泉州市部分海產(chǎn)品中霍亂弧菌的實時熒光定量PCR檢測及分析

莊月娥

(泉州醫(yī)學高等?？茖W校 362000)

泉州市部分海產(chǎn)品中霍亂弧菌的實時熒光定量PCR檢測及分析

莊月娥

(泉州醫(yī)學高等?？茖W校 362000)

對泉州市某區(qū)海產(chǎn)品中的霍亂弧菌進行實時熒光定量PCR檢測，經(jīng)特異性試驗表明：該方法能選擇性檢測O1和O139群霍亂弧菌，而且特異性好、靈敏度高，能有效克服假陽性，結(jié)合傳統(tǒng)的病原微生物培養(yǎng)方法，可用于臨床檢驗及衛(wèi)生檢測。檢測結(jié)果顯示，該次送檢海產(chǎn)品檢出的2例O1霍亂弧菌均無毒力基因ctx，但仍需加強監(jiān)測，預(yù)防散發(fā)和暴發(fā)流行。

霍亂弧菌；熒光定量PCR；檢測

Abstract:Vibriocholeraein some marine products in Quanzhou City was detected by real-time fluorescent quantitative PCR, the specificity test showed that this method could selectively detectVibriocholeraeO1 and O139 group with good specificity and high sensitivity, and effectively overcome the false positives, and had great guidance on the significance of clinical examination and health inspection combined with the traditional culture method of pathogenic microorganisms. The tested results showed that both two case of detectedVibriocholeraefrom tested marine products had no virulence genes CTX, but still needed to strengthen the monitoring to prevent distribution and outbreak of the disease.

Keywords:Vibriocholerae; fluorescent quantitative PCR; detection

霍亂是因霍亂弧菌污染而引起的一種急性腹瀉性傳染病，主要臨床表現(xiàn)為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水、死亡率高[ 1]，其中，O1和O139兩種霍亂弧菌的血清型能夠引起疾病暴發(fā)，其主要傳播途徑是通過水源或飲食經(jīng)口傳染。隨著熒光定量PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，許多由食源性病菌或者病毒引發(fā)的急性中毒都可以在很短的時間內(nèi)檢測出來，具有靈敏、準確、快速、污染少等優(yōu)點。因此，運用熒光定量PCR等技術(shù)建立針對霍亂病菌污染防治的突發(fā)群體性公共衛(wèi)生事件應(yīng)急體系，以及開展霍亂的流行病學和病原學研究具有重要的科學意義。

1 材料與方法

1.1檢測樣本

由泉州市某沿海區(qū)疾控中心提供的咸水及淡水魚類、蝦類及貝殼類等水產(chǎn)品樣本60份。

1.2主要儀器與試劑

主要儀器為ABI 7500型定量PCR儀，O1 群和O139群霍亂弧菌診斷血清試劑，慶大瓊脂、TCBS等培養(yǎng)基，QIAamp DNA Blood Mini Kit DNA 提取試劑盒。

1.3試驗方法

1.3.1增菌 在堿性蛋白胨水中，37℃增菌6～8 h。

1.3.2核酸提取 取增菌后的待測樣品1.0～1.5 mL至無菌離心管，8000 r/min離心4 min，除去上清液，加入DNA提取液50 μL ，振蕩混勻后沸水浴5 min，13 000 r/min離心5 min；上清液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3檢測

(1)將PCR反應(yīng)液放置至實驗室室溫平衡，融化后取Taq酶，測試反應(yīng)體系配制為：PCR反應(yīng)液22.5 μL+Taq酶0.4 μL 。

(2)加入模板：將事先保存在-20℃的樣品核酸提取物解凍，以13 000 r/min離心5 min。在每個PCR反應(yīng)體系中分別加入模板、陰性對照、陽性對照各2 μL，記錄相應(yīng)樣品號。

(3)上機擴增、檢測區(qū)：反應(yīng)條件為95℃、3 min，1個循環(huán)；95℃、5 s，60℃、40 s(信號采集)，40個循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為25 μL。對于多通道熒光PCR儀，信號采集時設(shè)定為Fam熒光素。

1.4霍亂弧菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

霍亂弧菌的分離培養(yǎng)及生化鑒定參照《霍亂診斷標準》(WS289-2008)和《霍亂防治手冊》(第五版)。挑取較大、透明、扁平、濕潤且邊緣整齊的菌落, 分別與多價血清、O139診斷血清等診斷血清進行凝集試驗，同時以生理鹽水作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1分子檢測結(jié)果

2.1.1特異性檢測 對霍亂弧菌以及其他7個食源性病菌分別用實時熒光定量PCR方法進行檢測。結(jié)果顯示，霍亂弧菌檢測結(jié)果呈陽性，其他細菌檢測結(jié)果均呈陰性。說明該方法不會與其他食源性病菌的檢測發(fā)生交叉反應(yīng)，對霍亂弧菌的檢測有良好的特異性。

2.1.2檢測結(jié)果 霍亂弧菌目前已被分為200個以上的血清群,只有O1和O139群能引起霍亂流行。本試驗分為2個步驟，一是以O(shè)1和O139群霍亂弧菌特異性試劑盒檢測待測樣品中是否存在O1和O139群霍亂弧菌；二是以第1個步驟的檢測結(jié)果為基礎(chǔ)，進一步建立以毒力基因為靶基因的熒光PCR檢測方法，檢測是否含有毒力基因。結(jié)果顯示，60個樣本中只有2個樣本O1群霍亂弧菌與陽性對照樣本出現(xiàn)典型的擴增曲線，而其他菌株和空白對照均為無規(guī)則的平直曲線，無法讀取其Ct值，判定為陰性(圖1)。此外，檢測O1群霍亂弧菌的6個毒力基因ctx顯示陰性(圖2)。

圖1 霍亂弧菌的特異性實驗結(jié)果

圖2 霍亂弧菌ctx基因的特異性實驗結(jié)果

2.2傳統(tǒng)方法鑒定結(jié)果

在60份樣品中共檢出2株霍亂弧菌，檢出率為3.3%。將兩份陽性樣本通過分離菌株革蘭氏鏡檢為G-弧菌，在暗視野下作活菌鏡檢呈流星狀運動，加入1滴霍亂免疫血清后運動停止。其中在pH值8.6的堿性蛋白胨溶液中生長良好，6～8 h產(chǎn)生菌膜。在慶大霉素平板上呈中等大小、圓形、較扁平、半透明、光滑、表面濕潤、邊緣整齊、略帶灰色的菌落，中間顏色稍深，呈灰黑色。

氧化酶試驗呈陽性，有動力，分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖，V-P試驗、靛基質(zhì)試驗呈陽性。分離的2株菌株與霍亂弧菌O1多價診斷血清發(fā)生凝集，鹽水對照呈陰性。

3 討論

對于霍亂的日常監(jiān)測主要包括外環(huán)境的監(jiān)測以及疑似霍亂污染病人的監(jiān)測，水和海產(chǎn)品檢測是外環(huán)境的檢測重點，因其含有大量弧菌，若以傳統(tǒng)方法進行檢測往往需要花費大量時間用于霍亂弧菌和其他弧菌的鑒別。熒光定量PCR檢測方法的出現(xiàn)，為霍亂弧菌的日常監(jiān)測提供了一種全新的、更為高效便捷的檢測手段，在實際疫情應(yīng)急診斷應(yīng)用中，可縮短檢測周期，結(jié)果更為靈敏準確。

據(jù)目前的資料顯示，霍亂大流行主要是由O1和O139群霍亂弧菌引起[2-3]?；魜y弧菌的分布較為廣泛，且具有季節(jié)性，其流行性主要取新決于不同水環(huán)境中霍亂弧菌的生長情況?；魜y毒素(CT)是霍亂弧菌的毒力決定因子之一，本次外環(huán)境監(jiān)測點的生活污水中檢測出無毒力的O1群霍亂弧菌為非流行株，該菌一般不會引起爆發(fā)性流行性傳播。但有研究表明，產(chǎn)毒株和無毒株之間可以通過含編碼霍亂毒素基因的溶源性噬菌體(CTX5)進行傳遞。所以適宜的海水環(huán)境中的無毒力霍亂弧菌也可能獲得毒素基因，具有引起爆發(fā)流行的潛在危險[4]。

隨著社會的發(fā)展、人們生活水平的提高，對海產(chǎn)品的需求及貿(mào)易已不局限于沿海地區(qū)，各地衛(wèi)生和市場部門都應(yīng)引起重視，及時建立和完善日常準入制度，采取有效手段，做好霍亂弧菌的病原學檢測，及時切斷感染源及傳染途徑，防止其通過感染海產(chǎn)品傳播，進而控制疫情發(fā)生。

[1]羅朝晨，謝一俊，張靜.霍亂流行態(tài)勢及我國霍亂防控中存在的問題[J].傳染病信息，2008，1(3)：153.

[2]THOMASJK, RONALDK T.Tcpf is a soluble colonization factor and protect iveantigen secreted by Eltor and classical O1 and O139 Vibrio Cholerae serogroups[J].InfectImmun,2005,73(8):4461-4470.

[3]PANGB, YANM Y, CUIZG, et al.Genetic diversity of toxigenic And nontox igenic Vibrio Cholerae serogroups O1 and O139 revealed byarray-based comparative genomic hybridization[J].JBacteriol, 2007, 189(13):4837-4849.

[4]闞飆，祁國明，劉延清，等.霍亂弧菌中存在不含霍亂毒素基因的噬菌體CTXΦ基因組[J].中華微生物學和免疫學雜志，1999,19(3):175-179.

(責任編輯：林玲娜)

《福建農(nóng)業(yè)科技》版權(quán)聲明

凡向本刊投稿者，如無特殊聲明，稿件一經(jīng)采用，其專有出版權(quán)和網(wǎng)絡(luò)傳播權(quán)即授予本刊，并許可本刊在本刊網(wǎng)站或本刊授權(quán)的網(wǎng)站上傳播。作者稿酬和著作權(quán)使用費在刊發(fā)后一次性支付。對于上述合作條件若有異議，煩請來稿時聲明，本刊將適當處理；未作聲明者，本刊將視為同意。同時，要求投寄給本刊的稿件(論文、圖表、照片等) 沒有侵犯他人著作權(quán)或其他權(quán)利的內(nèi)容，并且文責自負。謝謝合作，并致誠摯敬意。

Real-timefluorescencequantitativePCRdetectionandanalysisofVibriocholeraeinsomemarineproductsinQuanzhouCity

ZHUNAG Yue-e

(QuanzhouMedicalTechnicalCollege,FujianProvince362000)

2017-05-28

莊月娥，女，1985年生，助教。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2017.06.005