響應(yīng)面優(yōu)化微波固相合成花生肽亞鐵金屬配位螯合工藝

李玉珍,肖懷秋，，姜明姣，謝佳琦，周 全，趙謀明

(1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲 412000；2.華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣州 510640；3.湖南中威制藥有限公司，湖南 株洲 412000)

油料蛋白

響應(yīng)面優(yōu)化微波固相合成花生肽亞鐵金屬配位螯合工藝

李玉珍1,肖懷秋1，2，姜明姣3，謝佳琦1，周 全1，趙謀明2

(1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲 412000；2.華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣州 510640；3.湖南中威制藥有限公司，湖南 株洲 412000)

以花生肽(相對分子質(zhì)量<3.0 kD)為原料，以硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)為金屬螯合劑，利用微波固相合成技術(shù)在單因素試驗基礎(chǔ)上，采取中心復(fù)合響應(yīng)面法對花生肽亞鐵配位螯合工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了花生肽亞鐵配位螯合工藝的二階多項式非線性回歸方程和數(shù)值模型，分析了微波輻射時間、花生肽亞鐵配體比和引發(fā)劑用量對花生肽亞鐵配位螯合的影響。結(jié)果表明，最佳花生肽亞鐵配位螯合工藝為：微波輻射時間153 s，花生肽亞鐵配體比5∶1，引發(fā)劑(H2O)用量3%，微波輻射功率608 W，反應(yīng)物粒徑120目，2.5%白炭黑(占花生肽質(zhì)量)為脫酸劑，0.3%異抗壞血酸鈉(占硫酸亞鐵質(zhì)量)為亞鐵保護(hù)劑。在最佳條件下螯合率為(90.68±1.31)%，與模型預(yù)測值92.71%基本吻合。研究表明，以微波固相合成技術(shù)進(jìn)行花生肽亞鐵固相催化制備肽金屬配位螯合營養(yǎng)強(qiáng)化劑可行。

花生肽亞鐵配位螯合；微波固相催化；響應(yīng)面優(yōu)化

Abstract：To promote the coordination chelation of peanut peptide and ferrous,peanut peptide (relative molecular weight less than 3.0 kD) and ferrous sulfate (FeSO4·7H2O) were used as reactant and mental chelator,respectively.A central composite design response surface methodology (CCD-RSM) was utilized to optimize peanut peptide-ferrous coordination chelation process using microwave solid-phase synthesis technology based on single factor experiment.The influences of microwave radiation time,peanut peptide-ferrous ratio and initiator dosage on peanut peptide-ferrous coordination chelation were investigated,and a second-order polynomial nonlinear regression equation and mathematical model were established.The results showed that the optimal peanut peptide-ferrous coordination chelation process conditions were obtained as follows: microwave radiation time 153 s,peanut peptide-ferrous ratio 5∶1,initiator dosage 3%,microwave radiation power 608 W,reactant particle size 120 meshes,using 2.5% of carbon-white as deacidification agent (based on the mass of peanut peptide) and 0.3% of sodium isoascorbate as ferrous protective agent (based on the mass of ferrous sulfate).Under these conditions,the chelating rate was (90.68±1.31)%,and was consistent with the predictive value (92.71%).The research indicated that microwave solid-phase synthesis technology was an efficient and promising means for the solid-phase catalytic preparation of metal nutrition supplement from peanut peptide and ferrous.

Keywords：peanut peptide-ferrous coordination chelation; microwave solid-phase catalysis; response surface methodology optimization

鐵元素是機(jī)體蛋白質(zhì)和酶生物合成、生物氧化及能量代謝和生理免疫等重要的微量元素，嚴(yán)重缺鐵會導(dǎo)致缺鐵性貧血(IDA)、細(xì)胞色素和含鐵酶活性降低、供氧不足、電子傳遞和能量代謝過程紊亂、機(jī)體免疫功能下降和生長發(fā)育遲緩等生理疾病[1-3]。目前，臨床上常以無機(jī)鐵鹽(如硫酸亞鐵)作為缺鐵性貧血的藥物，但存在穩(wěn)定性差、胃腸刺激大、易受到腸內(nèi)容物干擾、生物利用率低和存在一定毒副作用等不足[3]。在多肽一級結(jié)構(gòu)中存在多個易與金屬配位螯合的位點，如羧基氧原子、咪唑基氮原子以及巰基硫原子等，多肽結(jié)構(gòu)中的N-端氨基、C-端羧基，分子結(jié)構(gòu)中的羰基和亞氨基、以及氨基酸側(cè)鏈的某些基團(tuán)均可提供金屬配位點，配位螯合后能有效影響多肽二級結(jié)構(gòu)并調(diào)控其生物學(xué)活性[4]。金屬螯合肽可利用小肽配位體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)運，具有轉(zhuǎn)運耗能低、轉(zhuǎn)運速度快和不易被飽和等優(yōu)點，有利于促進(jìn)金屬元素吸收利用，金屬螯合肽能抑制小腸刷狀緣細(xì)胞中肽酶活性，有助于完整多肽作為金屬元素配體通過小肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進(jìn)入腸黏膜細(xì)胞，提高金屬螯合肽的穩(wěn)定性，并能減少金屬元素間的拮抗作用[4]。當(dāng)前，亞鐵蛋白多肽載體研究主要集中在豬血多肽、烏雞肽、酪蛋白磷酸肽、米蛋白肽、魚類蛋白肽等方面，以冷榨花生餅蛋白肽與亞鐵螯合鮮有報道。

本試驗以酶解冷榨花生餅蛋白制備得到的花生肽(相對分子質(zhì)量<3.0 kD)為原料，以硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)為金屬螯合劑，利用微波固相合成技術(shù)，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采取中心復(fù)合響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)對花生肽亞鐵配位螯合工藝進(jìn)行優(yōu)化分析，以期為花生肽亞鐵金屬營養(yǎng)強(qiáng)化劑的制備提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生肽(相對分子質(zhì)量<3.0 kD，自制[5])，其他試劑均為分析純。

LABCONCO冷凍干燥儀(美國Labconco公司)，HERMLE Z323K冷凍離心機(jī)(德國Hermle公司)，海爾MZC-2070M1家用機(jī)械式微波爐，DK-98-11A型電熱恒溫水浴箱，可見分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生肽亞鐵配位螯合工藝

準(zhǔn)確稱取適當(dāng)粒徑的花生肽粉末，依據(jù)花生肽亞鐵配體比加入硫酸亞鐵，加入0.3%亞鐵保護(hù)劑(占硫酸亞鐵質(zhì)量，下同)、一定量的白炭黑(占花生肽質(zhì)量，下同)及適量引發(fā)劑(H2O)，在一定微波功率下輻射一定時間，反應(yīng)完成后進(jìn)行粉碎，用去離子水溶解并過濾，取上清液，無水乙醇醇沉并離心收集濾渣，干燥備用。

1.2.2 微波輻射功率的確定

將1 000 mL初溫為20.℃的蒸餾水裝入燒杯中，微波輻射120 s，并記錄水溫溫差(ΔT)。微波輻射功率P=1 000 g×4.2 J/(g·.℃)×ΔT/120 s。

1.2.3 水解度的測定

采取pH-stat法[6]測定水解度。

1.2.4 花生肽亞鐵配位螯合率計算

鐵含量采取鄰菲羅琳510 nm比色法[7-8]測定。亞鐵螯合率=M1/M0×100%，式中：M1為螯合物中鐵質(zhì)量，mg；M0為加入反應(yīng)體系的鐵質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞鐵源與亞鐵保護(hù)劑的選擇

微波固相反應(yīng)體系中，不同酸根亞鐵鹽氧化速度不同，醋酸亞鐵幾秒鐘內(nèi)就完全被氧化成醋酸鐵，氧化速度最快，氯化亞鐵氧化速度次之，硫酸亞鐵相對穩(wěn)定。雖然醋酸亞鐵微波固相催化副產(chǎn)物為揮發(fā)性弱酸，對微波固相催化有利，但價格相對昂貴；氯化亞鐵作為金屬配位鐵源時，反應(yīng)副產(chǎn)物是揮發(fā)性強(qiáng)酸，微波輻射條件下易引起物料焦黏。本研究選取硫酸亞鐵作為花生肽亞鐵配位螯合劑。考慮到微波固相配位螯合過程中Fe2+易氧化成Fe3+，在微波輻射功率608 W、反應(yīng)物粒徑80目、微波輻射時間120 s、花生肽亞鐵配體比2∶1和4%引發(fā)劑的條件下，于反應(yīng)體系中添加0.3%異抗壞血酸鈉(SIA)、煙酰胺(NA)、茶多酚(TPP)、L-抗壞血酸棕櫚酸酯(LAP)等單一或復(fù)配亞鐵保護(hù)劑，研究其對亞鐵氧化保護(hù)的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 亞鐵保護(hù)劑對螯合率的影響

由圖1可以看出，微波固相配位螯合過程中，添加的單一亞鐵保護(hù)劑，以異抗壞血酸鈉(SIA)效果最好；在亞鐵保護(hù)復(fù)配方劑中，以SIA+NA、SIA+LAP和TPP+LAP對亞鐵氧化保護(hù)較好，特別是SIA+LAP保護(hù)效果最好，但相比單一保護(hù)劑SIA來說，差異不顯著。在后續(xù)試驗中選擇異抗壞血酸鈉作為亞鐵保護(hù)劑。

2.2 脫酸劑對配位螯合的影響

以鹽酸鹽或硫酸鹽作為金屬配位供體，在微波輻射過程中產(chǎn)生的酸根離子電荷、電子云密度及空間位阻效應(yīng)會影響多肽金屬配位螯合[9]，常以堿中和去除，但由于化學(xué)脫酸劑均呈堿性，易加速Fe2+氧化。本試驗選用白炭黑作為脫酸劑進(jìn)行物理脫酸。白炭黑吸附能力強(qiáng)，不溶于水，不影響產(chǎn)物分離精制，不與花生肽和亞鐵發(fā)生反應(yīng)，對金屬配位螯合物穩(wěn)定性沒有影響，且為低微波損耗物質(zhì)，不易形成微波“過熱點”[10]。在微波輻射功率608 W、反應(yīng)物粒徑80目、微波輻射時間120 s、花生肽亞鐵配體比2∶1、4%引發(fā)劑和0.3%異抗壞血酸鈉的條件下，研究白炭黑用量對花生肽亞鐵配位螯合的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 白炭黑用量對螯合率的影響

由圖2可以看出，在微波固相催化體系中加入0.5%～2.5%白炭黑作為脫酸劑能提高花生肽亞鐵配位螯合率，主要由于白炭黑能很好地分散硫酸并起到“吸附、擴(kuò)散、稀釋”硫酸作用，避免“焦化”現(xiàn)象產(chǎn)生。因此，添加2.5%白炭黑脫酸效果最好。

2.3 微波輻射功率的測定

理論上，通過測定波導(dǎo)電壓、諧振腔電壓及電流值，能相對準(zhǔn)確反映出微波輻射功率[11]。但由于家用微波爐為多模微波腔體，微波場分布有較大不確定性，輻射功率無法準(zhǔn)確測定。試驗通過對已知質(zhì)量的冷水進(jìn)行微波輻射，測量水溫變化間接計算微波輻射功率，結(jié)果得到微波爐加熱檔次由低至高的輻射功率為86 W(低火)、248 W(中低火)、426 W(中火)、527 W(中高火)、608 W(高火)，其中高火檔功率損失相對較少，微波場平均密度也最大[12]。

2.4 花生肽亞鐵微波固相催化配位螯合工藝單因素試驗

2.4.1 微波輻射功率對配位螯合的影響

在花生肽亞鐵配體比2∶1、反應(yīng)物粒徑80目、4%引發(fā)劑、0.3%異抗壞血酸鈉、2.5%白炭黑條件下，分別用86、248、426、527、608 W微波輻射120 s，考察微波輻射功率對花生肽亞鐵配位螯合的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 微波輻射功率對螯合率的影響

由圖3可以看出，隨著微波輻射功率的增加，花生肽亞鐵螯合率呈遞增趨勢，在微波輻射功率為608 W(高火檔)時配位螯合效果最好。因此，微波輻射功率選擇高火檔(608 W)進(jìn)行微波固相催化。

2.4.2 微波輻射時間對配位螯合的影響

在花生肽亞鐵配體比2∶1、反應(yīng)物粒徑80目、4%引發(fā)劑、0.3%異抗壞血酸鈉和2.5%白炭黑條件下，608 W微波輻射30～270 s，考察微波輻射時間對花生肽亞鐵配位螯合的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 微波輻射時間對螯合率的影響

由圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著微波輻射時間的延長，花生肽亞鐵配位螯合率呈遞增態(tài)勢，微波輻射時間為150 s時螯合率達(dá)到最大。繼續(xù)延長微波輻射時間，螯合率反而下降。這是由于微波輻射時間過長，樣品中積聚的能量無法及時釋放，造成反應(yīng)物內(nèi)部溫度過高，形成微波“過熱點”，導(dǎo)致已配位螯合的花生肽亞鐵螯合物發(fā)生解離[10]。因此，選擇微波輻射時間為150 s。

2.4.3 花生肽亞鐵配體比對配位螯合的影響

配體比過小，不能形成穩(wěn)定的環(huán)狀螯合物結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，而配體比過大，則易造成浪費。精確控制配體比可很好實現(xiàn)多肽金屬配位螯合。在反應(yīng)物粒徑80目、4%引發(fā)劑、0.3%異抗壞血酸鈉、2.5%白炭黑、608 W微波輻射150 s條件下，考察配體比對花生肽亞鐵配位螯合的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 花生肽亞鐵配體比對螯合率的影響

由圖5可以看出，花生肽亞鐵配體比為3∶1時，花生肽亞鐵配位螯合率最高，繼續(xù)增加配體比，螯合率不再增加?？赡苁怯捎陔S著配體比的增加，花生肽中金屬螯合位點逐步趨于飽和，螯合率不再繼續(xù)增加。因此，選擇花生肽亞鐵配體比為3∶1。

2.4.4 反應(yīng)物粒徑對配位螯合的影響

微波固相反應(yīng)中，固相反應(yīng)物的接觸程度、反應(yīng)物表面晶核形成速度和反應(yīng)產(chǎn)物表面晶核更新速度是決定反應(yīng)的3個主要因素[9]。在花生肽亞鐵配體比3∶1、4%引發(fā)劑、0.3%異抗壞血酸鈉、2.5%白炭黑、608 W微波輻射150 s條件下，考察反應(yīng)物粒徑對花生肽亞鐵配位螯合的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 反應(yīng)物粒徑對螯合率的影響

由圖6可以看出，反應(yīng)物粒徑減少有利于微波固相合成，當(dāng)反應(yīng)物粒徑為120目時，花生肽亞鐵配位螯合率達(dá)到較高，粒徑繼續(xù)減少至140目時，螯合率增幅不明顯。因此，反應(yīng)物粒徑選擇120目。

2.4.5 引發(fā)劑用量對配位螯合的影響

一般物質(zhì)對微波吸收的能力主要取決于介電常數(shù)(ε)和介質(zhì)損耗角正切(tanδ)兩個重要參數(shù)。引發(fā)劑用量只影響反應(yīng)初速度，不影響反應(yīng)平衡點。水、乙醇、乙酸、甲醇等極性溶劑均可作為引發(fā)劑，最常用引發(fā)劑是水[13]。微波固相合成反應(yīng)中加入微量引發(fā)劑不僅能加快反應(yīng)速度，還能減輕產(chǎn)物焦糊和分解等現(xiàn)象，并提高螯合率[13-14]。在花生肽亞鐵配體比3∶1、反應(yīng)物粒徑120目、0.3%異抗壞血酸鈉和2.5%白炭黑、608 W微波輻射150 s條件下，以水作為引發(fā)劑，考察引發(fā)劑用量對花生肽亞鐵配位螯合的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 引發(fā)劑用量對螯合率的影響

由圖7可以看出，隨著引發(fā)劑用量增加，花生肽亞鐵螯合率呈先增加后降低趨勢，當(dāng)引發(fā)劑用量為5%時，花生肽亞鐵配位螯合率達(dá)到最大。因此，選擇引發(fā)劑用量為5%。

2.5 花生肽亞鐵微波固相催化配位螯合工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.5.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

固定異抗壞血酸鈉用量0.3%、白炭黑用量 2.5%、微波輻射功率608 W、反應(yīng)物粒徑120目，采用中心復(fù)合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計分析微波輻射時間(X1)、花生肽亞鐵配體比(X2)和引發(fā)劑用量(X3)對花生肽亞鐵配位螯合率(Y)的影響。因素水平見表1，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.5.2 模型序貫分析與數(shù)值模型構(gòu)建

對響應(yīng)面模型進(jìn)行序貫分析(SA)，結(jié)果如表3所示。

表3 中心復(fù)合響應(yīng)面模型構(gòu)建序貫分析

由表3可以看出，一階線性模型不顯著(P=0.659 9>0.05)，失擬項極顯著(P=0.002 5<0.01)。失擬項顯著表示應(yīng)用該模型進(jìn)行數(shù)值預(yù)測出現(xiàn)誤差的可能性較高，需要更高階模型進(jìn)行數(shù)值的模擬；二因素交互關(guān)系模型不顯著，失擬項極顯著(P=0.002 2<0.01)，也不適宜用于數(shù)值預(yù)測；二階模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P=0.140 9>0.05)，表明該二階模型可很好地進(jìn)行數(shù)值預(yù)測；三階模型不顯著(P=0.789 5>0.05)，失擬項顯著(P=0.047 1<0.05)，不宜用于數(shù)值分析。因此，選擇二階模型進(jìn)行數(shù)值擬合分析是最合適的。

2.5.3 方差分析

對所構(gòu)建的二階模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 二階回歸模型方差分析

從表4可以看出，模型影響極顯著(P<0.01)，模型確定系數(shù)為0.984 2，說明能解釋總變異的98.42%，僅有1.58%變異無法用該模型進(jìn)行解釋。變異系數(shù)(CV)是衡量模型精密度和穩(wěn)健性的重要評價指標(biāo)，越小越好。模型CV為3.14%，說明模型出現(xiàn)變異的可能性較少；模型信噪比(SNR)為33.414，SNR>4表明構(gòu)建模型是可靠的[15]；失擬項不顯著(P=0.140 9>0.05)，表明應(yīng)用該模型進(jìn)行數(shù)值估測不會失真。模型一次項和二次項影響均極顯著(P<0.01)，交互作用項X1X2、X2X3影響極顯著(P<0.01)，而X1X3影響不顯著(P>0.05)。

2.5.4 模型最優(yōu)解與驗證試驗

對回歸模型解逆矩陣可求出方程最優(yōu)解：X1=0.14，X2=1.0和X3=-1，對應(yīng)的實際水平為微波輻射時間153 s，花生肽亞鐵配體比5∶1，引發(fā)劑(H2O)用量3%，其他條件為微波輻射功率608 W，反應(yīng)物粒徑120目，2.5%白炭黑為脫酸劑，0.3%異抗壞血酸鈉(SIA)為亞鐵保護(hù)劑。在優(yōu)化條件下進(jìn)行重復(fù)試驗，螯合率為(90.68±1.31)%(n=3)，與模型預(yù)測值92.71%基本吻合，偏差為-2.19%。

固相反應(yīng)屬非均相反應(yīng)，固相條件下其原子或離子擴(kuò)散比氣相、液相要慢得多，需在高溫條件下才能進(jìn)行，微波加熱能加快反應(yīng)的進(jìn)程。石藹如等[16]發(fā)現(xiàn)，在微波效應(yīng)存在條件下，處于微波場中物質(zhì)內(nèi)部的電磁場分布對離子擴(kuò)散和固相反應(yīng)過程有影響，認(rèn)為微波加熱能產(chǎn)生離子擴(kuò)散增強(qiáng)效應(yīng)，使反應(yīng)物離子通過漲落獲得大于勢壘的能量穿過產(chǎn)物層，并進(jìn)行濃度差擴(kuò)散，在擴(kuò)散過程中與生成物層的空位形成相關(guān)對，在交變微波電磁作用下，相關(guān)對不斷改變?nèi)∠颍M(jìn)一步產(chǎn)生濃度梯度，從而推動離子的擴(kuò)散。當(dāng)微波場處于合適位置時，反應(yīng)體系熵最低，增強(qiáng)了分子碰撞概率，反應(yīng)物中部分分子吸收微波輻射提供的能量被激活，提高了反應(yīng)效率[17]。

3 結(jié) 論

本試驗以花生肽(相對分子質(zhì)量<3.0 kD)為原料，以硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)為金屬螯合劑，在微波固相催化作用下進(jìn)行了花生肽亞鐵的配位螯合，在單因素試驗基礎(chǔ)之上，利用中心復(fù)合響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計對花生肽亞鐵金屬配位螯合過程進(jìn)行了優(yōu)化分析，并獲得了優(yōu)化的配位螯合工藝參數(shù)，即微波輻射時間153 s，花生肽亞鐵配體比5∶1，引發(fā)劑(H2O)用量3%，微波輻射功率608 W，反應(yīng)物粒徑120目，2.5%白炭黑作為脫酸劑(占花生肽質(zhì)量)，0.3%異抗壞血酸鈉作為亞鐵保護(hù)劑(占硫酸亞鐵質(zhì)量)。在最優(yōu)條件下螯合率為(90.68±1.31)%，與模型預(yù)測值92.71%接近。研究表明，微波固相合成技術(shù)能有效地促進(jìn)花生肽亞鐵的配位螯合。

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Optimizationofmicrowavesolid-phasesynthesisofpeanutpeptide-ferrousmetalcoordinationchelatingtechnologybyresponsesurfacemethodology

LI Yuzhen1,XIAO Huaiqiu1，2,JIANG Mingjiao3,XIE Jiaqi1,ZHOU Quan1,ZHAO Mouming2

(1.School of Pharmaceutical and Bioengineering,Hunan Vocational Technical College of Chemical and Industrial Technology,Zhuzhou 412000,Hunan,China; 2.College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640，China; 3.Hunan Zonwe Pharmaceutical Co.,Ltd.,Zhuzhou 412000,Hunan,China)

TQ936.2;TQ464.7

A

1003-7969(2017)09-0038-06

2016-12-30；

2017-05-23

湖南省教育廳科研項目(16C0550);湖南省高校科研項目(12C1049);湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項目(HNHY2015002)

李玉珍(1981)，女，講師，碩士，主要從事蛋白質(zhì)生物化學(xué)方面的教學(xué)與研究工作(E-mail)yuzhenli@163.com。

肖懷秋，副教授(E-mail)xiaohuaiqiu@163.com。