| 久久99一区二区三区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产av一区二区精品久久| 三级毛片av免费| 国产视频一区二区在线看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一a级毛片在线观看| 无人区码免费观看不卡| 国产99白浆流出| 日本a在线网址| 亚洲精品av麻豆狂野| 两个人免费观看高清视频| 精品无人区乱码1区二区| 一级黄色大片毛片| cao死你这个sao货| xxx96com| 曰老女人黄片| 一级毛片精品| 午夜激情av网站| 黄片播放在线免费| 91九色精品人成在线观看| 18禁观看日本| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲综合色网址| 999精品在线视频| 久久中文字幕人妻熟女| 伦理电影免费视频| ponron亚洲| 男女之事视频高清在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 男人的好看免费观看在线视频 | 女人精品久久久久毛片| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 免费不卡黄色视频| av不卡在线播放| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品久久久久久久毛片微露脸| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久ye,这里只有精品| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 天天添夜夜摸| 91国产中文字幕| xxxhd国产人妻xxx| av线在线观看网站| 国产免费现黄频在线看| 一级作爱视频免费观看| 91九色精品人成在线观看| 天天添夜夜摸| 成人国语在线视频| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久草成人影院| 亚洲专区字幕在线| 啦啦啦免费观看视频1| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲精品久久午夜乱码| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品免费一区二区三区在线 | 久久这里只有精品19| 一级毛片高清免费大全| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲avbb在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 色尼玛亚洲综合影院| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 丰满的人妻完整版| 操出白浆在线播放| av不卡在线播放| 两个人免费观看高清视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲伊人色综图| 国产午夜精品久久久久久| 黄片大片在线免费观看| 午夜成年电影在线免费观看| 热99国产精品久久久久久7| av视频免费观看在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 久久ye,这里只有精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久中文字幕一级| 欧美成人免费av一区二区三区 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品九九99| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美不卡视频在线免费观看 | 一本综合久久免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美精品一区二区免费开放| 看黄色毛片网站| 国产精品国产av在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 在线观看免费视频日本深夜| 极品教师在线免费播放| 国产亚洲欧美98| 精品福利观看| 久久狼人影院| a级毛片在线看网站| 免费观看精品视频网站| 韩国精品一区二区三区| 久久99一区二区三区| xxx96com| 国产深夜福利视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 制服人妻中文乱码| 婷婷成人精品国产| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 在线观看免费午夜福利视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 后天国语完整版免费观看| 日日爽夜夜爽网站| 国产一区在线观看成人免费| 两性夫妻黄色片| av不卡在线播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品第一国产精品| 高清视频免费观看一区二区| 欧美最黄视频在线播放免费 | 国产精品av久久久久免费| 亚洲国产欧美网| 国产精品一区二区在线观看99| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲熟妇熟女久久| 免费观看精品视频网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 91在线观看av| 国产伦人伦偷精品视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 老鸭窝网址在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美日韩精品网址| 十八禁人妻一区二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 成人手机av| 国产精品久久久久久精品古装| 中文欧美无线码| 999久久久精品免费观看国产| 久久久久国内视频| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产免费现黄频在线看| √禁漫天堂资源中文www| 99国产精品99久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 日韩欧美一区视频在线观看| a在线观看视频网站| 最新美女视频免费是黄的| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久久国产成人精品二区 | 12—13女人毛片做爰片一| 人成视频在线观看免费观看| 9191精品国产免费久久| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 老司机福利观看| av天堂在线播放| 69精品国产乱码久久久| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 欧美性长视频在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲精品乱久久久久久| 成人国产一区最新在线观看| 18在线观看网站| 女性被躁到高潮视频| 极品教师在线免费播放| 黄色怎么调成土黄色| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲精品自拍成人| 韩国av一区二区三区四区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久久国产成人精品二区 | 波多野结衣av一区二区av| 免费不卡黄色视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 看黄色毛片网站| 久久久国产欧美日韩av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| av网站免费在线观看视频| 一本大道久久a久久精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 黄色成人免费大全| 51午夜福利影视在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久香蕉国产精品| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产主播在线观看一区二区| 国产成人欧美在线观看 | 欧美丝袜亚洲另类 | 精品国内亚洲2022精品成人 | 精品国产美女av久久久久小说| 中亚洲国语对白在线视频| 在线播放国产精品三级| ponron亚洲| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 男人舔女人的私密视频| 男女下面插进去视频免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 国产av又大| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 女人被狂操c到高潮| av欧美777| 欧美精品av麻豆av| 在线天堂中文资源库| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产色视频综合| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| av片东京热男人的天堂| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产单亲对白刺激| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久这里只有精品19| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美日韩福利视频一区二区| 麻豆乱淫一区二区| 满18在线观看网站| 99国产精品一区二区三区| 天天添夜夜摸| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲av电影在线进入| 精品高清国产在线一区| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲在线自拍视频| 热99久久久久精品小说推荐| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品亚洲成国产av| 一进一出抽搐动态| 成人av一区二区三区在线看| 男女下面插进去视频免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| а√天堂www在线а√下载 | 国产高清激情床上av| 一级片'在线观看视频| 国产一区在线观看成人免费| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲成人免费av在线播放| 国产区一区二久久| 12—13女人毛片做爰片一| 久99久视频精品免费| 男人舔女人的私密视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产深夜福利视频在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 69精品国产乱码久久久| 亚洲欧美激情在线| 69av精品久久久久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美精品av麻豆av| 欧美黑人精品巨大| 大片电影免费在线观看免费| 一级a爱片免费观看的视频| 十分钟在线观看高清视频www| 男女午夜视频在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产深夜福利视频在线观看| 日韩有码中文字幕| 国产高清视频在线播放一区| 男人操女人黄网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 老司机亚洲免费影院| 免费观看人在逋| 高清欧美精品videossex| 国产有黄有色有爽视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 少妇的丰满在线观看| av线在线观看网站| 成人黄色视频免费在线看| 动漫黄色视频在线观看| 69av精品久久久久久| 国产高清videossex| 天天影视国产精品| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲黑人精品在线| 一级黄色大片毛片| 久久性视频一级片| 亚洲色图av天堂| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 成年动漫av网址| 国产单亲对白刺激| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲成a人片在线一区二区| 日本五十路高清| 国产成人免费观看mmmm| 波多野结衣av一区二区av| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久影院123| 国产免费男女视频| 欧美激情高清一区二区三区| 美国免费a级毛片| 久久人妻熟女aⅴ| 欧美性长视频在线观看| 免费观看人在逋| 色播在线永久视频| 91成年电影在线观看| 9191精品国产免费久久| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产av一区二区精品久久| 国产男女内射视频| 韩国精品一区二区三区| 一进一出抽搐动态| 老熟女久久久| 大香蕉久久成人网| 亚洲一区中文字幕在线| 黄频高清免费视频| 女性被躁到高潮视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| av欧美777| 成人三级做爰电影| 久久久精品免费免费高清| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 美女福利国产在线| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 黄片大片在线免费观看| 老熟女久久久| 在线av久久热| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 91成年电影在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 女警被强在线播放| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲avbb在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 色综合婷婷激情| 亚洲精品自拍成人| www.自偷自拍.com| 多毛熟女@视频| 国产一区二区激情短视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 丝袜人妻中文字幕| 男人舔女人的私密视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | www.自偷自拍.com| 人妻久久中文字幕网| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产激情欧美一区二区| 大陆偷拍与自拍| 黄色成人免费大全| 久99久视频精品免费| 精品视频人人做人人爽| 免费观看精品视频网站| 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看. | 日日夜夜操网爽| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 成在线人永久免费视频| 欧美日韩av久久|