釀酒甘蔗汁酶解工藝研究

朱香澔，曹雨珊，伍淑婕，*，羅楊合，*，蘇麗玲

（1.賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣西賀州542899；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

釀酒甘蔗汁酶解工藝研究

朱香澔1，2，曹雨珊1，伍淑婕1，*，羅楊合1，*，蘇麗玲1

（1.賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，廣西賀州542899；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

甘蔗汁釀造果酒可通過果膠酶酶解處理降低其甲醇含量。以D-半乳糖醛酸含量為考察指標(biāo)，通過單因素和正交試驗(yàn)得出甘蔗汁酶解的最佳工藝條件：酶解溫度為60℃、酶解時(shí)間為3.5 h、酶解量為1.0%、酶解pH值為2.5，在此條件下酶解所得甘蔗汁中的D-半乳糖醛酸含量最高為85.5 mg/mL，酶解處理效果最好。

甘蔗汁；酶解；果膠酶；D-半乳糖醛酸

Abstract：In the process of making wine by sugarcane juice，the content of methanol and the clarity of wine could be ruduced by enzymolysis with pectinase.The optimum conditions for enzymatic hydrolysis of sugarcane juice were obtained through single factor and orthogonal experiment，and the content of D-galactose acid was used as the index.The result was showed as follows：the temperature and time of enzymatic hydrolysis was 60 ℃and 3.5 h respectivily，the pectinase dosage was 1.0%，the enzymatic hydrolysis of pH was 2.5，in these conditions the content of D-galacturonic acid in sugarcane juice was the highest of 85.5 mg/mL by enzymatic hydrolysis，the effect of enzymatic treatment was best.

Key words：sugarcane juice；enzymatic hydrolysis；pectinase；D-galacturonic acid

甘蔗，是禾本科甘蔗屬（SaccharumL.）多種植物的統(tǒng)稱，約12種，分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)[1]。甘蔗具有多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中糖分和水分含量比較高，同時(shí)在甘蔗汁中含有有助于人體新陳代謝的鐵、鈣、磷、錳、鋅等礦物質(zhì)元素[2]。由于甘蔗汁經(jīng)過發(fā)酵后在甘蔗果酒中富含多種不同的有機(jī)酸類和多酚類物質(zhì)，因此經(jīng)常飲用甘蔗果酒能美容養(yǎng)顏、延緩衰老[3]。但甘蔗汁中的粗果膠含量較多為565 mg/100 mL[4]，在甘蔗果酒發(fā)酵過程中，微生物會(huì)對(duì)原料中的果膠質(zhì)、甘氨酸、纖維素等成分進(jìn)行發(fā)酵利用產(chǎn)生甲醇。甲醇對(duì)人體視網(wǎng)膜細(xì)胞有極強(qiáng)毒性，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致失明和嚴(yán)重酸中毒，成人飲用5 mL～10 mL甲醇后即會(huì)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，甲醇致死量約50 mL[5]；在果酒釀造過程中生成雜醇油也稱高級(jí)醇，而雜醇油主要是由蛋白質(zhì)和糖類的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化形成[6]，同時(shí)雜醇油也是酒食品工業(yè)的副產(chǎn)品[7]，其產(chǎn)生決定于酶、含氮物質(zhì)的添加及發(fā)酵和精餾條件[8]，它雖然是果酒香味的主要構(gòu)成物質(zhì)之一，但含過多的雜醇油除了會(huì)對(duì)果酒的風(fēng)味產(chǎn)生不良影響[9]，所以甲醇含量是果酒的主要限量指標(biāo)之一[10]。此外，水果中高含量的果膠會(huì)使壓榨與澄清困難，形成分層和渾濁[11]，因此甘蔗汁釀酒前進(jìn)行果膠酶酶解處理，快速脫除果膠[12]等物質(zhì)對(duì)降低甲醇含量和提高酒體澄清度是極其必要的。

果膠酶是一組能高效降解果膠以及其他導(dǎo)致混濁的阿拉伯聚糖、纖維素、半纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)等不溶性物質(zhì)，保證產(chǎn)品良好澄清度的酶系，主要包括原果膠酶、果膠多聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶和果膠甲酯水解酶、果膠裂合酶等[13]。果膠酶在食品工業(yè)的應(yīng)用很多，主要用于葡萄籽多酚提取、水果及飼料加工等方面[14-16]。在果汁加工過程中加入果膠酶可以酶解果膠降低果汁的黏度，使得果汁在過濾過程中可以縮短過濾時(shí)間，同時(shí)具有加速和增強(qiáng)果汁的澄清作用，能夠提高果汁出汁率等[17-24]。果膠酶的使用在降低甲醇方面也有相關(guān)的研究，在果酒的發(fā)酵前期使用果膠酶對(duì)果膠進(jìn)行酶解能夠降低果酒中的甲醇和雜醇油的產(chǎn)生，提高產(chǎn)品的質(zhì)量[25]。

本研究選擇適合果汁專用的酸性果膠酶，其適宜pH值在3.0～6.0之間，為后續(xù)的酒精發(fā)酵提供有利環(huán)境，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行甘蔗汁酶解工藝研究，為釀造低度甘蔗汽酒的原材料預(yù)處理提供了科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

黑皮甘蔗：賀州市八步區(qū)三加村，榨汁4℃短時(shí)間冷藏備用；酸性果膠酶（食品級(jí)，1 000 U/mL）：廣州明曜公司。

DNS（3，5-二硝基水楊酸）、四水合酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

722型分光光度計(jì)：上海分析儀器總廠；AR224CN電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；FG2-FK型手持便攜式酸度計(jì)：北京賽多利斯；SXZ-80齒輪箱甘蔗榨汁機(jī)：浙江應(yīng)曉有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗汁最佳酶解工藝條件的探究

量取100.0 mL/組的甘蔗汁5組，每組3個(gè)平行進(jìn)行酶解試驗(yàn)，基礎(chǔ)試驗(yàn)條件為：果膠酶用量（質(zhì)量比，以甘蔗汁質(zhì)量計(jì)）0.50%，pH=3.0，酶解時(shí)間3.5 h，酶解溫度50℃。變量分別進(jìn)行以下調(diào)整：果膠酶用量為0.30%、0.50%、0.70%、0.90%、1.10%；pH 值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5；酶解時(shí)間設(shè)為 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h；酶解溫度分別為 40、45、50、55、60、65 ℃，根據(jù)以上變量進(jìn)行各單因素試驗(yàn)，酶解處理后測(cè)甘蔗汁中D-半乳糖醛酸含量，考察酶解溫度、酶解時(shí)間、果膠酶用量和酶解pH值等因素對(duì)果膠酶解的影響。通過單因素試驗(yàn)結(jié)果分析獲得各因素適宜水平值，設(shè)計(jì)正交水平表進(jìn)行L9（34）試驗(yàn)，仍以D-半乳糖醛酸含量為檢測(cè)指標(biāo)，并對(duì)指標(biāo)值進(jìn)行極差分析。

1.2.2 D-半乳糖醛酸的測(cè)定

D-半乳糖醛酸參考3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[26]進(jìn)行測(cè)定。

準(zhǔn)確吸取1.0 mg/mL的D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL、分別加入 7 支試管中，再分別加入3.5 g/L的3，5-二硝基水楊酸溶液4 mL，而后以pH值為4.6的檸檬酸-磷酸緩沖溶液加至8 mL，再將8支試管沸水浴5 min后流水沖洗迅速冷卻至室溫，搖勻，以1號(hào)試管為空白，在波長540 nm下測(cè)定其吸光值見圖1。

圖1 D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of D-galacturonic acid

由圖1可知，吸光度值與D-半乳糖醛酸濃度成線性關(guān)系，回歸方程為：為y=0.694 7x-0.012 5，R2=0.999，濃度線性范圍為0.0～1.0 mg/mL。待測(cè)樣品中的D-半乳糖醛酸含量可根據(jù)此公式計(jì)算得來。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗汁最佳酶解工藝條件的確定

2.1.1 果膠酶用量對(duì)果膠酶酶解效果的影響

果膠酶用量對(duì)酶解后D-半乳糖醛酸含量的影響見圖2。

圖2 果膠酶用量對(duì)酶解后D-半乳糖醛酸含量的影響Fig.2 Effect of pectinase dosage on the content of D-galacturonic acid

由圖2可知，果膠酶用量（質(zhì)量比）對(duì)甘蔗汁中果膠的酶解效果影響明顯，呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。當(dāng)果膠酶用量在0～0.9%之間遞增時(shí)，甘蔗汁中D-半乳糖醛酸含量顯著增加。果膠酶用量的增加使果膠、纖維素等大分子物質(zhì)的分解更加充分，所以酶解產(chǎn)物含量D-半乳糖醛酸含量不斷增加。繼續(xù)增加果膠酶用量時(shí)，酶解液中D-半乳糖醛酸含量變化不大，說明甘蔗汁中果膠質(zhì)與纖維素已酶解較為徹底，出于對(duì)成本考慮，確定果膠酶的適宜用量為0.9%。

2.1.2 酶解pH值對(duì)果膠酶酶解效果的影響

酶解pH值對(duì)酶解后D-半乳糖醛酸含量的影響見圖3。

圖3 酶解pH值對(duì)酶解后D-半乳糖醛酸含量的影響Fig.3 Effect of enzyme solution pH on the content of D-galacturonic acid

每一種酶都具有最適的pH值，在最適的pH值條件下，活性最大。從圖3可知，該酸性果膠酶系對(duì)pH值的適宜范圍在2～3.5之間，在pH 2～3.5的范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，甘蔗汁中果膠的酶解產(chǎn)物D-半乳糖醛酸含量逐漸上升，而后趨于平穩(wěn)，這是由于隨著pH值的增加，果膠酶的活性也隨著增加；pH值為3.0時(shí)，甘蔗汁中的D-半乳糖醛酸含量最高，為52.3 mg/mL；當(dāng)pH＞3.5時(shí)，酶活逐步受到抑制并迅速下降，pH=4時(shí)，甘蔗汁中的D-半乳糖醛酸含量迅速將至31.8 mg/mL，可見該果膠酶系適于低pH值環(huán)境，同時(shí)低pH值有利于酶解過程中雜菌的抑制，保證了甘蔗汁原料在雜菌污染方面的控制。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)果膠酶酶解效果的影響

酶解時(shí)間對(duì)酶解后D-半乳糖醛酸含量的影響見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)酶解后D-半乳糖醛酸含量的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on the content of D-galacturonic acid

從圖4可知，隨著果膠酶酶解處理時(shí)間的增加，甘蔗汁中D-半乳糖醛酸的含量先逐步上升，在處理3.5 h時(shí)達(dá)到48.8 mg/mL，此后含量趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)樵诠z酶酶系中，原果膠酶使天然果膠轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄怨z，而果膠甲酯水解酶催化果膠甲基化作用產(chǎn)生果膠酸（聚半乳糖醛酸鹽）后，聚半乳糖醛酸酶和果膠裂合酶均可作用于果膠或果膠酸，其中聚半乳糖醛酸酶的外切和內(nèi)切活性能水解果膠中的α-1，4糖苷鍵生成D-半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸等降解物，而果膠裂合酶則可通過β-消除機(jī)制斷裂聚半乳糖醛酸鹽或果膠鏈，導(dǎo)致在非還原性末端的C4和C5間形成一個(gè)雙鍵，生成不飽和半乳糖醛酸[13，27]。因此，隨著果膠酶處理時(shí)間的延長，在此一系列的酶解反應(yīng)中，甘蔗汁中逐步產(chǎn)生半乳糖醛酸、寡聚半乳糖醛酸、不飽和半乳糖醛酸和寡聚半乳糖酸等降解物在3.5 h之后趨于穩(wěn)定。

2.1.4 酶解溫度對(duì)果膠酶酶解效果的影響

酶解溫度對(duì)果膠酶酶解效果的影響見圖5。

由圖5中可知，隨著酶解處理溫度的升高，甘蔗汁中D-半乳糖醛酸含量先升后降。當(dāng)酶解溫度60℃時(shí)，D-半乳糖醛酸含量達(dá)到最高值56.9 mg/mL，說明此時(shí)的溫度為酶解適宜溫度，當(dāng)溫度提高到65℃后，超出果膠酶的最適酶解溫度酶活下降，D-半乳糖醛酸含量下降。

圖5 酶解溫度對(duì)酶解后D-半乳糖醛酸含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the content of D-galacturonic acid

2.1.5 果膠酶酶解甘蔗汁最佳條件組合的確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，以果膠酶用量、酶解pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度四因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，測(cè)酶解后甘蔗汁中的D-半乳糖醛酸含量，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 果膠酶酶解對(duì)酶解效果影響的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal test results of pectinase hydrolysis conditions on the effect of enzymolysis

從表1可知，5號(hào)試驗(yàn)組的D-半乳糖醛酸含量實(shí)測(cè)值最高。經(jīng)極差分析可知，對(duì)果膠酶酶解效果影響的主次因素順序?yàn)椋好附鉁囟龋竟z酶用量＞酶解時(shí)間＞酶解pH值，果膠酶酶解的最佳工藝條件組合為A3B3C3D1，即酶解溫度為62℃、酶解時(shí)間為4 h、果膠酶用量為1.0%、酶解pH值為2.5。統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果與實(shí)際試驗(yàn)所得的組合有所不同，為進(jìn)一步驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)分析所得的最佳工藝條件組合與5號(hào)試驗(yàn)組組合的酶解效果，因此進(jìn)行了以下試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

將正交試驗(yàn)組中酶解效果最好的組合A2B2C3D1與經(jīng)正交試驗(yàn)極差分析所得的最優(yōu)組合A3B3C3D1進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)驗(yàn)證，測(cè)其D-半乳糖醛酸含量，結(jié)果見表2。

表2 果膠酶酶解最佳條件組合驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of verification test of optimum condition combination with pectinase hydrolysis

從表2可知，經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)后的A2B2C3D1組合比A3B3C3D1組合酶解后的D-半乳糖醛酸含量高，即果膠酶酶解甘蔗汁的最優(yōu)工藝條件為：酶解溫度為60℃、酶解時(shí)間為3.5 h、果膠酶用量為1.0%、酶解pH值為2.5。

3 結(jié)論

以賀州黑皮甘蔗為原料進(jìn)行榨汁，然后加入果膠酶對(duì)甘蔗汁進(jìn)行果膠酶酶解工藝的研究。經(jīng)過試驗(yàn)得到果膠酶酶解甘蔗汁處理的最佳酶解工藝條件為：酶解溫度為60℃、酶解時(shí)間為3.5 h、酶解量為1.0%、酶解pH值為2.5，此時(shí)甘蔗汁中酶解降解物D-半乳糖醛酸含量為85.5 mg/mL，酶解效果最好，有利于后續(xù)釀酒過程中甲醇含量的控制及果酒的澄清。

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Study on Enzymatic Process of Sugarcane Juice for Brewing

ZHU Xiang-hao1，2，CAO Yu-shan1，WU Shu-jie1，*，LUO Yang-he1，*，SU Li-ling1
（1.Food Science and Biology Technology Engnieering Institute，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China；2.School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

2017-06-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.012

國家自然科學(xué)基金（21365011）；廣西高校重點(diǎn)學(xué)科“農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程”桂教科研（[2013]16-123）；賀州學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（HZUBS201608）；賀州學(xué)院教授科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（HZUJS201613）

朱香澔（1992—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

*通信作者：伍淑婕（1973—），女（漢），副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。