QuEChERS法-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中7 種農(nóng)藥及其代謝物的殘留量

王建華，葛敏敏，張慧麗，林 洪，湯志旭，李 立*

QuEChERS法-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中7 種農(nóng)藥及其代謝物的殘留量

王建華1，葛敏敏2，張慧麗2，林 洪2，湯志旭1，李 立3,*

（1.山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東 青島 266002；2.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266100；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

樣品經(jīng)乙腈提取，C18吸附劑和石墨化碳黑分散固相萃取凈化，液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜在動態(tài)多反應監(jiān)測模式下檢測，基質(zhì)匹配標準曲線外標法進行定量，建立了蔬菜中7 種農(nóng)藥及其代謝物的多殘留分析方法。在10、20 μg/kg 7種農(nóng)藥及其添加物添加水平下，農(nóng)藥及其代謝物的平均回收率為71.9%～117.8%，相對標準偏差為0.8%～9.6%，定量限為0.2～10 μg/kg。該方法簡便、快速、靈敏，適用于蔬菜中多種農(nóng)藥及其代謝物的同時檢測。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；蔬菜；農(nóng)藥及其代謝物

為防止病蟲害，農(nóng)業(yè)經(jīng)營者經(jīng)常在蔬菜上使用各種農(nóng)藥，而造成殘留。GB 2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[1]中包含多種蔬菜農(nóng)藥殘留檢測的方法，主要是針對農(nóng)藥母體的研究，很少關注農(nóng)藥代謝產(chǎn)物的同時檢測，盡管有些多農(nóng)殘檢測項目涉及代謝物，但是只含1～5 種農(nóng)藥及其代謝物[2-6]或者代謝物不全[7-10]。也有專門針對蔬菜水果中農(nóng)藥及其代謝物檢測的研究報道[11-18]，Hingmire等[11]建立了乙酸乙酯提取、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法測定秋葵中氟蟲腈及其代謝物殘留的檢測方法。Plá cido等[12]采用QuEChERS法進行處理，建立了香蕉中甲硫威及其代謝甲 硫威砜和甲硫威亞砜檢測的液相色譜-二極管陣列檢測器法。吳成等[13]以乙腈作提取劑，采用LC-MS/MS建立了芹菜中甲拌磷及其代謝物甲拌磷亞砜和甲拌磷砜殘留的快速檢測方法。賀敏等[14]采用乙腈提取，固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）測定韭菜中氟蟲腈及其代謝物。劉祥萍等[15]采用鍵合硅固相萃取吸附劑 （primary secondary arnine，PSA）+石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）吸附劑、UHPLC-MS/MS測定蘆蒿中7 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留。馬立利等[16]建立了多壁碳納米管濾過型凈化柱凈化、HPLC-MS/MS同時測定生姜中涕滅威及其代謝物的分析方法。

實驗選取7 種常見的農(nóng)藥涕滅威、克百威、苯線磷、倍硫磷、氟蟲腈、甲硫威和甲拌磷，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中為經(jīng)常使用的殺蟲劑，GB 2763—2014以及歐盟等對其在蔬菜中的限量要求均包含代謝物，而國內(nèi)關于蔬菜中多農(nóng)藥殘留檢測建立的方法中常常只有農(nóng)藥母體，較少關注代謝物的同時檢測，部分有機磷農(nóng)藥代謝產(chǎn)物在食品中的殘留富集對人體的傷害要遠高于農(nóng)藥母體。農(nóng)藥及其代謝物的檢測，對食品安全具有更重要的價值，是未來農(nóng)藥殘留檢測的熱點和難點。要滿足國內(nèi)外關于具有代謝物的農(nóng)藥相關現(xiàn)行法規(guī)的限量要求，必須建立農(nóng)藥及其代謝物的同時檢測方法。

目前，QuEChERS法已廣泛應用于蔬菜水果農(nóng)藥殘留分析中[19-22]，LC-MS/MS具有較好的選擇性和靈敏度[25]。本研究對QuEChERS法凈化條件、MS/MS參數(shù)和流動相體系進行優(yōu)化，選擇C18吸附劑+GCB吸附劑對樣品進行分散固相萃取凈化，建立了蔬菜中7 種農(nóng)藥及其代謝物（涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、克百威、3-羥基克百威、苯線磷、苯線磷砜、苯線磷亞砜、倍硫磷、倍硫磷砜、倍硫磷亞砜、氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、甲硫威、甲硫威砜、甲硫威亞砜、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜）檢測的LC-MS/MS方法，該方法操作簡單、快速，靈敏度較高，可完全滿足歐盟、日本和美國的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

十八烷基鍵合相硅膠（ODS C18-N）分散固相萃取吸附劑（粒徑40～60 μm） 美國Agilent公司；石墨化碳黑（graphitized carbon blacks，GCB）粉吸附劑 天津艾杰爾公司；乙腈和甲醇（色譜純） 德國Merck公司；甲酸、乙酸銨（均為色譜純） 德國Fluka公司；農(nóng)藥及其代謝物（純度均大于95%）購自德國Dr.Ehrenstorfe公司、美國Sigma Aldrich公司、美國Accu Standard公司。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜、6430三重四極桿MS/MS、Poroshell 120 EC-C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）美國Agilent公司；MS3 Basic旋渦振蕩器、HS501水平振蕩器 德國IKA公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲儀清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CR21 G冷凍離心機日本Hitachi公司；PL303電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q超純水裝置（＞18.3 MΩ） 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 提取

稱取10 g（精確至0.01 g）打碎均勻、漿狀的蔬菜試樣于50 mL具塞離心管中，準確加入10 mL純乙腈，立即振蕩，然后加入萃取鹽包（含4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g Na3Cit?2H2O、0.5 g Na2Cit?1.5H2O），劇烈振蕩30 s，在水平振蕩器上振蕩20 min。8 000 r/min離心5 min后待凈化。

1.3.2 凈化

取6 mL乙腈提取液轉(zhuǎn)移至裝有900 mg硫酸鎂、150 mg C18和60 mg GCB吸附劑的離心管中，蓋緊離心管，渦旋10 min，8 000 r/min離心5 min，取凈化液過0.22 μm濾膜后，取500 μL在氮氣下吹干，加入500 μL甲醇-水（1∶1，V/V）混勻后上機分析。此凈化方法適用于胡蘿卜、冬瓜、南瓜、生姜和白蘿卜等多種蔬菜樣品。

1.3.3 LC-MS/MS條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；流動相：A相為含0.1%（V/V）甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液，B相為純甲醇；二元梯度洗脫分離，洗脫程序：0～3 min，95% A～75% A；3～10 min，75% A～40% A；10～21 min，40% A～2% A。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）：電噴霧電壓3 500 V，霧化氣壓力275.9 kPa，干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速11.0 L/min（氮氣）；采集方式采用動態(tài)多反應監(jiān)測（dynamic multiple reaction monitoring，DMRM）模式，正負離子同時掃描；氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜采用負離子掃描，其余化合物均采用正離子掃描。

2 結果與分析

2.1 MS/MS參數(shù)的優(yōu)化結果

在ESI+模式下，涕滅威、氟蟲腈和3-羥基克百威的[M+NH4]+峰稍高于[M+H]+峰，因此選擇[M+NH4]+作為母離子，賀敏等[14]采用乙腈-甲酸溶液作為流動相，氟蟲腈在ESI+模式下無響應，但在本研究條件下，氟蟲腈在ESI+模式下的響應高于ESI-模式，這可能是因為流動相的不同；涕滅威亞砜、克百威、苯線磷、苯線磷亞砜、倍硫磷、倍硫磷亞砜、甲硫威、甲硫威亞砜、甲拌磷、甲拌磷亞砜的[M+H]+峰高于[M+NH4]+，因此選擇[M+H]+作為母離子；氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜在ESI+模式下均無響應，在ESI-模式下，均有響應較高的[M-H]-峰，因此選擇[M-H]-作為母離子。然后對子離子的選擇、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化。

文獻[4]中的涕滅威砜、苯線磷砜、甲硫威砜、甲拌磷砜選擇[M+NH4]+作為母離子，倍硫磷砜選擇[M+H]+作為母離子；文獻[8]中的涕滅威砜、苯線磷砜、倍硫磷砜選擇[M+H]+作為母離子；文獻[9]中的涕滅威砜、苯線磷砜、甲拌磷砜選擇[M+NH4]+作為母離子，倍硫磷砜和甲硫威砜選擇[M+H]+作為母離子；以上文獻報道和本研究的流動相中都含有甲酸銨或者乙酸銨，本實驗在優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)涕滅威砜、苯線磷砜、倍硫磷砜、甲硫威砜、甲拌磷砜5 種代謝物在全掃描中雖然母離子[M+H]+峰響應高于[M+NH4]+峰，但在子離子優(yōu)化過程中[M+NH4]+峰母離子與其子離子的響應明顯高于[M+H]+峰母離子與其子離子的響應，是其2.0～7.4 倍，如 涕滅威砜提取離子對色譜圖見圖1，因此選擇母離子[M+NH4]+與其子離子作為分析離子對。以上5 種代謝物均為砜類化合物，通式為：

在銨離子環(huán)境下，砜類農(nóng)藥代謝物的這種現(xiàn)象可能與其結構有關。

另外，對于倍硫磷砜來說，[M+NH4]+作為母離子，只有一個子離子的響應高于[M+H]+與其子離子，因此倍硫磷砜選擇母離子[M+NH4]+與其子離子（328.0＞311.0）作為定量離子對，[M+H]+與其子離子（311.1＞128.0）作為定性離子對。具體質(zhì)譜條件數(shù)據(jù)見表1。

圖1 涕滅威砜[M＋H]＋和[[M ＋ NH4]＋母離子及其子離子色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the precursor ion [M+H]+and [M+NH4]+and their product ions of aldicarb-sulfone

表1 7 種農(nóng)藥及其代謝物的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Retention time and mass spectral parameters for each compound

2.2 流動相的優(yōu)化

為保證各農(nóng)藥化合物具有良好的峰形和足夠的靈敏度，考察體系A：甲醇-含體積分數(shù)0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液、體系B：乙腈-含體積分數(shù)0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液、體系C：甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液3 種流動相體系，以7 種農(nóng)藥及其代謝物的質(zhì)量濃度為20 μg/L為實驗條件，3 種流動相體系下農(nóng)藥的峰面積比較見圖2。

大部分農(nóng)藥及其代謝物在流動相體系C中的峰面積較高，苯線磷及其代謝物苯線磷砜和苯線磷亞砜、倍硫磷及其代謝物倍硫磷砜和倍硫磷亞砜、氟蟲腈及其代謝物氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜、甲硫威、甲拌磷及其代謝物甲拌磷砜和甲拌磷亞砜13 種農(nóng)藥的峰面積在有機相為甲醇的流動相體系中是有機相為乙腈體系中的1.5～7.3 倍；其余7 種農(nóng)藥在體系A中的峰面積是體系B中的0.9～1.4 倍。在含甲酸和不含甲酸的流動相體系中，大部分農(nóng)藥的峰面積和峰形無明顯變化，倍硫磷、甲拌磷亞砜的峰面積在不含甲酸的流動相體系中是含甲酸流動相的1.4 倍和2.9 倍，苯線磷、苯線磷砜、倍硫磷砜、倍硫磷亞砜、氟蟲腈、氟蟲腈亞砜的峰面積在含甲酸的流動相體系中是不含甲酸的流動相體系的1.2～1.6 倍。綜合考慮最終選擇甲醇-含0.1%甲酸5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相。

圖2 流動相對目標化合物色譜峰響應值的影響Fig. 2 Effect of mobile phase composition on peak area response for target compounds

2.3 樣品溶劑對色譜峰峰形的影響

由于前處理中樣品采用乙腈提取，農(nóng)藥及其代謝物的最終溶劑為乙腈，但是上機分析發(fā)現(xiàn)，流出較早的涕滅威亞砜（5.74 min）出現(xiàn)峰展寬、峰分叉現(xiàn)象，峰面積重現(xiàn)性差，取500 μL凈化液在氮氣下吹干，加入500 μL甲醇-水（1∶1，V/V）混勻后上機分析，涕滅威亞砜峰形顯著改善，峰面積顯著提高，如圖3所示。

圖3 不同溶液配制的10 μg/L標準溶液中涕滅威亞砜的提取離子色譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms of aldicarb-sulfoxide at 10 μg/LL in different solutions

在反相高效液相色譜中，溶劑強度順序：水（最弱）＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氫呋喃＜丙醇＜二氯甲烷（最強）[23]，當樣品溶劑的洗脫強度強于流動相的洗脫強度時，就會產(chǎn)生峰的變形及柱效的降低，即溶劑效應。高效液相色譜測定時以流動相或者相近的溶劑溶解樣品為最佳；或者用強溶劑溶解樣品后，再用等體積的流動相稀釋；還可以采用梯度洗脫的方法，延長目標組分的相對保留時間，以降低強溶解溶劑的影響[24]。

2.4 凈化條件的選擇

考察單獨C18吸附劑和C18+GCB混合吸附劑對菠菜樣品的凈化效果和農(nóng)藥吸附情況，菠菜樣品采用1.3節(jié)所述方法進行前處理，提取液顏色為墨綠色，采用單獨C18吸附劑和C18+GCB混合吸附劑凈化后，凈化液的顏色分別為深綠色和淺綠色。GCB可以有效地去除基質(zhì)中的色素，但也有文獻[25]報道GCB對片狀農(nóng)藥（如克百威）有一定的吸附性。菠菜樣品添加水平為0.02 mg/kg，基質(zhì)匹配標準曲線進行定量，2 種凈化方式下7 種農(nóng)藥及其代謝物的回收率情況見圖4。采用單獨C18吸附劑凈化，7 種農(nóng)藥及其代謝物的回收率在86.5%～124.4%范圍內(nèi)，相對標準偏差（relative standard deviations，RSD）為3.0%～9.0%；采用C18+GCB混合吸附劑凈化，7 種農(nóng)藥及其代謝物的回收率在71.9%～113.1%范圍內(nèi)，RSD為0.8%～8.0%。從回收率來看，采用C18+GCB凈化，所有農(nóng)藥及其代謝物的回收率均在合理范圍（70%～120%）內(nèi)。在本研究中，C18和GCB對目標農(nóng)藥均無明顯吸附作用，因此，本實驗最終采用C18+GCB作為分散固相萃取吸附劑。

圖4 2 種凈化方式下7 種農(nóng)藥及其代謝物的回收率情況Fig. 4 Effect of d-SPE sorbents on recovery of pesticides (n = 3) spiked at 20 μg/kg in spinach

2.5 基質(zhì)效應

當采用ESI時，樣品基質(zhì)的存在會對目標物的電離產(chǎn)生抑制而增強的作用，即基質(zhì)效應?；|(zhì)效應的存在會相應地影響所建方法的性能參數(shù)[26]，例如檢出限、定量限、線性、精密度等。本研究以農(nóng)藥在基質(zhì)中的信號峰面積與在溶劑標準溶液中的信號峰面積比值計算基質(zhì)效應，若在85%～115%之間則認為不存在基質(zhì)效應[27]。由圖5可知，采用單獨C18吸附劑凈化時，氟蟲腈、苯線磷表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應，倍硫磷亞砜、甲硫威、甲硫威亞砜表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，剩余的15 種農(nóng)藥不存在基質(zhì)效應；采用C18+GCB凈化時，大部分農(nóng)藥的基質(zhì)效應適當減小，甲硫威砜和甲硫威亞砜仍表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，剩余的18 種農(nóng)藥均不存在基質(zhì)效應。為了更精確地定量甲硫威砜和甲硫威亞砜，選擇基質(zhì)匹配標準曲線進行定量。

表2 7 種農(nóng)藥及其代謝物的定量限、線性方程、相關系數(shù)、加標回收率和精密度Table 2 Limits of quantitatiion, correlation coeffi cients, calibration curves, recoveries and relative standard deviations for 7 pesticides and their metabolites in spinach

圖5 2 種凈化方式下7 種農(nóng)藥及其代謝物的基質(zhì)效應情況Fig. 5 Infl uence of d-SPE sorbents on matrix effect of pesticides

2.6 方法驗證

2.6.1 線性關系與定量限

由表2可知，7 種農(nóng)藥及其代謝物的基質(zhì)匹配標準曲線在5～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均能呈現(xiàn)出較好的線性關系，相關系數(shù)R2大于0.999 0，以10 倍信噪比確定各農(nóng)藥化合物的定量限（limit of quantitation，LOQ），所有農(nóng)藥及其代謝物的定量限為0.2～10 μg/kg。

2.6.2 回收率和精密度

向空白菠菜樣品中添加10、20 μg/kg的混合標準工作液，需要高、中、低3 個添加量，并考慮LOQ和最大殘留限量，每個水平設置6 個平行樣，并做一個樣品空白試驗。按1.3節(jié)樣品前處理方法進行提取和凈化，LC-MS/MS測定其含量，樣品空白基質(zhì)未出現(xiàn)目標峰。由表2可知，7 種農(nóng)藥及其代謝物的回收率在71.9%～117.8%范圍內(nèi)，RSD在0.8%～9.6%范圍內(nèi)。

2.7 實際樣品檢測結果

圖6 甲拌磷砜和甲拌磷亞砜的提取離子色譜圖Fig. 6 Extracted ion chromatograms of phorate-sulfone and phorate-sulfoxide

應用建立的方法對胡蘿卜、冬瓜、南瓜、生姜和白蘿卜樣品進行檢測。分別稱取以上樣品各10 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，按1.3節(jié)方法進行前處理，LC-MS/MS上機分析，其中1 份生姜樣品檢出甲拌磷砜和甲拌磷亞砜，含量分別為0.004 mg/kg和0.008 mg/kg，在生姜中的總殘留量為0.012 mg/kg，超出了GB 2763—2014中對生姜中甲拌磷最大殘留限量為0.01 mg/kg的要求。生姜陽性樣品和0.01 mg/kg基質(zhì)標準中甲拌磷砜和甲拌磷亞砜特征色譜圖見圖6。

3 結 論

本研究采用乙腈振蕩提取，C18+GCB分散固相萃取吸附劑凈化，液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的動態(tài)多反應監(jiān)測模式分析，建立了蔬菜中7 種農(nóng)藥及其代謝物的多殘留分析方法。本方法快速、高效、穩(wěn)定性好，可作為蔬菜中7 種農(nóng)藥及其代謝物殘留的定性和定量檢測手段。

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Determination of 7 Pesticide and Metabolite Residues in Vegetables Using QuEChERS and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Jianhua1, GE Minmin2, ZHANG Huili2, LIN Hong2, TANG Zhixu1, LI Li3,*
(1. Inspection and Quarantine Technical Center, Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China;2. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China;3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China)

A method was developed for the simultaneous determination of 7 pesticide and metabolite residues in vegetables by employing quick, easy, cheap, effective, rugged and safe (QuEChERS) extraction coupled with liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry (LC-MS/MS). Samples were extracted with acetonitrile, and then the extract was purified by dispersive solid phase extraction (SPE) using graphite carbon black (GCB) and C18sorbent. The analytes were monitored by liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry in the dynamic multiple reaction monitoring (DMRM) mode, and quantifi cation was carried out by the external standard method with matrix-match standard solution. The recove ries at spiked levels of 10 and 20 μg/kg were in the range from 71.9% to 117.8% and the precision,expressed as relative standard deviation (RSD, n=3), ranged from 0.8% to 9.6% under the selected conditions. The limits of quantifi cation (LOQs) were in the range of 0.2–10 μg/kg. The method proved to be simple, fast, sensitive and useful for the analysis of the 7 pesticides and their metabolite residues in vegetables.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); vegetables; pesticides and metabolites

10.7506/spkx1002-6630-201720034

S859.7

A

1002-6630（2017）20-0235-07

王建華, 葛敏敏, 張慧麗, 等. QuEChERS法-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中7 種農(nóng)藥及其代謝物的殘留量[J]. 食品科學,2017, 38(20): 235-241. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720034. http://www.spkx.net.cn

WANG Jianhua, GE Minmin, ZHANG Huili, et al. Determination of 7 pesticide and metabolite residues in vegetables using QuEChERS and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 235-241. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720034. http∶//www.spkx.net.cn

2017-02-14

公益性行業(yè)（質(zhì)檢）科研專項（201410177；201210012）

王建華（1968—），男，研究員，博士，研究方向為食品安全分析。E-mail：whywrs9@163.com

*通信作者：李立（1968—），女，研究員，學士，研究方向為食品安全分析。E-mail：ytciqli@163.com