• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于單鏈抗體的呋喃唑酮 酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

    2017-10-11 11:36:36陳蔭楠陳東海林海虹石賢愛
    食品科學 2017年20期
    關(guān)鍵詞:呋喃唑酮單鏈單克隆

    陳 倩,陳蔭楠,2,陳東海,林海虹,石賢愛,3,*

    基于單鏈抗體的呋喃唑酮 酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

    陳 倩1,陳蔭楠1,2,陳東海1,林海虹1,石賢愛1,3,*

    (1.福州大學生物科學與工程學院,福建 福州 350108;2.泉州醫(yī)學高等專科學?;A(chǔ)醫(yī)學部,福建 泉州 362000;3.福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點實驗室,福建 福州 350108)

    目的:為快速檢測呋喃唑酮(furazolidone,F(xiàn)ZD)在動物性食品中的殘留量。方法:基于單鏈抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附實驗法建立了FZD檢測方法。結(jié)果:最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL,最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶500,一抗最佳反應(yīng)時間為60 min,二抗最佳反應(yīng)時間為45 min,四甲基聯(lián)苯胺最佳顯色時間為20 min。FZD檢測試劑盒在10~100 ng/mL范圍具有較好的線性關(guān)系,IC50值為13.01 ng/mL,檢出限為1.28 ng/mL,回收率為73.38%~84.52%。結(jié)論:與抗FZD單克隆抗體相比,所建立的檢測試劑盒檢測范圍更廣,且具有很高的靈敏度以及很好的特異性和穩(wěn)定性。

    呋喃唑酮;單鏈抗體;酶聯(lián)免疫檢測

    藥物殘留一直是影響食品安全的問題之一。硝基呋喃類藥物是一種人工合成的廣譜抗菌藥物[1-2],因具有良好的抗球蟲及抗菌作用[3],曾被廣泛應(yīng)用于家禽、水產(chǎn)等動物傳染病的預(yù)防與治療[4-5]。呋喃唑酮(furazolidone,F(xiàn)ZD)是硝基呋喃類藥物的一種,由于其具有嚴重的致癌、致突變等毒副作用[6],我國在2002年將其列為在動物飼養(yǎng)中禁止使用的藥物,規(guī)定在動物性食品中不得檢出[7-8]。

    目前,用于檢測FZD在動物性食品中殘留量的方法主要有分光光度法、高效液相色譜法[9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]、酶聯(lián)免疫吸附實驗法(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)[12-13]、熒光免疫法等。傳統(tǒng)的儀器法雖然能進行精確的定量檢測,但成本高,前處理繁瑣、操作復(fù)雜,無法滿足快速檢測大批量樣品的要求[14]?;诳乖贵w反應(yīng)的ELISA等快速免疫分析方法因其操作簡單、成本低和特異性強等優(yōu)點[15],成為快速檢測農(nóng)獸藥殘留相關(guān)研究的熱點。如Zhu Huaping等[16]通過間接競爭ELISA來檢測FZD及其代謝物3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ),檢測限為2.0 mg/L和2.5 mg/L。宋娟等[17]建立了間接競爭ELISA法來測定食品中呋喃它酮代謝物的含量,半抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration,IC50)值為1.86 ng/mL,樣品加標回收率為75.6%~112.2%。石賢愛等[18]在抗3-(4-羧基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑烷酮(3-{[(4-carboxyphenyl)methylene]-amino}-2-oxazolidinone,CPAOZ)和抗AOZ的單克隆抗體的基礎(chǔ)上,分別建立了ELISA檢測試劑盒。其中CPAOZ檢測試劑盒在1.0~100.0 ng/mL范圍具有較好的線性,IC50值為14.6 ng/mL,檢測限為6.56 ng/mL;AOZ檢測試劑盒在0.5~12.5 ng/mL范圍具有良好線性,IC50值為3.9 ng/mL,檢測限為0.45 ng/mL。陳蔭楠等[19]建立了抗FZD單克隆抗體的ELISA檢測方法,其檢測范圍為10~500 ng/mL,IC50值為0.06 μg/mL,檢出限為6.92 ng/mL。

    然而,使用該方法的前提是需要獲得相應(yīng)的抗體,其制備主要采用免疫動物獲得多克隆抗體血清或雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體。但是,多克隆抗體其免疫球蛋白類別及亞類不均一,特異性較差,無法實現(xiàn)穩(wěn)定的大批量生產(chǎn)[4]。而單克隆抗體雖然具有組分單一、靈敏度高、特異性強等明顯優(yōu)勢[20],但制備技術(shù)較復(fù)雜,周期長,應(yīng)用范圍受到局限。單鏈抗體是通過人工合成的親水性、柔性連接肽(Linker)將抗體重鏈可變區(qū)(variable region of heavy chain,VH)和輕鏈可變區(qū)(variable region of light chain,VL)連接形成重組抗體[21-22],它不包含抗體恒定區(qū),但仍能表現(xiàn)出和抗原的結(jié)合活性。相比于完整的單克隆抗體,單鏈抗體具有分子質(zhì)量小[23],免疫性低,穿透力強的特點[24-25],使其應(yīng)用范圍更廣,經(jīng)濟效益更大,是近年來的研究熱點[26-27]。如張倩[28]成功制備了具有良好免疫原性的抗鯽魚IgM單鏈抗體,并建立了間接ELISA檢測方法,重復(fù)性實驗的變異系數(shù)均小于10%,所建立的方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。本實驗建立了基于抗FZD單鏈抗體的間接競爭ELISA檢測法,并將其與基于單克隆抗體的相關(guān)方法進行比較,從而為實現(xiàn)FZD的低成本、可重復(fù)的免疫快速檢測提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    FZD單鏈抗體、呋喃唑酮雞卵清白蛋白偶聯(lián)物(furazolidone coupled with ovalbumin,F(xiàn)ZD-OVA)本實驗室制備保存(單鏈抗體制備方法同文獻[29]);FZD、呋喃它酮(furaltadone,F(xiàn)TD)、呋喃妥因(nitrofurantion,NFT)、呋喃西林(nitrofurazone,NFZ)、氨基脲(semicarbazide,SEM)、AOZ 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;HRP標記的抗His-tag抗體英國Abcam公司;HRP標記羊抗小鼠IgG(H+L) 美國Thermo公司;四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine,TMB) 北京天根公司;魚飼料 福建天馬公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    SH-1000全波長酶標儀 日本Corona公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DHK-501A超級恒溫水槽 上海精宏公司;XH-C旋渦混合器 常州邁科諾儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 可溶性ScFv抗體的親和力分析

    通過間接競爭ELISA法分析純化后的單鏈抗體的親和力。1)用10 μg/mL FZD-OVA包被酶標板,4 ℃過夜;傾去包被液,含0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline with 0.05% Tween-20,PBST)洗滌3 次,5 min/次;5%的脫脂奶封閉過夜,洗滌。2)加一抗:將標準品溶液倍比稀釋后與經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)稀釋的ScFv抗體等體積混合,37 ℃孵育2 h后加板,100 μL/每孔,同時設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照組,37 ℃孵育2 h;傾去混合液,洗滌3 次;3)加二抗:每孔加入HRP標記的抗His-tag抗體(1∶5 000)100 μL,37 ℃孵育1 h,洗滌方法同上。4)顯色:每孔加入100 μL TMB,37 ℃避光反應(yīng)30 min。每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4溶液,終止反應(yīng),用酶標儀測定波長450 nm處吸光度(A450nm)。5)結(jié)果判定:結(jié)合率為縱坐標,以FZD的質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標,繪制競爭曲線,以A450nm值判斷抗FZD單鏈抗體與FZD的競爭反應(yīng)情況,判斷單鏈抗體的特異性。以抗FZD特異性抗體對FZD的競爭抑制率為縱坐標,以FZD質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標,繪制標準競爭曲線。在標準競爭曲線上計算出抑制率為50%時混合液中FZD的標準質(zhì)量濃度作為競爭抑制率IC50。結(jié)合率、抑制率按公式(1)、(2)計算:

    式中:A為加入不同質(zhì)量濃度的底物FZD的吸光度(A450nm);A0為不加底物FZD的吸光度(A450nm);A空白為不加底物FZD、不加抗血清的吸光度(A450nm)。

    抑制率/%=100%-結(jié)合率 (2)

    1.3.2 ScFv抗體的交叉反應(yīng)性分析

    分別將FTD、NFT、NFZ、SEM以及AOZ這5 種結(jié)構(gòu)類似物標準液倍比稀釋,每個質(zhì)量濃度取50 μL與等體積的ScFv抗體于37 ℃反應(yīng)2 h,其余步驟同間接競爭ELISA。最后以FTD、NFT、NFZ、SEM和AOZ的IC50與FZD的IC50百分比可得該單鏈抗體與各結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率按公式(3)計算:

    式中:IC50,FZD為當FZD對抗血清抑制率為50%時,F(xiàn)ZD的標準質(zhì)量濃度/(ng/mL);IC50,結(jié)構(gòu)類似物為當FZD結(jié)構(gòu)類似物對抗血清抑制率達到50%時,F(xiàn)ZD結(jié)構(gòu)類似物的標準質(zhì)量濃度/(ng/mL)。

    1.3.3 抗FZD酶聯(lián)免疫檢測方法的建立

    1.3.3.1 最佳包被抗原及單鏈抗體工作質(zhì)量濃度的確定

    采用方陣實驗法,將重氮法制備的FZD-OVA作為包被抗原和抗FZD單鏈抗體分別做系列稀釋,抗原質(zhì)量濃度分別稀釋為10、5、2、1、0.2 μg/mL,按100 μL/孔包被在酶標板中,4 ℃過夜;用脫脂奶37 ℃封閉3 h;將單鏈抗體作100、200、500、1 000、2 000倍稀釋后加入酶標板中。其余步驟同1.3.1節(jié)。根據(jù)檢測得到的A值,確定實驗最佳的包被抗原和單鏈抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

    1.3.3.2 一抗最佳反應(yīng)時間的確定

    包被酶標板,4 ℃過夜,洗滌3 次后加脫脂奶封閉3 h。洗滌后,分別加入高濃度抗體(稀釋5倍)、低濃度抗體(稀釋20 倍)、陰性抗體(空質(zhì)粒表達的蛋白)、空白(PBS)(均設(shè)3 個平行)。設(shè)定一抗反應(yīng)時間分別為30、60、120 min。其余步驟同間接ELISA方法。根據(jù)讀取的A450nm,比較各個時間段對結(jié)果的影響,確定一抗的最佳作用時間。

    1.3.3.3 二抗最佳反應(yīng)時間的確定

    包被,封閉,選擇一抗的最佳反應(yīng)時間進行反應(yīng),一抗的梯度與1.3.3.2節(jié)中相同。分別設(shè)定二抗的反應(yīng)時間為30、45、60 min。其余步驟同間接ELISA方法。根據(jù)讀取的A450nm,比較各個時間段對結(jié)果的影響,確定二抗最佳時間。

    1.3.3.4 TMB顯色時間的確定

    在最優(yōu)的抗原抗體工作質(zhì)量濃度、一抗反應(yīng)時間、二抗反應(yīng)時間條件下,分別設(shè)定顯色時間為加入TMB后37 ℃反應(yīng)5、10、20、30 min。

    1.3.3.5 檢測方法的檢出限分析

    從包被的10 塊板中隨機選擇10 個孔,加入50 μL零標準品和50 μL稀釋到工作質(zhì)量濃度的抗FZD單鏈抗體,應(yīng)用建立的間接競爭ELISA法進行測定。求得10 個孔的標準品標準差,在標準曲線上對應(yīng)3倍標準差/A0的標準品質(zhì)量濃度即為此方法的檢出限,標準差按公式(4)、(5)計算:

    式中:Ai為第i孔底物FZD的吸光度(A450nm);A0為i 個孔吸光度(A450nm)的平均值。

    1.3.3.6 間接競爭ELISA檢測方法的精密度測試

    取3 個不同質(zhì)量濃度的FZD標準品,進行間接競爭ELISA分析,每個質(zhì)量濃度每天做1 次分析,綜合5 次測定的抑制率,求出變異系數(shù)。

    1.3.3.7 樣品加標回收率

    高血壓(hypertension)是體循環(huán)中的動脈血壓升高為主要特點,(收縮壓≥140毫米汞柱,舒張壓≥90毫米汞柱),可以出現(xiàn)靶器官的損害,如心、腦、腎等器官的功能出現(xiàn)器質(zhì)性損害的臨床綜合征[1-2]。高血壓患者大多數(shù)與自身體質(zhì)密切相關(guān),體質(zhì)學說屬于中醫(yī)范疇,頁數(shù)與辨證論治理論,先天性缺陷和體質(zhì)與后天吸收氣血精津液共同組成人的本源,直接影響人的疾病的預(yù)后情況[3-5]。所以必須根據(jù)患者自身條件和體質(zhì)采取特異性中醫(yī)護理方式對患者疾病的控制有著不可忽視的作用。本研究以辨體論治作為護理的基礎(chǔ)和前提,觀察體質(zhì)護理對高血壓病患者護理效果的評估,現(xiàn)報道如下。

    將空白魚飼料樣本研磨粉碎,過篩備用。取適量樣品于50 mL離心管中,按10.0、50.0、100.0 μg/g的添加量分別加入適量的FZD標準品。然后加入甲醇-乙腈(3∶7,V/V)提取液,劇烈振蕩30 min。靜置一段時間后,離心取上清液進行還原(方法同文獻[19])。待冷卻至室溫后采用間接競爭ELISA法進行檢測。最后,根據(jù)FZD競爭抑制標準曲線,計算加標回收率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ScFv抗體的親和力分析

    采用間接競爭ELISA法,檢測ScFv抗體的親和力。以FZD-OVA作為檢測抗原,與游離抗原FZD競爭結(jié)合抗體的結(jié)合位點。當FZD質(zhì)量濃度在10~100 ng/mL之間時,抑制率呈較好的線性關(guān)系,以FZD添加質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標,抑制率為縱坐標,擬合標準曲線后得到線性方程:y=42.24x+2.930 2(R2=0.990 2)。當抑制率為50%時,IC50值為13.01 ng/mL。陳蔭楠等[19]制備的單克隆抗體,其線性范圍為10~500 ng/mL,IC50值為60 ng/mL,與之相比(所采用的計算方法、樣品種類及樣品前處理方法均一樣),本實驗中所制備的單鏈抗體IC50值較小,靈敏度更高。

    2.2 ScFv抗體的交叉反應(yīng)性分析

    以FZD-OVA作為包被抗原,將FTD、NFT、NFZ、SEM和AOZ分別倍比稀釋,采用間接競爭ELISA法檢測,得出抗FZD單鏈抗體FZD-ScFv與各FZD結(jié)構(gòu)類似物的IC50值,計算出交叉反應(yīng)率,如表1所示,得出抗FZD單鏈抗體FZD-ScFv對5 種硝基呋喃抗生素的交叉反應(yīng)率均低于1%,有較好的特異性。但與陳蔭楠等[19]制備的單克隆抗體相比(交叉反應(yīng)率均低于0.01%),特異性稍差。

    表1 抗體與FZD結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)性的對比Table 1 Comparison in the cross-reactivity of antibodies against analoogguueess

    2.3 最佳反應(yīng)條件的確定

    2.3.1 最佳包被抗原及單鏈抗體工作質(zhì)量濃度的確定

    采用方陣滴定法來確定最佳的包被抗原濃度與抗體稀釋倍數(shù)。實驗采用間接非競爭ELISA測定,得出最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL,在此包被質(zhì)量濃度條件下,抗體稀釋倍數(shù)在1∶500時吸光度(A450nm)在1.0附近,故選擇1∶500作為抗體最佳稀釋倍數(shù)。

    2.3.2 一抗最佳反應(yīng)時間的確立

    用2 μg/mL的FZD-OVA包被酶標板,一抗分別為FZD-ScFv稀釋5 倍、FZD-ScFv稀釋20 倍、陰性對照(空質(zhì)粒表達的蛋白)、空白(PBS)4 個梯度。分別在37 ℃反應(yīng)30、60、120 min,二抗孵育1 h,TMB顯色30 min,如圖1所示。

    圖1 一抗反應(yīng)時間的考察Fig. 1 Optimum reaction time for primary antibody

    從圖1可以看出,隨著反應(yīng)時間的延長,吸光度也不斷升高。令RAbs=(A1-A0)/(A2-A0),其中A1為稀釋5 倍的吸光度,A2為稀釋20 倍的吸光度,A0為陰性的吸光度。陰性空質(zhì)粒表達的蛋白吸光度也隨時間增加,30min的吸光度為0.147,120min的吸光度為0.223。30、60、120 min時,RAbs值分別為1.34、1.52、1.42。RAbs,60min值最大,且空白對照低,因此,一抗反應(yīng)60 min最佳。

    2.3.3 二抗最佳反應(yīng)時間的確立

    一抗反應(yīng)60 min后,加入二抗37 ℃分別反應(yīng)30、45、60 min,如圖2所示。在這3 個時間段中,隨著二抗反應(yīng)時間的延長,吸光度不斷升高,60 min時吸光度達到最高值,但比較RAbs值發(fā)現(xiàn),RAbs,45min值最大,因此二抗最佳反應(yīng)時間為45 min。

    圖2 二抗反應(yīng)時間的考察Fig. 2 Optimum reaction time for secondary antibody

    2.3.4 TMB顯色時間的確立

    圖3 TMB反應(yīng)時間的考察Fig. 3 Optimum reaction time for TMB

    一抗反應(yīng)60 min,二抗反應(yīng)45 min,分別顯色5、10、20、30 min后,如圖3所示,單鏈抗體稀釋5 倍時,30 min時吸光度最高,為1.906。隨著顯色時間的延長,吸光度也出現(xiàn)了較大幅度的增加,但顯色20 min和30 min的吸光度差別不大,但RAbs,20min大于RAbs,30min,同時鑒于該試劑盒是用于快速檢測的,選擇20 min即可。

    2.3.5 檢出限分析

    從包被好的酶標孔板中隨機挑選10 孔,按建立好的間接競爭ELISA模式做零標準的實驗,求所得10 個A值的標準差,在標準曲線上對應(yīng)3 倍標準差/A0的標準品質(zhì)量濃度即為此方法的檢出限。由此得到3 倍標準差/A0位置相應(yīng)的抑制率和檢出限為7.47%和1.28 ng/mL,并與陳蔭楠等[19]制備的抗FZD單克隆抗體的相應(yīng)數(shù)值比較如表2所示。本實驗制備的抗FZD單鏈抗體檢出限更低,檢測范圍更廣,效果更佳。

    表2 檢出限測試對比Table 2 Comparison in the detection limit of detection kit among different antibodies

    2.3.6 間接競爭ELISA檢測方法的精密度結(jié)果

    重復(fù)做5 次FZD的競爭抑制曲線,每次做3 個質(zhì)量濃度,每個質(zhì)量濃度做3 個平行孔,以平行孔的均值作為每次每個質(zhì)量濃度條件下的抑制率,對比結(jié)果見表3。

    表3 精密度測試結(jié)果Table 3 Test of detection precision of detection kit based on single chain fragment antibody

    表4 精密度對比結(jié)果Table 4 Comparison in detection precision of detection kit among different antibodies

    結(jié)合表3、4可以看出,每個質(zhì)量濃度條件下的變異系數(shù)均小于10%,平均誤差為3.83%。這比陳蔭楠等[19]建立的檢測方法的平均誤差小,重復(fù)性更好。

    2.3.7 樣品加標回收率的測定結(jié)果

    往不含F(xiàn)ZD的飼料中分別加入FZD使其添加量為10.0、50.0、100.0 μg/g,樣品經(jīng)提取后進行ELISA檢測,每個添加量重復(fù)檢測3 次,計算加標回收率,結(jié)果見表5。數(shù)據(jù)顯示,F(xiàn)ZD樣品的加標回收率為73.38%~84.52%,變異系數(shù)6.81%~9.41%。而陳蔭楠等[19]所制得單克隆抗體的FZD樣品加標回收率為76.84%~88.31%,變異系數(shù)9.36%~15.79%,二者相比樣品加標回收率差別不大,但本實驗所制得FZD單鏈抗體變異系數(shù)更小。

    表5 FZD加標回收率結(jié)果Table 5 Recovery rates of FZD from samples of detection kit based on single chain fragment antibody

    表6 加標回收率對比結(jié)果Table 6 Comparison in recovery rate of detection kits among different antibodies

    3 結(jié) 論

    用純化后獲得的單鏈抗體建立的間接競爭ELISA檢測方法的檢測范圍為10~100 ng/mL,IC50值為13.01 ng/mL。與FZD結(jié)構(gòu)類似物(FTD、NFT、NFZ、SEM、AOZ)的交叉反應(yīng)率均小于1%,說明單鏈抗體的靈敏度和特異性均很高。

    建立了基于抗FZD單鏈抗體的間接競爭ELISA檢測方法,最佳抗原工作質(zhì)量濃度為2 μg/mL,最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶500。在一抗反應(yīng)60 min、二抗反應(yīng)45 min、TMB顯色20 min條件下,計算得到檢出限為1.28 ng/mL。所建立的方法重現(xiàn)性較好,平均誤差為3.83%,加標回收率為73.38%~84.52%,變異系數(shù)為6.81%~9.41%。

    綜上所述,相比單克隆抗體,本實驗制備的單鏈抗體IC50值和檢出限較小,平均誤差較小,變異系數(shù)較小,樣品加標回收率差別不大,雖然交叉反應(yīng)率稍低于單克隆抗體,但足以滿足檢測的要求,且靈敏度更高,檢測范圍更廣,穩(wěn)定性較好。

    利用基因工程手段制備單鏈抗體免疫原性低,對人體不會引起抗異種蛋白反應(yīng),半衰期短,且分離純化方法簡單,制備所需時間短[30-31],同時抗體易于改造以用于不同用途。因此,基于單鏈抗體的免疫檢測方法具有更廣的應(yīng)用范圍和應(yīng)用前景。

    [1] 周克楠, 唐勇, 藍彩鳳, 等. 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體及其新型免疫層析檢測試紙條的制備[J]. 中國生物制品學雜志, 2014, 27(7)∶927-931. DOI∶10.13200/j.cnki.cjb.000454.

    [2] 陳威風, 陳敬鑫. 肉制品中硝基呋喃類藥物殘留的研究進展[J]. 肉類研究, 2011, 25(12)∶ 53-57. DOI∶10.3969/j.issn.1001-8123.2011.12.014.

    [3] 葛寶坤, 王云鳳, 賀信. 高效液相色譜法測定雞肉、水產(chǎn)品中呋喃西林和呋喃唑酮殘留量的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2002, 12(6)∶661-662. DOI∶10.3969/j.issn.1004-8685.2002.06.008.

    [4] 劉迎春, 蔣蔚, 陳永軍, 等. 呋喃它酮代謝物人工抗原及多克隆抗體的制備[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2013, 45(2)∶ 69-73.

    [5] 傅國, 李寧毅. 硝基呋喃類和硝基咪唑類藥物的研究進展 [J]. 青島大學醫(yī)學院學報, 2003, 39(4)∶ 486-488. DOI∶10.11712/qdyxy200304061.

    [6] ALI B H. Pharmacological, toxicol ogical and therapeutic properties of furazolidone∶ some recent research[J]. Veterinary Research Communications, 1999, 23(6)∶ 18-23. DO I∶10.1023/A∶1006333608012.

    [7] 李子穎, 鄭婷, 袁志剛, 等. 呋喃唑酮代謝物AOZ的抗體制備及初步應(yīng)用[J]. 食品科技, 2013, 38(4)∶ 309-313. DOI∶10.13684/j.cnki.spkj.2013.04.070.

    [8] 王烈喜, 陳黎斌, 姚玉靜. 呋喃妥因代謝物海特因單克隆抗體的制 備[J]. 廣東化工, 2015, 42(1)∶ 41-42. DOI∶10.3969/j.issn.1007-1865.2015.01.020.

    [9] KANIOU I, ZACHARIADIS G, KAL LIGAS G, et al. Separation and determination of carbadox, nitrofurazone, nitrofuratoin, furazolidone,furaltadone in their mixtures by thin layer and high performance liquid chromatography[J]. Journal of Liquid Chromatography, 2012, 17(6)∶1385-1398.

    [10] 朱堅. 高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測肉和水產(chǎn)品中硝基呋喃類藥物的代謝物殘留量[J]. 質(zhì)譜學報, 2003, 24(增刊1)∶ 121-122.DO I∶10.3969/j.issn.1004-2997.2003.z1.061.

    [11] 劉輝, 梁德沛, 花鐵果, 等. 食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留檢測技術(shù)的研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報, 2013, 4(2)∶384-389.

    [12] 王重慶. 分子免疫學基 礎(chǔ)[M]. 北京∶ 北京大學出版社, 2008∶ 4.

    [13] 徐順清, 劉衡川. 免疫學檢驗[M]. 北京∶ 人民衛(wèi)生出版社, 2015∶ 15.

    [14] 任海濤, 沈玉棟, 徐振林, 等. 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附分析方法[J]. 分析化學研究報告, 20 15, 40(5)∶ 745-751.DOI∶10.3724/SP.J.1096.2012.10409.

    [15] LI J, LIU J, ZHANG H C, et al. Broad specificity indirect competitive immunoassay for determination of nitrofurans in animal feeds[J]. Analytica Chimica Acta, 2010, 678(1)∶ 1-6. DOI∶10.1016/j.aca.2010.07.025.

    [16] ZHU H P, L IU T T, LIU B, et al. Antigens synthesis and antibodies preparation for furazolidone and its metabolite 3-amino-2-oxazolidinone[J]. Chinese Chemical Lette rs, 2010, 21(9)∶ 1049-1052.DOI∶10.1016/j.cclet.2010.04.001.

    [17] 宋娟, 王玉珍, 鄧安平. 測定食品中呋喃它酮代謝物3-氨基-5-嗎啉甲基-2-惡唑烷酮的酶聯(lián)免疫吸附法[J]. 食品安全質(zhì)量檢測 學報,2012, 3(5)∶ 77-81.

    [18] 石賢愛, 裴世鋒, 李向楠, 等. 基于不同半抗原的呋喃唑酮代謝物免疫 檢測方法的建立與比較[J]. 食品科學, 2014, 35(8)∶ 174-180.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201408035.

    [19] 陳蔭楠, 陳華, 石賢愛, 等. 抗呋喃唑酮單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[J]. 食品科學, 2016, 37(3)∶ 157-163. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201603029.

    [20] 劉萍, 陳苗苗, 劉學榮, 等. 單克隆抗體研究進展[J]. 中國畜牧獸 醫(yī),2012, 39(1)∶ 67-70. DOI∶10.3969/j.issn.1671-7236.2012.01.016.

    [21] 郭海濤, 楊光勇, 何光志. 單鏈抗體的研究進展及其應(yīng)用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2015(13)∶ 76-79. DOI∶10.13881/j.cnki.hljxmsy.2015.1053.

    [22] 齊永華, 董永軍, 寧紅梅, 等. 單鏈抗體技術(shù)在農(nóng)獸藥殘留檢測方面的研究進展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報, 2011, 42(9)∶ 7-11. DOI∶10.3969/j.issn.1005-9369.2011.09.002.

    [23] 劉燕. 單鏈抗體的研究進展及其應(yīng)用前景[J]. 2003, 37(11)∶ 42-44.DOI∶10.3969/j.issn.1002-1280.2003.11.012.

    [24] 李菁, 林彤, 宋帥, 等. 基因工程抗體研究進展[J]. 生物技術(shù)通報,2009, 25(10)∶ 40-44. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201603029.

    [25] 霍萍萍, 張聰敏, 趙寶華. 單鏈抗體制備技術(shù)及應(yīng)用的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志, 2011, 27(10)∶ 1154-1156. DOI∶10.13423/j.cnki.cjcmi. 006175.

    [26] 王秀紅, 周素芳. 基因工程抗體研究進展[J]. 生物技術(shù)通訊, 2007,18(2)∶ 304-306. DOI∶10.3969/j.issn.1009-0002.2007.02.039.

    [27] 馬穎, 鄒全明. 單鏈抗體及其在生物醫(yī)學中的應(yīng)用[J]. 免疫學雜志,2006, 22(增刊1)∶ 1-4. DOI∶10.3969/j.issn.1000-8861.2006.z1.001.

    [28] 張倩. 鯽魚IgM單鏈抗體的制備及嗜水氣單胞菌抗體間接ELISA檢測方法的建立[D]. 南京∶ 南京農(nóng)業(yè)大學, 2013. DOI∶10.7666/d.Y252734 1.

    [29] 田江紅. 核糖體展示人單鏈抗體庫的構(gòu)建及抗HCV NS5B蛋白的ScFv的篩選[D]. 西安∶ 第四軍醫(yī)大學, 2010.

    [30] 王溪橋. 大容量人源肝癌核糖體展示單鏈抗體庫的構(gòu)建[D]. 蘭州∶蘭州大學, 2010.

    [31] 韓亞萍. 大容量人源胃癌核糖體展示抗體庫的構(gòu)建、鑒定及篩選[D].蘭州∶ 蘭州大學, 2009.

    Establishment of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Method for Detecting Furazolidone Based on Single Chain Fragment Antibody

    CHEN Qian1, CHEN Yinnan1,2, CHEN Donghai1, LIN Haihong1, SHI Xian’ai1,3,*
    (1. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China;2. Basic Medicine Programme, Quanzhou Medical College, Quanzhou 362000, China;3. Fujian Key Laboratory of Medical Instrument and Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350108, China)

    Aim∶ This study aimed to develop an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method for detecting the residues of furazolidone (FZD) in animal food. Method∶ The indirect competitive ELISA method based on single chain fragment antibody was established. Result∶ The optimal antigen mass concentration was 2 μg/mL, and the optimal antibody dilution ratio was 1∶500, and the optimal reaction time of primary antibody, the optimal reaction time of secondary antibody and the optimal reaction time of TMB were 60 min, 45 min, and 20 min, respectively. The good linearity was seen in the range of 10-100 ng/mL of FZD, with the IC50value being 13.01 ng/mL, and the lowest detection limit (LOD) being 1.28 ng/mL, and the recovery rates being 73.38%-84.52%. Conclusion∶ Compared with the monoclonal antibody against FZD, the detection kit based on single chain fragment antibody displayed wider detection range, higher sensitivity, better specifi city and detection stability.

    furazolidone; single chain fragment antibody; enzyme-linked immunosorbent assay

    TS207.3

    A

    1002-6630(2017)20-0242-06

    陳倩, 陳蔭楠, 陳東海, 等. 基于單鏈抗體的呋喃唑酮酶聯(lián)免疫檢測方法的建立[J]. 食品科學, 2017, 38(20): 242-247.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720035. http://www.spkx.net.cn

    CHEN Qian, CHEN Yinnan, CHEN Donghai, et al. Establishment of enzyme-linked immunosorbent assay method for detecting furazolidone based on single chain fragment antibody[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 242-247. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720035. http∶//www.spkx.net.cn

    2017-01-06

    國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項(201205022-3);福建省科技重大專項(2013NZ0003);福建省海洋與漁業(yè)廳重點項目(閩海漁合同[2010]2-27號)

    陳倩(1991—),女,碩士,研究方向為抗體研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化。E-mail:121131347@qq.com

    *通信作者:石賢愛(1971—),男,教授,博士,研究方向為高靈敏度生物檢測。E-mail:shixa@fzu.edu.cn

    DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720035

    猜你喜歡
    呋喃唑酮單鏈單克隆
    加味黃術(shù)湯聯(lián)合吲哚美辛呋喃唑酮栓治療肛裂術(shù)后疼痛、水腫的臨床觀察
    單克隆抗體在新型冠狀病毒和其他人冠狀病毒中的研究進展
    逐步添加法制備單鏈環(huán)狀DNA的影響因素探究*
    國家藥監(jiān)局發(fā)布停止生產(chǎn)銷售使用含呋喃唑酮復(fù)方制劑的公告[2019年02月15日 發(fā)布]
    中老年保健(2019年4期)2019-06-12 12:08:50
    呋喃唑酮復(fù)方制劑停用有因
    鹽酸克倫特羅生物素化單鏈抗體在大腸埃希氏菌中的表達
    抗HPV18 E6多肽單克隆抗體的制備及鑒定
    急性淋巴細胞白血病單鏈抗體(scFv)的篩選與鑒定
    草魚還在吃“禁藥”又被檢出危害殘留
    TSH受體單克隆抗體研究進展
    欧美人与善性xxx| 女人精品久久久久毛片| 最近中文字幕2019免费版| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 一个人免费看片子| 午夜免费观看性视频| 国产在线男女| 蜜桃在线观看..| 在线播放无遮挡| 亚洲,欧美,日韩| 夫妻性生交免费视频一级片| 你懂的网址亚洲精品在线观看| av天堂中文字幕网| 永久网站在线| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲国产av新网站| 色哟哟·www| 一二三四中文在线观看免费高清| 婷婷色综合www| 视频中文字幕在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产高清不卡午夜福利| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久99热6这里只有精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 曰老女人黄片| 韩国av在线不卡| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一级,二级,三级黄色视频| av网站免费在线观看视频| av在线app专区| 麻豆成人av视频| 免费观看av网站的网址| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲国产精品一区三区| 99久久综合免费| 国产精品熟女久久久久浪| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久久久国产网址| 久久久亚洲精品成人影院| 中国三级夫妇交换| 免费大片18禁| 亚洲精品日本国产第一区| 三上悠亚av全集在线观看 | 国产在线免费精品| 国产亚洲5aaaaa淫片| 午夜激情久久久久久久| 91精品国产国语对白视频| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美xxⅹ黑人| 最新中文字幕久久久久| 午夜久久久在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 如何舔出高潮| 国产又色又爽无遮挡免| 日本黄大片高清| 成人黄色视频免费在线看| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品久久久精品久久久| 国产精品久久久久久精品古装| 国产午夜精品一二区理论片| 我的老师免费观看完整版| 色婷婷av一区二区三区视频| 91久久精品国产一区二区成人| 国产视频内射| 久热这里只有精品99| 精品国产露脸久久av麻豆| 少妇丰满av| 亚洲情色 制服丝袜| 老司机影院成人| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲丝袜综合中文字幕| .国产精品久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 国产美女午夜福利| 欧美精品高潮呻吟av久久| 十八禁网站网址无遮挡 | 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲av综合色区一区| 久久av网站| 22中文网久久字幕| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产成人a∨麻豆精品| 久久精品久久久久久久性| 久热这里只有精品99| 永久网站在线| 亚洲av福利一区| 美女内射精品一级片tv| 香蕉精品网在线| 国产又色又爽无遮挡免| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品乱久久久久久| 午夜91福利影院| 国产精品久久久久久精品古装| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲久久久国产精品| 日韩av不卡免费在线播放| 色吧在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 日本欧美国产在线视频| 免费黄频网站在线观看国产| 波野结衣二区三区在线| 视频区图区小说| 高清不卡的av网站| 亚洲av综合色区一区| 欧美+日韩+精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲国产精品专区欧美| 黄色毛片三级朝国网站 | 在线观看免费视频网站a站| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲美女视频黄频| 国产免费视频播放在线视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩视频在线欧美| 亚洲电影在线观看av| 五月伊人婷婷丁香| 国产综合精华液| 51国产日韩欧美| 黄色欧美视频在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 免费观看av网站的网址| 国产成人免费观看mmmm| 国产高清有码在线观看视频| 久久精品国产亚洲网站| 久久毛片免费看一区二区三区| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 少妇熟女欧美另类| 99热这里只有是精品50| 日本黄大片高清| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久久网色| 国产爽快片一区二区三区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美日韩av久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 在线观看免费高清a一片| 午夜激情福利司机影院| 久久狼人影院| 色网站视频免费| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 岛国毛片在线播放| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲高清免费不卡视频| 自线自在国产av| 少妇高潮的动态图| 少妇被粗大猛烈的视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 乱系列少妇在线播放| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久热精品热| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 一本色道久久久久久精品综合| 中文字幕久久专区| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 看免费成人av毛片| 伊人亚洲综合成人网| 国产伦精品一区二区三区视频9| 偷拍熟女少妇极品色| 少妇人妻精品综合一区二区| 日韩成人伦理影院| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产成人精品婷婷| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲综合精品二区| 看免费成人av毛片| 在线观看国产h片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 大话2 男鬼变身卡| 久久午夜福利片| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 久久久久久久久久人人人人人人| 观看美女的网站| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲欧洲国产日韩| 秋霞在线观看毛片| 两个人的视频大全免费| 久久综合国产亚洲精品| 欧美精品高潮呻吟av久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品人妻久久久久久| 搡女人真爽免费视频火全软件| 女性被躁到高潮视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品偷伦视频观看了| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲欧美日韩东京热| 97超视频在线观看视频| 成年av动漫网址| 22中文网久久字幕| 性色avwww在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av免费在线看不卡| 99热全是精品| 国产精品久久久久久久电影| 一二三四中文在线观看免费高清| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日本vs欧美在线观看视频 | 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 亚洲欧美精品自产自拍| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲综合色惰| 性色av一级| 全区人妻精品视频| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 69精品国产乱码久久久| 51国产日韩欧美| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 男女国产视频网站| 成人综合一区亚洲| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美 日韩 精品 国产| 午夜福利网站1000一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 26uuu在线亚洲综合色| 午夜福利视频精品| 在线观看www视频免费| 国产欧美亚洲国产| 亚洲av.av天堂| 男人和女人高潮做爰伦理| 美女中出高潮动态图| 日日啪夜夜撸| 观看美女的网站| 晚上一个人看的免费电影| av福利片在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久久久精品性色| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲av国产av综合av卡| 男女国产视频网站| 国产一级毛片在线| 久久久久久久久久久免费av| 99热网站在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| av黄色大香蕉| 两个人的视频大全免费| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美成人精品欧美一级黄| 永久网站在线| 国模一区二区三区四区视频| av有码第一页| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 精品久久久噜噜| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产 精品1| 欧美区成人在线视频| 日本av手机在线免费观看| 美女中出高潮动态图| 亚洲综合色惰| 亚洲国产精品国产精品| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品久久久久久久久免| 国产 一区精品| 乱系列少妇在线播放| 全区人妻精品视频| 精品国产国语对白av| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲精品乱久久久久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 日韩中字成人| 香蕉精品网在线| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 简卡轻食公司| 成人亚洲欧美一区二区av| 黄色怎么调成土黄色| 两个人免费观看高清视频 | 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲伊人久久精品综合| 熟妇人妻不卡中文字幕| 3wmmmm亚洲av在线观看| 欧美3d第一页| 久久99蜜桃精品久久| 大香蕉97超碰在线| 日本免费在线观看一区| 久久 成人 亚洲| 色5月婷婷丁香| 丰满乱子伦码专区| 成年女人在线观看亚洲视频| 国产熟女午夜一区二区三区 | 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲美女搞黄在线观看| 中文资源天堂在线| 国产免费福利视频在线观看| 国产男女内射视频| 欧美丝袜亚洲另类| 国产有黄有色有爽视频| 日本wwww免费看| 观看美女的网站| av线在线观看网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品成人在线| 一区二区三区免费毛片| 赤兔流量卡办理| 久久99精品国语久久久| 大片免费播放器 马上看| 久久久精品免费免费高清| 少妇人妻久久综合中文| 99热这里只有是精品在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 最后的刺客免费高清国语| 大香蕉久久网| 国产高清有码在线观看视频| 大香蕉久久网| 中文字幕av电影在线播放| 日韩一区二区视频免费看| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 极品人妻少妇av视频| 成年av动漫网址| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产一级毛片在线| 欧美bdsm另类| av线在线观看网站| 少妇人妻 视频| 亚洲人成网站在线播| 亚洲天堂av无毛| 人妻系列 视频| 久久久亚洲精品成人影院| 老司机影院成人| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 一本久久精品| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 免费看光身美女| 国产精品欧美亚洲77777| 精品一区二区三卡| 午夜激情久久久久久久| 免费人成在线观看视频色| 亚洲精品乱久久久久久| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品无大码| 热re99久久精品国产66热6| 欧美精品一区二区大全| 五月天丁香电影| 女性生殖器流出的白浆| 久久99热这里只频精品6学生| 99re6热这里在线精品视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产成人一区二区在线| 日韩成人av中文字幕在线观看| 18+在线观看网站| 精品久久国产蜜桃| 两个人免费观看高清视频 | 免费大片黄手机在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 下体分泌物呈黄色| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲精品视频女| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 最后的刺客免费高清国语| 看十八女毛片水多多多| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产欧美亚洲国产| 国精品久久久久久国模美| 黄色一级大片看看| 六月丁香七月| 国产有黄有色有爽视频| 婷婷色综合www| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品一区二区性色av| 亚洲四区av| 亚洲电影在线观看av| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久久久久久久久久大奶| 秋霞在线观看毛片| 午夜av观看不卡| 国产精品伦人一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 久久这里有精品视频免费| 丰满乱子伦码专区| 久久精品国产亚洲av涩爱| av在线播放精品| 国产黄色免费在线视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 成年人免费黄色播放视频 | 少妇的逼水好多| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲欧美成人精品一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月| www.av在线官网国产| 一二三四中文在线观看免费高清| 色网站视频免费| 亚洲四区av| 日韩欧美 国产精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产极品天堂在线| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲综合色惰| 一级爰片在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 免费人成在线观看视频色| 七月丁香在线播放| 亚洲人与动物交配视频| 韩国av在线不卡| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产成人精品婷婷| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| h视频一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av天堂久久9| 国产乱来视频区| 国产伦在线观看视频一区| freevideosex欧美| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 丝袜喷水一区| 寂寞人妻少妇视频99o| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 黄片无遮挡物在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产精品熟女久久久久浪| 国产成人精品一,二区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲综合精品二区| av福利片在线观看| 视频中文字幕在线观看| 精品一区二区三卡| 九色成人免费人妻av| 亚洲第一av免费看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| tube8黄色片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 少妇精品久久久久久久| 久久久久视频综合| 国产免费又黄又爽又色| 啦啦啦在线观看免费高清www| 又爽又黄a免费视频| av免费在线看不卡| 观看免费一级毛片| 国产成人91sexporn| 乱人伦中国视频| 草草在线视频免费看| 亚洲图色成人| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲天堂av无毛| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲电影在线观看av| 黄色毛片三级朝国网站 | 日韩三级伦理在线观看| 国产爽快片一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 久久久国产欧美日韩av| 十分钟在线观看高清视频www | 国产在线视频一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 精品少妇黑人巨大在线播放| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产视频内射| 大陆偷拍与自拍| 成人无遮挡网站| 国产男女超爽视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 午夜福利视频精品| 亚洲av二区三区四区| 嫩草影院入口| 大陆偷拍与自拍| 美女cb高潮喷水在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 国产精品久久久久成人av| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩强制内射视频| 日韩成人伦理影院| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲av男天堂| 男人爽女人下面视频在线观看| 伊人久久国产一区二区| 欧美bdsm另类| 内地一区二区视频在线| 久久99蜜桃精品久久| 婷婷色av中文字幕| 亚洲熟女精品中文字幕| av女优亚洲男人天堂| 观看免费一级毛片| 亚洲国产精品专区欧美| 国产日韩欧美在线精品| 高清av免费在线| 在线播放无遮挡| 观看美女的网站| 女人久久www免费人成看片| 91精品国产国语对白视频| 三级经典国产精品| av国产久精品久网站免费入址| 国产av码专区亚洲av| av不卡在线播放| 国产成人精品无人区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 99热6这里只有精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产69精品久久久久777片| 婷婷色综合大香蕉| 乱人伦中国视频| 亚洲精品乱久久久久久| 久久狼人影院| av一本久久久久| 欧美+日韩+精品| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲成人av在线免费| 亚洲四区av| a级毛片在线看网站| 色视频www国产| 少妇被粗大猛烈的视频| 高清在线视频一区二区三区| 久久久久视频综合| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 91精品一卡2卡3卡4卡| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产在线免费精品| 最后的刺客免费高清国语| 在线看a的网站| 国产精品国产三级国产专区5o| 五月伊人婷婷丁香| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲精品色激情综合| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久影院123| 一级毛片我不卡| 国产一区二区三区综合在线观看 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产成人91sexporn| 亚洲不卡免费看| 国产极品粉嫩免费观看在线 | av卡一久久| 久久久久国产网址| 国产黄片视频在线免费观看| 一个人看视频在线观看www免费| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品人妻久久久久久| 伦理电影免费视频| 男人添女人高潮全过程视频| 国产亚洲91精品色在线| 久久狼人影院| 综合色丁香网| 看免费成人av毛片| 国产免费视频播放在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| av女优亚洲男人天堂| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 国产精品.久久久| 免费观看的影片在线观看| av网站免费在线观看视频| 美女视频免费永久观看网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 两个人免费观看高清视频 | 在线观看免费视频网站a站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 麻豆成人av视频| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 高清黄色对白视频在线免费看 | 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲精品国产av成人精品| 色网站视频免费| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美xxxx性猛交bbbb| 男女边摸边吃奶| 少妇熟女欧美另类| 欧美日韩在线观看h| 晚上一个人看的免费电影| 人人妻人人澡人人看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久久国产一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 99久久精品一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 亚洲中文av在线| 午夜福利影视在线免费观看| 成人毛片60女人毛片免费|