耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離及鑒定*

趙樹(shù)民 虞方伯 葉正錢(qián) 方曉波 林海萍#

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300； 2.浙江省土壤污染生物修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

耐鎘產(chǎn)鐵載體菌株的分離及鑒定*

趙樹(shù)民1虞方伯2葉正錢(qián)2方曉波2林海萍1#

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥高效制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300； 2.浙江省土壤污染生物修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

從黑麥草(LoliumperenneL.)根際土壤中分離到1株耐鎘產(chǎn)鐵載體細(xì)菌LY02，經(jīng)形態(tài)觀察和16SrDNA序列測(cè)定以及同源性分析鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)。該菌株能夠分泌吲哚乙酸(IAA)，促進(jìn)磷的溶解，有利于提高黑麥草種子發(fā)芽率和抵抗鎘脅迫的能力，因此可以與黑麥草互利共生。該菌株對(duì)Cd2+的最大耐受質(zhì)量濃度為10mg/L，可以促進(jìn)土壤中的鎘向可溶性的生物有效態(tài)轉(zhuǎn)化，從而有利于黑麥草對(duì)鎘的富集。

產(chǎn)鐵載體細(xì)菌 黑麥草 鎘 植物修復(fù) 巨大芽孢桿菌

Abstract: A cadmium-resistant and siderophore-producing strain was isolated from rhizospheric soil ofLoliumperenneL.. Through morphological observation and 16S rDNA sequencing determination (including homology analysis),the strain was identified asBacillusmegaterium. This strain could produce indole-3-acetic acid and accelerate phosphorus dissolved. Moreover,the strain could promote the germination rate ofLoliumperenneL. seeds and resist Cd stress. Therefore,BacillusmegateriumandLoliumperenneL. could benefit each other. The maximum tolerant Cd2+mass concentration ofBacillusmegateriumwas 10 mg/L. At the same time,theBacillusmegateriumcould transform Cd into dissolved bio-available form,easy forLoliumperenneL. to accumulate.

Keywords: siderophore-producing bacteria;LoliumperenneL.; Cd; phytoremediation;Bacillusmegaterium

植物修復(fù)因成本低、污染少、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于土壤重金屬污染修復(fù)中[1]。然而用于植物修復(fù)的大部分超富集植物存在生物量小、生長(zhǎng)緩慢、對(duì)重金屬具有選擇性等缺點(diǎn)[2]。研究表明，產(chǎn)鐵載體細(xì)菌產(chǎn)生的鐵載體能與重金屬結(jié)合形成絡(luò)合物，若產(chǎn)鐵載體細(xì)菌與超富集植物共生，有利于提高植物對(duì)重金屬的富集效率。然而，目前大部分研究的產(chǎn)鐵載體細(xì)菌并不直接來(lái)自于超富集植物，存在共生困難等問(wèn)題。

多年生黑麥草(Lolium perenneL.)是禾本科中產(chǎn)量較高的一種重金屬超富集植物，具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、能耐受多種重金屬、生長(zhǎng)速度快、分蘗力強(qiáng)、生物量大等優(yōu)點(diǎn)。2014年，環(huán)境保護(hù)部發(fā)布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，無(wú)機(jī)污染物中鎘的污染最為嚴(yán)重，其點(diǎn)位超標(biāo)率為7.0%。本研究嘗試從黑麥草根際土壤中篩選耐鎘產(chǎn)鐵載體細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行分離和鑒定，以期為產(chǎn)鐵載體細(xì)菌與超富集植物共生、提高植物對(duì)重金屬的富集效率提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與培養(yǎng)基的配制

(1)LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、NaCl10.0g、蒸餾水1 000mL，調(diào)節(jié)pH為7.0。另加20.0g瓊脂變成LB固體培養(yǎng)基。

(2)MSA液體培養(yǎng)基：蔗糖20.0g、L-天冬氨酸2.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、蒸餾水1 000mL，用0.5g8-羥基喹啉除鐵，調(diào)節(jié)pH為7.0。

(3) 無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基(NBRIP)[3]:葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、MgSO4·7H2O0.3g、KCl0.3g、Ca3(PO4)25.0g、蒸餾水1 000mL，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.5。

(4)Salkowski’s顯色劑：150mL濃硫酸溶于250mL蒸餾水中，加入7.5mL0.5mol/L的FeCl3溶液(溶劑為0.1mol/L的稀鹽酸)。

(5) 鉻天青S(CAS)檢測(cè)液[4]：將0.079gCAS溶于50mL蒸餾水中，再加入10mL1mmol/L的FeCl3溶液(溶劑為0.1mol/L的稀鹽酸)，記作溶液A。將0.069g十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)溶于40mL蒸餾水中，記作溶液B。將溶液A沿?zé)诰従徏尤肴芤築中，攪拌混勻即得CAS檢測(cè)液。

1.2 耐鎘細(xì)菌的分離、純化

在浙江農(nóng)林大學(xué)平山試驗(yàn)基地選取長(zhǎng)勢(shì)較好的黑麥草植株，將其連根帶土裝入滅菌袋中帶回實(shí)驗(yàn)室分離菌種。稱(chēng)取黑麥草根際土壤10g，裝入三角瓶中并加入100mL無(wú)菌水，在150r/min條件下振蕩30min后靜置10min，吸取上層土壤懸濁液1mL，依次稀釋102、103、104、105、106倍，然后各取100μL涂布于含2mg/LCd2+的LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)3d，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落純化，-80 ℃保存。

取含有100mg/LL-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基50mL分裝于250mL三角瓶中，接種分離、純化得到的耐鎘細(xì)菌菌液，28 ℃、150r/min振蕩培養(yǎng)2d。

1.3 菌株特性研究

產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)檢測(cè)：取5mL菌液于離心管中，6 000r/min離心10min后，取1mL上清液，加2mLSalkowski’s顯色劑，充分混合，黑暗條件下顯色30min， 530nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以未接種菌株的培養(yǎng)液為參比，每組做3個(gè)重復(fù)取平均值并計(jì)算IAA濃度。

溶磷能力檢測(cè)：采用姜瑛等[5]的方法，將菌液接種于NBRIP中，28 ℃、150r/min條件下培養(yǎng)7d，6 000r/min離心10min后取上清液1mL，采用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中溶解性磷含量。以不接種菌株的NBRIP為空白對(duì)照，重復(fù)3次取平均值。

產(chǎn)鐵載體能力檢測(cè)[6]：取50μL菌液接種到MSA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150r/min條件下培養(yǎng)48h，10 000r/min離心10min，取上清液3mL與3mLCAS檢測(cè)液充分混勻，靜置1h，在630nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，用未接種菌株的培養(yǎng)液作參比，重復(fù)3次取平均值，根據(jù)文獻(xiàn)[7]的方法計(jì)算鐵載體活性(SU)，SU越大，表明菌株產(chǎn)鐵載體能力越強(qiáng)。

1.4 菌株鑒定

形態(tài)觀察：利用荷蘭飛納Pro掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

16SrDNA序列測(cè)定與同源性分析：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的正向引物8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物1513R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反應(yīng)在94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后提交GenBank進(jìn)行同源性比對(duì)，并用NJ法在Mega5軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其中Bootstrap值設(shè)為1 000。

1.5 菌株的耐鎘性測(cè)試及對(duì)土壤中鎘的活化能力

取50μL菌液接種于含Cd2+質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、150r/min的搖床中培養(yǎng)3d，觀察其能否生長(zhǎng)以獲得菌株的最大耐鎘濃度[8]。

取50μL菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150r/min培養(yǎng)24h，6 000r/min離心10min，取10mL上清液添加到5.0g鎘污染土樣中，充分混勻，重復(fù)3次，置于28 ℃下培養(yǎng)7d后，6 000r/min離心10min，用PerkinElmer7000DV電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)檢測(cè)上清液中Cd2+含量[9]。以未接種菌液的LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.6 菌株對(duì)鎘脅迫下黑麥草種子萌發(fā)的影響實(shí)驗(yàn)

菌懸液的制備：取50μL菌液接種于100mLLB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150r/min培養(yǎng)48h，6 000r/min離心10min，棄上清液，再用無(wú)菌水沖洗菌體5遍，添加適量無(wú)菌水使每毫升菌液中含108cfu的細(xì)菌。再添加Cd2+使得Cd2+質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、15mg/L。對(duì)照組以等量的無(wú)菌水代替50μL菌液。

黑麥草種子(購(gòu)于臨安種子站)用75%(體積分?jǐn)?shù))的酒精消毒3min，用無(wú)菌水沖洗5遍。選取飽滿(mǎn)的種子放置于墊了兩層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿50顆，加入上述菌懸液5mL，在溫度為25 ℃，濕度為60%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以長(zhǎng)出1cm的苗長(zhǎng)作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，培養(yǎng)7d后計(jì)算發(fā)芽率。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株特性分析

在2mg/LCd2+脅迫下的LB固體培養(yǎng)基中共分離、純化出3株生長(zhǎng)良好的耐鎘菌株，分別記作LY01、LY02和LY03。

由表1可見(jiàn)，3株菌株都能產(chǎn)生IAA，能夠促進(jìn)磷的溶解，具有產(chǎn)鐵載體能力。IAA是植物生長(zhǎng)過(guò)程中十分重要的生長(zhǎng)激素，能調(diào)控植物根、莖、葉的生長(zhǎng)和各組織的形成發(fā)育等。由微生物產(chǎn)生的IAA也能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[10]，所以有利于與超富集植物共生。磷是植物生長(zhǎng)的必需元素，然而土壤中的磷大部分都以難溶態(tài)的形式存在，植物很難直接利用，若共生細(xì)菌能夠促進(jìn)磷的溶解顯然有利于植物生長(zhǎng)。3株菌株中LY02產(chǎn)生的IAA質(zhì)量濃度最高，為26.5mg/L；其溶磷能力最強(qiáng)，溶解性磷質(zhì)量濃度為96.3mg/L；SU最大達(dá)到86.1%，屬于高產(chǎn)鐵載體細(xì)菌。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取LY02作為目標(biāo)耐鎘產(chǎn)鐵載體細(xì)菌。

表1 株菌特性分析結(jié)果

2.2 菌株的鑒定結(jié)果

菌株LY02在LB固體培養(yǎng)基上的菌落為乳白色，近圓形，邊緣規(guī)則，表面光滑，濕潤(rùn)，不透明。在11 000倍掃描電子顯微鏡下觀察到的形態(tài)為桿狀，產(chǎn)近球形芽孢(見(jiàn)圖1)。

圖1 菌株LY02在掃描電子顯微鏡下的形態(tài)(×11 000)Fig.1 Morphology of strain LY02 under the scanning electron microscope(×11 000)

從圖2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果看，菌株LY02與BacillusmegateriumNBRC 15308的相似性最高，因此可以推斷LY02為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，與形態(tài)分析結(jié)果也一致。

圖2 菌株LY02的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain LY02

2.3 菌株的耐鎘性和對(duì)土壤中鎘的活化能力

耐鎘性測(cè)試結(jié)果表明，耐鎘產(chǎn)鐵載體細(xì)菌巨大芽孢桿菌對(duì)Cd2+的最大耐受質(zhì)量濃度為10 mg/L。

在對(duì)土壤中鎘的活化能力實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組Cd2+質(zhì)量濃度達(dá)到6.5 mg/kg，而對(duì)照組Cd2+質(zhì)量濃度僅為4.2 mg/kg。也就是說(shuō)，耐鎘產(chǎn)鐵載體細(xì)菌巨大芽孢桿菌能促進(jìn)土壤中的鎘向可溶性的生物有效態(tài)轉(zhuǎn)化，從而有利于超富集植物對(duì)鎘的富集，提高富集效率。

2.4 菌株對(duì)黑麥草種子發(fā)芽率的影響

種子發(fā)芽是植物生長(zhǎng)的起點(diǎn)和關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)種子對(duì)外界環(huán)境十分敏感。其中發(fā)芽率是非常直觀的指標(biāo)。黑麥草種子在不同Cd2+濃度脅迫環(huán)境中的發(fā)芽率如圖3所示。從圖3可以看出，無(wú)論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，隨著Cd2+濃度的升高黑麥草種子發(fā)芽率均下降。在相同Cd2+濃度脅迫下，實(shí)驗(yàn)組由于與巨大芽孢桿菌共生，黑麥草發(fā)芽率高于對(duì)照組，低濃度時(shí)這種差異不顯著，但高濃度時(shí)差異顯著(P<0.01)。因此，耐鎘產(chǎn)鐵載體細(xì)菌巨大芽孢桿菌與黑麥草種子共生有利于提高其發(fā)芽率和抵抗鎘脅迫的能力。

注：相同字母表示在P<0.01水平上差異不顯著，不同字母表示在P<0.01水平上差異顯著。

圖3巨大芽孢桿菌對(duì)鎘脅迫下黑麥草種子發(fā)芽率的影響
Fig.3 Effects ofBacillusmegateriumon germination rate ofLoliumperenneL. seeds under Cd stress

3 結(jié) 論

從黑麥草根際土壤中分離得到耐鎘產(chǎn)鐵載體細(xì)菌LY02，經(jīng)鑒定為巨大芽孢桿菌。該菌株能夠分泌IAA，促進(jìn)磷的溶解，有利于提高黑麥草種子發(fā)芽率和抵抗鎘脅迫的能力，因此可以與黑麥草互利共生。該菌株對(duì)Cd2+的最大耐受質(zhì)量濃度為10 mg/L，可以促進(jìn)土壤中的鎘向可溶性的生物有效態(tài)轉(zhuǎn)化，從而有利于黑麥草對(duì)鎘的富集。

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Isolationandidentificationofacadmium-resistantandsiderophores-producingstrain

ZHAOShumin1,YUFangbo2,YEZhengqian2,FANGXiaobo2,LINHaiping1.

(1.NationalJointEngineeringLaboratoryofBiopesticidePreparation,ZhejiangAgriculturalandForestryUniversity,HangzhouZhejiang311300；2.KeyLaboratoryofSoilContaminationBioremediationofZhejiangProvince,HangzhouZhejiang311300)

趙樹(shù)民，男，1992年生，碩士研究生，主要從事土壤生態(tài)修復(fù)研究。#

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*浙江省重點(diǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(No.2013TD12);浙江省科技廳公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(No.2015C32078)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.09.014

2016-11-10)