丁香疫霉熱處理方法的比較與分析

劉娟，樓閣，王娓辰，程瑜，楊茜，姜濤，王偉，魏亞東

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300457）

丁香疫霉熱處理方法的比較與分析

劉娟，樓閣，王娓辰，程瑜，楊茜，姜濤，王偉，魏亞東*

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300457）

對丁香疫霉不同熱處理的方法進(jìn)行比較與分析。對丁香疫霉分別使用熱水、干熱和蒸熱3種不同的熱處理方式，每種處理方式均設(shè)置不同溫度梯度、處理時(shí)間進(jìn)行處理，相同培養(yǎng)條件下觀察其菌絲體的生長情況。試驗(yàn)表明熱水處理?xiàng)l件下50℃以上，超過2 min離體丁香疫霉菌絲體沒有生長。干熱處理?xiàng)l件下50℃處理15 min離體丁香疫霉菌絲體沒有生長。蒸熱處理?xiàng)l件下50℃處理10 min離體丁香疫霉菌絲體沒有生長。綜合比較分析，得到處理效果熱水處理＞蒸熱處理＞干熱處理，熱水處理作為檢疫性丁香疫霉菌絲的最佳抑制方式。

丁香疫霉；熱水處理；干熱處理；蒸熱處理

Abstract：The methods of different heat treatment ofPhytophthora syringaewerecompared and analyzed.Three different heat treatments：hot water，hot air and hot vapor air were used forPhytophthora syringae，and each treatment method was set to different temperature gradients and processing time to observe the growth of mycelium under the same culture conditions.The tests show that：after hot water treatment above 50 ℃ for more than 2 minutes，Phytophthora syringaein vitro did not grow.At 50 ℃ hot air treatment conditions for 15 minutes，Phytophthora syringaein vitro did not grow.Under 50℃ hot vapor air treatment condition for 10 minutes，Phytophthora syringaein vitro did not grow.After a comprehensive comparative analysis，the effect of the three treatments is hot water treatment＞ hot air treatment＞ hot vapor air treament，and hot water treatment were proved to be the best suppression mode forPhytophthora syringae.

Key words：Phytophthora syringae；hot water treatment；hot air treatment；hot vapor air treatment

柑橘是我國進(jìn)口量較大的一種水果，2015年進(jìn)口21.49萬噸，貨值2.67億美元[1]。與2014年[2]相比分別增長了32.82%和16.09%。從進(jìn)口柑橘的類別來看，我國進(jìn)口最多的柑橘類水果是甜橙，占進(jìn)口量一半以上，其次是檸檬來檬、柚類和寬皮柑橘。但柑橘屬水果多會攜帶有害生物，多達(dá)350余種，僅美國和意大利柑橘攜帶的檢疫性有害生物就涉及昆蟲、螨、線蟲、真菌和病毒四大類，39種檢疫性有害生物。其中丁香疫霉病菌因危害嚴(yán)重、擴(kuò)散性強(qiáng)、無有效的檢疫處理手段而成為對我國水果生產(chǎn)安全危害最為嚴(yán)重的外來有害生物之一[3-5]。

丁香疫霉菌[Phytophthora syringae（Berk.）Kleb.]，屬藻菌界（Chromista），卵菌門（Oomycota），腐霉目（Pythiaceae），疫霉屬（Phytophthora）?？梢鸺闹鞯母?、莖、葉、果實(shí)的多種病害。病菌在柑橘的所有生長階段均產(chǎn)生危害，導(dǎo)致果腐（brown rot of fruit）、根腐（root rot）、樹干基部的腳腐（foot rot）、果實(shí)和枝干的流膠?。╣ummosis of citrus）[6]。目前，丁香疫霉在歐洲、北美洲、南美洲、非洲和亞洲等均有分布。主要分布于美國、加拿大、阿根廷、巴西、意大利等國家。2011年2月12日，天津出入境檢驗(yàn)檢疫局從美國進(jìn)口的臍橙[Citrus sinensis（L.）Osbeck]中截獲到丁香疫霉，這是我國首次從進(jìn)口的水果中截獲到丁香疫霉[7]。

對于丁香疫霉的處理方法，目前國內(nèi)外對此研究的報(bào)道甚少。Adaskaveg和Forster[8]使用磷酸鉀對丁香疫霉菌絲體進(jìn)行處理，并取得較好的效果[9-11]。但是長期使用殺菌劑會對環(huán)境造成污染，對抗原菌本身造成抗藥性。近年來，熱處理方法因?yàn)榫哂胁僮骱啽恪o污染、無殘留的優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于柑橘采后病蟲害的防治中，成為替代藥劑處理的最佳方法[12-14]。

熱處理技術(shù)能抑制病原菌的原理是利用高于病原菌最適宜生長溫度條件，使病原菌蛋白質(zhì)（酶）、核酸和脂類等重要生物高分子發(fā)生降解或改變其空間結(jié)構(gòu)，從而變性或破壞，新陳代謝無法正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致死亡。目前的熱處理技術(shù)主要有：低溫?zé)崽幚恚–uring）、蒸熱處理（Vapor air）、干熱（Hot air treatment，HAT）、熱水處理（Hot water treatment，HWT）和熱處理與其他處理相結(jié)合等方法。而使用較多的是熱水處理和熱空氣處理[15]。

本文就不同溫度、不同時(shí)間的熱水、蒸熱、干熱3種方式對丁香疫霉處理后進(jìn)行日常觀測，分析最佳熱處理方式，旨在為進(jìn)境柑橘屬水果丁香疫霉的處理工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試丁香疫霉菌株：天津檢驗(yàn)檢疫局截獲的美國臍橙；PDA培養(yǎng)基：天津川禾醫(yī)療科技有限公司。

WNB20型恒溫水浴搖床（控溫范圍：10℃～95℃，控制精度：±1℃）、UF160Plus型烘箱（控溫范圍20℃～300℃，精度±0.1 K）：德國 Memmert公司；蒸熱處理箱（控溫范圍：-5℃～100℃，均勻度：≤2℃，溫度偏差：≤±2℃，濕度范圍：30%R.H～98%R.H，濕度偏差：≤±5%R.H）：重慶威爾公司；177-T4型溫度計(jì)（量程：-200℃～1 000℃，測溫精度：±0.5%）：德國 TESTO 公司；MIR-554-PC低溫恒溫培養(yǎng)箱（控溫范圍-10℃～60℃，控制精度±0.5℃）：日本Panasonic公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 丁香疫霉菌絲體離體熱水處理

設(shè)定45、50、55、60℃4個(gè)溫度梯度。每個(gè)溫度梯度下分別設(shè)置1、2、3 min 3個(gè)時(shí)間梯度。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)1管丁香疫霉菌絲體。對照組放入25℃無菌水中浸泡2 min。在2 mL的PCR管中加入1.5 mL無菌水，用溫度計(jì)測量管內(nèi)水溫，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度，使實(shí)測溫度與預(yù)設(shè)溫度差值小于0.5℃。從水浴鍋中迅速挑出菌絲加入PCR管中，然后放入水浴鍋內(nèi)按預(yù)設(shè)時(shí)間進(jìn)行處理。處理后立即將帶有菌絲體的PCR管插入冰盒中降溫，待溫度下降后，取出PCR管，將菌絲挑入PDA培養(yǎng)基中。而后將接種有丁香疫霉的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中在15℃條件下儲存。每天用十字交叉法測量培養(yǎng)皿中的菌落直徑。持續(xù)觀察30 d，如果菌落直徑不增長，則視為該處理可殺滅丁香疫霉。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.2.2 丁香疫霉菌絲體離體干熱處理

設(shè)定 40℃下處理 35、40、45 min，45℃下處理 15、20、25 min，以及 50℃下處理 5、10、15 min，共 9個(gè)處理。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)1個(gè)培養(yǎng)皿。將丁香疫霉接種到PDA培養(yǎng)基上，15℃下培養(yǎng)12 h后進(jìn)行干熱處理。對照置于室溫環(huán)境下，不進(jìn)行干熱處理。處理時(shí)先將烘箱溫度調(diào)節(jié)到設(shè)定的溫度，待烘箱實(shí)測溫度穩(wěn)定在設(shè)定溫度的±0.5℃之間時(shí)，打開倉門放入培養(yǎng)皿。當(dāng)烘箱實(shí)測溫度恢復(fù)至設(shè)定溫度的±0.5℃之間時(shí)，開始計(jì)時(shí)。干熱完成后將接種有丁香疫霉的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中在15℃條件下儲存。每天用十字交叉法測量培養(yǎng)皿中的菌落直徑。持續(xù)觀察30 d，如果菌落直徑不增長，則視為該處理可殺滅丁香疫霉。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.2.3 丁香疫霉菌絲體離體蒸熱處理

試驗(yàn)在96%飽和蒸汽壓下，設(shè)定40℃下處理10、15、20 min，45℃下處理 2、5、10 min，以及 50℃下處理2、5、10 min，共9個(gè)處理。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)1個(gè)培養(yǎng)皿。將丁香疫霉接種到PDA培養(yǎng)基上，15℃下培養(yǎng)12 h～24 h后進(jìn)行蒸熱處理。對照置于室溫環(huán)境下，不進(jìn)行蒸熱處理。處理時(shí)先將蒸熱處理箱溫度調(diào)節(jié)到設(shè)定的溫度，待烘箱實(shí)測溫度穩(wěn)定在設(shè)定溫度的±0.5℃之間，RH達(dá)到96%時(shí)，打開倉門放入培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿蓋打開。當(dāng)恒溫恒濕箱相對濕度達(dá)到96%，實(shí)測溫度溫度恢復(fù)至設(shè)定溫度的±0.5℃之間時(shí)，開始計(jì)時(shí)。蒸熱完成后將接種有丁香疫霉的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中在15℃條件下儲存。每天用十字交叉法測量培養(yǎng)皿中的菌落直徑。持續(xù)觀察30 d，如果菌落直徑不增長，則視為該處理可殺滅丁香疫霉。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香疫霉菌絲體離體熱水處理效果分析

丁香疫霉菌絲體離體熱水處理效果見表1。

由表1可見，對照組的菌落增長速度最快，與熱水處理后相比，未處理的丁香疫霉菌落增長值與處理后多個(gè)數(shù)據(jù)能表現(xiàn)出顯著差異。對照組在第10天時(shí)菌落即將長滿培養(yǎng)皿。第10天時(shí)，經(jīng)50℃處理2 min、50℃處理3 min、55℃處理2 min和60℃處理2 min的丁香疫霉菌落均未增長，與對照組相比差異最為顯著。經(jīng)過熱水處理后的菌落生長情況依照處理時(shí)間長短表現(xiàn)出差異顯著。經(jīng)處理后的菌落生長速度顯著低于對照，說明熱水處理對丁香疫霉的生長起到了抑制作用。經(jīng)連續(xù)觀察30 d，這幾個(gè)處理的丁香疫霉菌落也未增長，說明50℃熱水處理2 min、50℃熱水處理3 min、55℃熱水處理2 min和60℃熱水處理2 min可有效殺滅離體條件下的丁香疫霉。

表1 丁香疫霉菌絲體離體熱水處理效果Table 1 Effects of Hot water treatment on myceliumofP.syringaein vitro

2.2 丁香疫霉菌絲體離體干熱處理效果分析

丁香疫霉菌絲體離體干熱處理效果見表2。

表2 丁香疫霉菌絲體離體干熱處理效果Table 2 Effects of Hot air treatment on mycelium ofP.syringae in vitro

由表2可見，對照組的菌落增長速度最快，與干熱處理后相比，未處理的丁香疫霉菌落增長值與處理后多個(gè)數(shù)據(jù)能表現(xiàn)出顯著差異。對照組在第10天時(shí)菌落即將長滿培養(yǎng)皿。第10天時(shí)，經(jīng)40℃處理45 min、45℃處理20 min、45℃處理25 min和50℃處理15 min的丁香疫霉菌落均未增長，與對照組相比差異最為顯著。經(jīng)過干熱處理的菌落生長速度顯著低于對照，說明干熱處理對丁香疫霉的生長具有抑制作用。經(jīng)連續(xù)觀察30 d，這幾個(gè)處理的丁香疫霉菌落也未增長，說明40℃干熱處理45 min、45℃干熱處理20 min和50℃干熱處理15 min可有效殺滅離體條件下的丁香疫霉。

2.3 丁香疫霉菌絲體離體蒸熱處理效果分析

丁香疫霉菌絲體離體蒸熱處理效果見表3。

表3 丁香疫霉菌絲體離體蒸熱處理效果Table 3 Effects of Hot vapor air treatment on mycelium ofP.syringae in vitro

由表3可見，對照組的菌落增長速度最快，與蒸熱處理后相比，未處理的丁香疫霉菌落增長值與處理后多個(gè)數(shù)據(jù)能表現(xiàn)出顯著差異。對照組在第10天時(shí)菌落即將長滿培養(yǎng)皿，第10天時(shí)，經(jīng)40℃處理20 min、45℃處理10 min、50℃處理5 min和50℃處理10 min的丁香疫霉菌落均未增長。與對照組相比差異最為顯著。第10天此時(shí)經(jīng)過蒸熱處理的菌落均未長滿。經(jīng)處理后的菌落生長速度顯著低于對照，說明蒸熱處理對丁香疫霉的的生長具有抑制作用。經(jīng)連續(xù)觀察30 d，這幾個(gè)處理的丁香疫霉菌落也未增長，說明40℃蒸熱處理20 min、45℃蒸熱處理10 min和50℃蒸熱處理10 min，可有效殺滅離體條件下的丁香疫霉。

3 結(jié)論與討論

比較離體丁香疫霉菌絲體在熱水處理、干熱處理、蒸熱處理3種不同處理?xiàng)l件下的生長情況。試驗(yàn)表明：1）隨處理溫度和處理時(shí)間的提高，幾種處理方式對丁香疫霉具有良好的抑制效果。相同處理溫度下，處理時(shí)間越長，抑制效果越好。相同處理效果下，處理溫度越高，處理所需時(shí)間越短。2）熱水處理?xiàng)l件下50℃處理2 min、50℃處理3 min、55℃處理2 min和60℃處理2 min可有效殺滅離體條件下的丁香疫霉；干熱處理?xiàng)l件時(shí)，40℃處理45 min、45℃處理20min和50℃處理15 min可有效殺滅離體條件下的丁香疫霉；蒸熱處理時(shí)，40℃處理20 min、45℃處理10 min和50℃處理5 min可有效殺滅離體條件下的丁香疫霉。

綜上所述，用50℃熱水處理超過2 min即可有效殺滅丁香疫霉，相較于干熱處理和蒸熱處理效果最佳。蒸熱處理的效果又優(yōu)于干熱處理。因此，3種熱處理的處理效果為熱水處理＞蒸熱處理＞干熱處理。熱水處理效果最佳是因?yàn)樗瓤諝獾臒醾鬟f效率更高，并具有清洗消毒的作用。同時(shí)，熱水處理的加工成本僅為傳統(tǒng)熱空氣處理的10%[16]，從處理效果和處理效率上來講都是一種理想的處理方法。本試驗(yàn)僅對離體條件下的丁香疫霉菌進(jìn)行了處理，在今后的研究中，應(yīng)著力研究熱水處理對柑橘屬水果攜帶的丁香疫霉菌的處理效果。

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Comparison and Analysis of Phytophthora syringae Heat Treatment Method

LIU Juan，LOU Ge，WANG Wei-chen，CHENG Yu，YANG Xi，JIANG Tao，WANG Wei，WEI Ya-dong*
（Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300457，China）

2017-01-04

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.042

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201411054）；天津檢驗(yàn)檢疫科技計(jì)劃項(xiàng)目（TK074-2013）

劉娟（1984—），女（漢），工程師，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品和植物檢疫的研究。

*通信作者：魏亞東,研究員，本科。