李果實(shí)褐腐病病原菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶條件優(yōu)化及其致病機(jī)理

張 婕，凡先芳，姚世響,2，鄧麗莉,2，曾凱芳,2,*

李果實(shí)褐腐病病原菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶條件優(yōu)化及其致病機(jī)理

張 婕1，凡先芳1，姚世響1,2，鄧麗莉1,2，曾凱芳1,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

研究李果實(shí)褐腐病病原菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的種類及其產(chǎn)酶最佳條件，并探討其導(dǎo)致果實(shí)發(fā)病的作用機(jī)制。以Monilinia fructicola為研究菌株，通過 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化M. fructicola產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶條件；通過損傷接種粗酶液，研究其對(duì)李果實(shí)的致病作用。結(jié)果表明：M. fructicola產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶的最佳條件為：培養(yǎng)時(shí)間6 d、培養(yǎng)基pH 6.0、碳源 為3.5%蔗糖、氮源為2.5%硝酸鉀；粗酶液處理能夠?qū)е吕罟麑?shí)發(fā)生褐腐病，同時(shí)引起果實(shí)多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（pectin methylgalacturonase，PMG）活力的上升，使果實(shí)原果膠物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性果膠，同時(shí)造成其纖維素含量下降，加速果實(shí)的軟化腐爛進(jìn)程。

褐腐??；細(xì)胞壁降解酶；李果實(shí)；致病機(jī)理

青脆李屬薔薇科核果類，是我國(guó)西南地區(qū)的特色水果之一。其肉質(zhì)致密、味甜汁多、營(yíng)養(yǎng)豐富，是李樹的優(yōu)良品種，深受消費(fèi)者喜愛。青脆李果實(shí)成熟時(shí)期正值盛夏高溫、高濕季節(jié)（每年7～8月），加之其果皮較薄，汁液豐富，損傷后極易受病原微生物的侵染導(dǎo)致腐爛。其中由Monilinia spp.引起的褐腐病是李果實(shí)采后的主要侵染性病害[1]。Monilinia spp.主要分為以下3 種：美澳型核果褐腐病菌（M. fructicola (Winter) Honey）、果生鏈核盤菌（Monilinia fructigena (Aderh. et Ruhl.)Honey）、核果鏈核盤菌（Monilinia laxa (Aderh. et Ruhl.)Honey），其中，M. fructicola是李果實(shí)褐腐病的最主要致病菌[2-4]。

病原菌致病因子研究是人們探索植物與病原菌互作關(guān)系的重要內(nèi)容之一。宿主細(xì)胞壁是阻止病原真菌侵入的一道屏障。病原真菌通過分泌多種細(xì)胞壁降解酶，降解組成宿主細(xì)胞壁的各種多糖物質(zhì)，從而破壞細(xì)胞壁和胞間層，或?qū)е录?xì)胞分離，組織潰散[5]。細(xì)胞壁降解酶具有雙重作用，一方面作為病原物侵染宿主的致病因子，另一方面酶解產(chǎn)物能誘導(dǎo)宿主防御反應(yīng)，為寄主-病原物之間的互作提供一定的參考[6]。大多數(shù)病原真菌都能分泌各種細(xì)胞壁降解酶，主要包括果膠酶、纖維素酶等[5,7]。果膠酶是作用于果膠質(zhì)的一類酶的總稱，主要功能是通過裂解或消去作用切斷果膠質(zhì)中的糖苷鍵，使果膠質(zhì)裂解為多聚半乳糖醛酸。其主要分為果膠酯酶、原果膠酶、果膠裂解酶 和聚半乳糖醛酸酶等幾大類[8]。病原菌主要可以分泌果膠酶中的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（pectin methylgalacturonase，PMG），破壞果實(shí)的細(xì)胞壁。Chiu等[9]研究表明，褐腐菌在致病的過程中，與PG相關(guān)的果膠基因大量的表達(dá)，這證實(shí)了果膠酶在致病過程中發(fā)揮了重要的作用。纖維素酶是一類能降解纖維素的水解酶。纖維素酶是一組由幾種酶構(gòu)成的一類酶，分別為內(nèi)1,2-β-D-葡聚糖酶（endoglucanase，EG）、1,4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶（4-β-D-glucanase，CX）和β-葡萄糖苷酶[7]。薛蓮等[10]發(fā)現(xiàn)活體外蘋果炭疽菌產(chǎn)生的胞外酶中均能夠檢測(cè)到羧甲基纖維素酶（4-β-D-glucanase，CX），并且活體內(nèi)接種有炭疽病的果實(shí)CX活力顯著高于健康果實(shí)，這在一定程度上證實(shí)了CX在炭疽病病原菌致病過程中的作用。另外，在果實(shí)軟化早期，β-半乳糖苷酶含量豐富，能夠參與降解細(xì)胞壁半乳糖苷鍵，導(dǎo)致細(xì)胞壁的不完整性[11]。

然而，不同的病原菌所分泌的細(xì)胞壁降解酶是不同的，并且不同的降解酶在致病過程中發(fā)揮的作用也不同。目前，對(duì)于影響病原菌產(chǎn)酶作用的報(bào)道并不多。有研究表明，環(huán)境pH值和碳、氮源種類均會(huì)對(duì)病原分泌細(xì)胞壁水解酶產(chǎn)生影響[12-13]。已有研究表明，褐腐菌在侵入果實(shí)組織后，會(huì)產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞壁水解酶[14]，但是對(duì)褐腐菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的培養(yǎng)條件、主要產(chǎn)生何種酶以及其對(duì)果實(shí)結(jié)構(gòu)物質(zhì)的影響鮮見相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以褐腐菌為研究對(duì)象，從培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基pH值、碳源、氮源4方面先后進(jìn)行單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)，研究褐腐菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的最佳條件以及產(chǎn)酶種類；同時(shí)，將制得的粗酶液損傷接種青脆李果實(shí)，研究其對(duì)果實(shí)發(fā)病以及相關(guān)結(jié)構(gòu)物質(zhì)含量的影響，為進(jìn)一步明確褐腐菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的致病作用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用李果實(shí)品種為“青脆李”（Prunus salicina Lindell cv. ‘Qingcuili’），于2015年 7月采收于重慶市北碚區(qū)縉云山果園，所有果實(shí)均采收當(dāng)天運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，挑選大小均勻、成熟度一致、無機(jī)械傷和無病蟲害的果實(shí)，預(yù)冷后，放入0 ℃冷庫中貯藏待用。

褐腐病病原菌（M. fructicola）為本實(shí)驗(yàn)室自行分離、鑒定和保存菌種。

葡萄糖、蔗糖、果糖、羧甲基纖維素（carboxymethyl cellilose，CMC）（均為分析純） 成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

BS-4G振蕩培養(yǎng)箱 金壇市富華儀器有限公司；dHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海東亞壓力容器制造有限公司；680溫控型酶標(biāo)儀 美國(guó)基因公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基組成

種子培養(yǎng)基：分別稱取酵母膏5 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g，用蒸餾水溶解后，定容至1 000 mL，然后分裝于250 mL三角瓶中，121℃條件下滅菌15 min。

液體培養(yǎng)基：KCl 0.5 g，KNO32.0 g，K2HPO41.0 g，F(xiàn)eSO40.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CMC 10 g，蒸餾水1 000 mL。培養(yǎng)液pH值調(diào)至5.0后，分裝于250 mL三角瓶中，每瓶裝50 mL，121 ℃條件下滅菌15 min。

1.3.2 粗酶液制備

將褐腐菌接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基（200 g去皮馬鈴薯加水煮沸20 min后過濾，濾液中加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂粉，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min）上，于25 ℃條件下培養(yǎng)6 d后，挑取大小均勻的菌塊接入種子培養(yǎng)基中，在22 ℃、140 r/min條件下培養(yǎng)2 d，用滅菌紗布濾去菌液，用無菌水沖洗兩遍，將菌絲研磨后用滅菌蒸餾水配成5%菌懸液。吸取1 mL菌懸液接入液體培養(yǎng)基，于22 ℃、140 r/min條件下培養(yǎng)6 d，真空抽濾除去菌絲，于4 ℃、10 000 r/min條件離心15 min，棄去沉淀，留上清液（粗酶液）備用。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)褐腐菌產(chǎn)酶的影響

在50 mL液體培養(yǎng)基中接入1 mL的種子液，于22 ℃、140 r/min搖床中分別培養(yǎng)0、2、4、6、8 d，按照1.3.2節(jié)的方法提取粗酶液，測(cè)定PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的活力。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.3.2 培養(yǎng)基起始pH值對(duì)褐腐菌產(chǎn)酶的影響

分別在pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的50 mL液體培養(yǎng)基中接入1 mL的種子液，于22 ℃、140 r/min搖床中按照1.3.3.1節(jié)得出的最適培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)。按照1.3.2節(jié)的方法提取粗酶液，測(cè)定PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的活力。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.3.3 碳源對(duì)褐腐菌產(chǎn)酶的影響

改變液體培養(yǎng)基中碳源種類和用量：蔗糖、葡萄糖、果糖、CMC（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%），于140 r/min搖床中，在1.3.3.1、1.3.3.2節(jié)得出的最佳培養(yǎng)時(shí)間、pH值條件下培養(yǎng)。按照1.3.2節(jié)的方法提取粗酶液，測(cè)定PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的活力。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.3.4 氮源對(duì)褐腐菌產(chǎn)酶的影響

以1.3.3.3節(jié)得出的最佳結(jié)果為碳源，改變培養(yǎng)基中氮源種類和用量：蛋白胨、酵母膏、尿素、銷酸鉀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、1.5%、2.0%），于140 r/min搖床中，按照1.3.3.1、1.3.3.2節(jié)得出的最佳培養(yǎng)時(shí)間、pH值條件下培養(yǎng)。按照1.3.2節(jié)的方法提取粗酶液，測(cè)定PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的活力。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)時(shí)間（A）、培養(yǎng)基起始pH值（B）、碳源用量（C）、氮源用量（D）為4 個(gè)試驗(yàn)因素，按正交表L16（45）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，分別測(cè)定PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的活力，如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Tabllee 11 Factors and their coded levels used for orthogonal array dessiiggnn

1.3.5 粗酶液中纖維素酶、果膠酶活力測(cè)定

纖維素酶CX、β-葡萄糖苷酶，果膠酶PG、PMG活力測(cè)定參考董小梅[15]的方法。

1.3.6 粗酶液對(duì)采后李果實(shí)發(fā)病情況的影響

按照1.3.4節(jié)得到的條件培養(yǎng)褐腐菌，得到菌懸液，并按照1.3.2節(jié)操作制得粗酶液，備用。將李果實(shí)用清水清洗，自然晾干。用無菌打孔器在果實(shí)赤道部位均勻刺2個(gè)孔（直徑5 mm，深3 mm），在每個(gè)傷口分別接種40 μL以下溶液：Ⅰ無菌水（對(duì)照）；Ⅱ粗酶液。待液體吸收后，單果包裝，貯藏在20 ℃、相對(duì)濕度85%～90%環(huán)境下，并用PE膜覆蓋保濕處理。每天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病斑直徑。每個(gè)處理10 個(gè)果實(shí)，重復(fù)3 次。

1.3.7 粗酶液對(duì)采后李果實(shí)細(xì)胞壁降解酶以及相關(guān)結(jié)構(gòu)物質(zhì)的影響

1.3.7.1 樣品的處理

果實(shí)用自來水沖洗干凈，自然晾干。用無菌鐵釘在果實(shí)赤道部位均勻刺2 個(gè)孔（直徑5 mm，深3 mm），在每個(gè)傷口分別接種40 μL以下溶液：Ⅰ無菌水（對(duì)照）；Ⅱ粗酶液。待處理液吸收干凈后，單果包裝，貯藏在20 ℃、相對(duì)濕度85%～90%環(huán)境下，于貯藏0、12、24、36、48、60、72、84 h取果實(shí)傷口處組織進(jìn)行各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)10 個(gè)果實(shí)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.3.7.2 果實(shí)中纖維素酶、果膠酶的測(cè)定

纖維素酶CX、β-葡萄糖苷酶和果膠酶PG、PMG活力測(cè)定參考董小梅[15]的方法。1.3.7.3 果膠物質(zhì)的測(cè)定

果實(shí)原果膠和可溶性果膠含量參照Manganaris等[16]的方法測(cè)定。

1.3.7.4 纖維素的測(cè)定

采用質(zhì)量法測(cè)定李果實(shí)纖維素含量[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Excel 2016統(tǒng)計(jì)分析所得數(shù)據(jù)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤、制圖；用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行比較分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基pH值對(duì)褐腐菌產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶的影響

圖1 培養(yǎng)時(shí)間（A）和培養(yǎng)基pH值（B）對(duì)褐腐菌產(chǎn)生細(xì)胞壁水解酶的影響Fig. 1 Effect of culture time and pH of culture medium on CWDE production

由圖1A可知，褐腐菌在培養(yǎng)8 d內(nèi)均可產(chǎn)生纖維素酶和果膠酶，PG和PMG兩種酶活力呈先上升、后下降趨勢(shì)，而β-葡萄糖苷酶、CX活力變化不明顯。其中果膠酶活力明顯高于纖維素酶，培養(yǎng)6 d時(shí)，β-葡萄糖苷酶、PG、PMG 3種酶活力達(dá)到峰值，隨后下降。由以上結(jié)論可知，褐腐菌產(chǎn)生胞壁降解酶的培養(yǎng)時(shí)間選擇6 d最好。由圖1B可知，褐腐菌在pH 2.0～6.0范圍內(nèi)都會(huì)產(chǎn)生CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG。其中果膠酶活力明顯高于纖維素酶。當(dāng)pH 4.0時(shí)，4 種酶活力均達(dá)到峰值，分別達(dá)到6.01、6.26、16.44、22.84 U/mL。由以上結(jié)論可知，褐腐菌產(chǎn)生胞壁降解酶的培養(yǎng)基pH 4.0較好。

2.2 碳源對(duì)褐腐菌產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶的影響

圖2 碳源對(duì)褐腐菌產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶活力的影響Fig. 2 Effect of carbon source in the culture medium on the activities of CX, β-glycosidase, PG, and PMG produced by M. fructicola

由圖2可知，褐腐菌在4 種不同碳源（CMC、蔗糖、葡萄糖、果糖）培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG。在以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中，CX、β-葡萄糖苷酶、PMG 3種酶活力均表現(xiàn)為較高水平，PG活力則在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中表現(xiàn)為較高水平。且當(dāng)蔗糖用量為2.5%時(shí)，CX、β-葡萄糖苷酶和PMG活力均達(dá)較高水平，分別為257.68、303.96、280.55 U/mL，PG則在2%達(dá)到最高水平132.63 U/mL。在以CMC為碳源的培養(yǎng)濾液中，CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG 4 種酶活力均為最低。由以上結(jié)論可知，2.5%蔗糖為褐腐菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的最佳碳源。

2.3 氮源對(duì)褐腐菌產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶的影響

圖3 氮源對(duì)褐腐菌產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶的影響Fig. 3 Effect of nitrogen source in the culture medium on the activities of CX, β-glycosidase, PG, and PMG produced by M. fructicola

由圖3可知，褐腐菌在4 種不同氮源（硝酸鉀、蛋白胨、酵母膏、尿素）培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG。在以硝酸鉀為氮源培養(yǎng)的濾液中，4 種酶活力顯著高于其他3種氮源培養(yǎng)基，且在1.5%硝酸鉀為氮源時(shí)， CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG 4 種酶活力最高，分別達(dá)到90.35、89.97、118.31、115.04 U/mL。此外，尿素最不利于PG和PMG的產(chǎn)生，蛋白胨最不利于CX、β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)生。由以上結(jié)論可知，1.5%硝酸鉀為褐腐菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的最佳氮源。

2.4 褐腐菌分泌細(xì)胞壁降解酶條件優(yōu)化

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

從表2可以看出，培養(yǎng)時(shí)間、pH值、碳源用量、氮源用量這4 種不同因素對(duì)褐腐菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶活力的影響各不相同。以各酶總活力為指標(biāo)，得到最優(yōu)組合為A2B4C3D2，CX、β-葡萄糖苷酶、PG和PMG活力分別為567.55、503.07、509.21 U/mL和560.27 U/mL。因此，培養(yǎng)時(shí)間6 d、培養(yǎng)基pH 6.0、3.5%蔗糖、2.5%硝酸鉀為褐腐菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的最佳培養(yǎng)條件。

2.5 粗酶液對(duì)采后李果實(shí)發(fā)病情況的影響

圖4 粗酶液對(duì)采后李果實(shí)發(fā)病情況的影響Fig. 4 Disease incidence and lesion diameter of plum fruits treated with the crude enzymes

由圖4可以看出，對(duì)照組李果實(shí)在整個(gè)貯藏期間未發(fā)病，粗酶液處理組李果實(shí)在發(fā)病隨時(shí)間變化呈上升趨勢(shì)。貯藏48 h，粗酶液處理組果實(shí)開始發(fā)病，在96 h時(shí)發(fā)病率達(dá)到95%，病斑直徑達(dá)到34.77 mm。由照片也可以看出，經(jīng)過粗酶液處理的果實(shí)發(fā)病情況較對(duì)照組明顯。這表明，粗酶液處理可以導(dǎo)致李果實(shí)發(fā)病，酶液是導(dǎo)致李果實(shí)褐腐病發(fā)病的關(guān)鍵因素之一。

2.6 粗酶液對(duì)采后李果實(shí)纖維素酶和果膠酶活力的影響

由圖5A可以看出，貯藏前期，粗酶液處理組果實(shí)CX活力呈波動(dòng)性，但是整體變化不大，對(duì)照組果實(shí)CX活力在貯藏60 h后呈先上升、后下降趨勢(shì)，這一階段對(duì)照組果實(shí)CX活力較粗酶液處理組高。由圖5B可知，貯藏前72 h，對(duì)照組和粗酶液處理組李果實(shí)β-葡萄糖苷酶活力未呈明顯規(guī)律性，貯藏72 h后，粗酶液處理組果實(shí)β-葡萄糖苷酶活力較對(duì)照組高。由圖5C可知，整個(gè)貯藏期間粗酶液處理組果實(shí)PG活力顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。由圖5D可知，貯藏12～60 h內(nèi)，對(duì)照組和粗酶液處理組PMG活力無明顯差異（P＞0.05）；貯藏60～84 h內(nèi)，粗酶液處理組果實(shí)PMG活力逐漸上升，而對(duì)照組果實(shí)呈先下降后上升趨勢(shì)，且粗酶液處理組果實(shí)PMG活力顯著高于（P＜0.05）對(duì)照組。

圖5 粗酶液對(duì)采后李果實(shí)CX（AA）、β-葡萄糖苷酶（BB）、PG（C）、PMG（D）活力的影響Fig. 5 Effect of inoculation with the crude enzymes on the activities of CX (A), β-glycosidase (B), PG (C), and PMG (D) in postharvest plum fruits during storage

2.7 粗酶液對(duì)采后李果實(shí)果膠物質(zhì)的影響

由圖6A可以看出，貯藏36 h內(nèi)，粗酶液處理組果實(shí)可溶性果膠含量較對(duì)照組高；貯藏36～84 h內(nèi)，粗酶液處理組果實(shí)可溶性果膠含量較對(duì)照組低。由圖6B可以看出，貯藏48 h內(nèi)，粗酶液處理組果實(shí)原果膠含量較對(duì)照組果實(shí)低；貯藏48～84 h內(nèi)，粗酶液處理組果實(shí)原果膠含量較對(duì)照組高。

圖6 粗酶液對(duì)采后李果實(shí)可溶性果膠（A）和原果膠（B）含量的影響Fig. 6 Effect of inoculation with the crude enzymes on the contents of pectin and protopectin in postharvest plum fruits during storage

2.8 粗酶液對(duì)采后李果實(shí)纖維素的影響

圖7 粗酶液對(duì)采后李果實(shí)纖維素的影響Fig. 7 Effect of inoculation with the crude enzymes on cellulose activity of postharvest plum fruits during storage

由圖7可以看出，貯藏48 h內(nèi)，對(duì)照組李果實(shí)纖維素含量顯著高于粗酶液處理組（P＜0.05）。貯藏12 h時(shí)，粗酶液處理組果實(shí)纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對(duì)照組果實(shí)低74%。貯藏48～84 h內(nèi)，對(duì)照組和粗酶液處理組之間纖維素含量差異不顯著（P＞0.05）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，M. fructicola在離體條件下可以產(chǎn)生果膠酶和纖維素酶，這些酶類對(duì)采后李果實(shí)相關(guān)結(jié)構(gòu)物質(zhì)有降解作用，是M. fructicola的重要致病因子。這與Manganaris等[16]將M. fructicola接入桃果實(shí)后作用結(jié)果相似。在入侵寄主的過程中，M. fructicola首先產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶，如果膠酶和纖維素酶，破壞李果實(shí)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和相關(guān)組織，加速了病原菌的入侵與營(yíng)養(yǎng)吸收作用，后與果實(shí)建立寄生關(guān)系，大量繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致李果實(shí)褐腐病的發(fā)生。

環(huán)境條件會(huì)影響病原菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶。本研究單因素試驗(yàn)研究結(jié)果表明，以培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基pH值為變量因子時(shí)，果膠酶（PG、PMG）活力高于纖維素酶（CX、β-葡萄糖苷酶）；以培養(yǎng)基中碳源和氮源為變量因子時(shí)，4 種酶活力均變化較大，其中以蔗糖為碳源、硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基中，M. fructicola產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。酸性條件下，褐腐菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的能力增強(qiáng)，從而其致病性也增強(qiáng)，這一結(jié)果與de Cal等[12]的研究一致。Chou等[13]研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖醛酸或葡萄糖作為碳源培養(yǎng)褐腐真菌時(shí)，果膠酶相關(guān)的基因獲得較高的表達(dá)，這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)研究不相符，可能原因?yàn)楣z酶相關(guān)的基因表達(dá)受培養(yǎng)環(huán)境pH值的調(diào)控，pH值在3.5～5之間時(shí)，果膠酶基因表達(dá)加強(qiáng)，而本實(shí)驗(yàn)所采用的最佳pH 6.0，因此其基因表達(dá)出現(xiàn)差異。此外，當(dāng)真菌在硝酸銨或酵母提取物作為氮源培養(yǎng)時(shí)，與果膠相關(guān)的基因表達(dá)也顯著升高，因此，硝酸鹽是有利于M. fructicola和生長(zhǎng)以及分泌胞外酶[18]。此外，在正交試驗(yàn)中可以得出，M. fructicola分泌果膠酶和纖維素酶的最佳條件為：培養(yǎng)時(shí)間6 d、pH 6.0、碳源3.5%蔗糖、氮源2.5%硝酸鉀。

本實(shí)驗(yàn)中，將粗酶液接種到李果實(shí)后，李果實(shí)發(fā)生褐腐病，這與楊海清等[19]研究結(jié)果不一致，在其實(shí)驗(yàn)中，果膠酶液不能使桃果實(shí)發(fā)生褐腐病，可能原因?yàn)椋罕緦?shí)驗(yàn)采用的是混合酶液，而楊海清等[19]使用的是單一的果膠酶液，然而為何混合酶液會(huì)對(duì)果實(shí)產(chǎn)生致病作用，具體原因需進(jìn)一步研究得出。接入酶液后，李果實(shí)中PG和PMG活力明顯升高，而CX和β-葡萄糖苷酶未成明顯規(guī)律性，可能是由于李果實(shí)組織中果膠物質(zhì)含量較高，胞外酶表現(xiàn)底物特異性，因此，PG、PMG活力較強(qiáng)。這一結(jié)論同時(shí)說明，褐腐菌主要產(chǎn)生果膠酶發(fā)揮致病作用，而纖維素酶作用不強(qiáng)[20]。外源果膠酶能影響果實(shí)果膠多糖成分、特殊片段以及化學(xué)結(jié)構(gòu)，甚至導(dǎo)致果實(shí)直接遭受病害[21-22]。

李果實(shí)接種粗酶液后其關(guān)結(jié)構(gòu)物質(zhì)發(fā)生變化。結(jié)果表明，粗酶液處理能夠引起果實(shí)果膠和纖維素含量發(fā)生改變。這一結(jié)果與Faulkner[23]、Skamnioti[24]等研究結(jié)果一致。許多真菌穿透宿主細(xì)胞表皮層之后，通過細(xì)胞壁相關(guān)降解酶分解果皮、果肉組織中的果膠和纖維素，最后導(dǎo)致二者的降解，胞外纖維素酶則通過綁定到外層膜組分降解纖維素[25]。然而，真菌侵染是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及其他細(xì)胞壁降解酶和毒素等致病因素，如激發(fā)子、胞外多糖等，這些物質(zhì)是如何協(xié)同發(fā)揮作用導(dǎo)致李果實(shí)褐腐病的發(fā)生，需進(jìn)一步的研究[26-30]。

由以上研究可以得出：M. fructicola產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶的最佳條件為：培養(yǎng)時(shí)間6 d、pH 6.0、碳源3.5%蔗糖、氮源2.5%硝酸鉀；粗酶液能夠?qū)е吕罟麑?shí)發(fā)生褐腐病，使果實(shí)快速腐爛；酶液引起果實(shí)PG、PMG活力的上升，加速果實(shí)可溶性果膠物質(zhì)的溶出，以及原果膠物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性果膠，同時(shí)，會(huì)引起李果實(shí)纖維素含量的下降，加速果實(shí)的軟化腐爛進(jìn)程。

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Optimization of Culture Conditions of Monilinia fructicola for the Production of Cell Wall Degrading Enzymes and Their Involvement in Brown Rot Pathogenesis of Postharvest Plums

ZHANG Jie1, FAN Xianfang1, YAO Shixiang1,2, DENG Lili1,2, ZENG Kaifang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;2. Chongqing Engineering Research Center for Special Food, Chongqing 400715, China)

The aims of this study were to optimize the culture conditions of Monilinia fructicola for the production of cell wall degrading enzymes (CWDE) and to clarify the role of the culture supernatant obtained as crude CWDE in the pathogenesis of brown rot caused by Monilinia fructicola in postharvest plums. The optimization of the culture conditions was carried out using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. Besides, the pathogenesis was investigated by wounding and inoculating plum fruits w ith the crude CWDE and observing the incidence of brown rot. The results showed that the optimal culture conditions were as follows∶ culture time, 6 d; pH, 6.0; 3.5% sucrose as carbon source; and 2.5% KNO3as nitrogen source. The crude enzymes produced by M. fructicola could cause brown rot of plum fruits. In addition, the activities of polygalacturonase (PG), pectin methylgalacturonase (PMG) in the fruits inoculated with the crude enzymes were enhanced, thereby leading to the conversion of insoluble protopectin to soluble pectin and cellulose reduced cellulose content and consequently accelerating the softening and rotting process.

brown rot; cell wall degrading enzymes; plum; pathogenesis

10.7506/spkx1002-6630-201720003

S436.639

A

1002-6630（2017）20-0012-08

張婕, 凡先芳, 姚世響, 等. 李果實(shí)褐腐病病原菌產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶條件優(yōu)化及其致病機(jī)理[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20):12-19. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720003. http://www.spkx.net.cn

ZH ANG Jie, FAN Xianfang, YAO Shixiang, et al. Optimization of culture conditions of Monilinia fructicola for the production of cell wall degrading enzymes and their involvement in brown rot pathogenesis of postharvest plums[J]. Food Science, 2017,38(20)∶ 12-19. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720003. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-23

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303075）；重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CYS16071）

張婕（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：zhangjie_libra@163.com

*通信作者：曾凱芳（1972—），女，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：zengkaifang@163.com