循環(huán)微粒對口腔癌進展的作用機制研究

祝華珺，湯晶，葛自力

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 口腔科，江蘇 蘇州 215006）

循環(huán)微粒對口腔癌進展的作用機制研究

祝華珺，湯晶，葛自力

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院 口腔科，江蘇 蘇州 215006）

目的比較正常人和口腔鱗狀細(xì)胞癌患者循環(huán)微粒的含量，并探究循環(huán)微粒在口腔癌進展中的作用。方法差速離心法收集正常人和口腔癌循環(huán)微粒。流式細(xì)胞術(shù)檢測循環(huán)微粒的濃度；MTT法和EdU實驗檢測細(xì)胞增殖活性，劃痕實驗和Transwell實驗分別檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力；裸鼠移植瘤模型檢測循環(huán)微粒對腫瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤的影響。結(jié)果口腔癌患者循環(huán)微粒的含量比正常人的高，且循環(huán)微粒的濃度與口腔癌患者血液高凝狀態(tài)密切相關(guān)?？谇话┗颊邅碓吹难h(huán)微粒促進口腔癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和體內(nèi)成瘤。結(jié)論口腔癌患者來源的循環(huán)微粒促進口腔癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和體內(nèi)成瘤，在口腔癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

循環(huán)微囊泡；口腔癌；增殖；遷移；侵襲

Abstract:ObjectiveTo evaluate the role of circulating microparticles(CMPs)in the development of oral squamous cell carcinoma(OSCC).MethodsCMPs were isolated by gradient centrifuge from healthy volunteers and OSCC patients.Cell proliferation was determined by MTT assay and EdU test.Migration and invasion activity were evaluated by wound healing assay and Transwell,respectively.Nude mouse models were utilized to evaluate tumorigenesis capacity of OSCC xenograft with or without CMPs.ResultsThe concentration of CMPs was significantly higher in OSCC patients compared with healthy volunteers,and the increase of CMPs was closely associated with hyper-coagulation status.The ability of proliferation,migration,invasion and tumorigenesis of CAL27 cells were significantly enhanced by OSCC-derived CMPs.ConclusionsOSCC-derived CMPs can increase proliferation,migration,invasion and tumorigenesis of CAL27 cells.

Keywords:circulating mircroparticles;oral squamous cell carcinoma;proliferation;migration;invasion

細(xì)胞源性微粒是細(xì)胞在激活、損傷或凋亡時經(jīng)出芽方式釋放的直徑介于100～1000 nm的膜性囊泡[1]，其攜帶母體細(xì)胞特征性生物信息分子，可作為細(xì)胞間運輸載體將該生物分子傳遞給其他細(xì)胞[2-3]。微粒大量存在于機體的血液、尿液及唾液等體液之中，這些微粒統(tǒng)稱為體液源性微粒[4]。血液中含有的微粒被稱為循環(huán)微粒（circulating microparticles，CMPs）[5-6]。循環(huán)微粒在許多生理病理學(xué)過程中充當(dāng)生物信息傳遞載體的作用[7-9]。本研究的目的在于探究循環(huán)微粒在口腔癌進展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

1.1.1 標(biāo)本的制備選取2016年1月1日-2016年12月31日就診于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者20例。所有患者均在口腔外科門診經(jīng)局部組織切取活檢術(shù)確診為口腔鱗狀細(xì)胞癌。本研究符合倫理要求，患者及家屬均知情同意。用含抗凝劑的真空采血管收集口腔癌患者5 ml靜脈血樣品；并轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃條件下，2 500 r/min離心20 min，離心2次，取上清液，加入上清體積3倍的無菌PBS稀釋血清；4℃條件下32 000 r/min離心60 min，以150 μl無菌PBS重懸沉淀，即獲得口腔癌患者循環(huán)微粒。

1.1.2 材料和設(shè)備DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、 磷 酸 鹽 緩 沖 液（phosphate buffered solution，PBS）、雙抗（青霉素+鏈霉素）及胰蛋白酶（購自美國Hyclone公司），基質(zhì)膠（購自美國BD公司），MTT、DAPI封片劑（購自武漢谷歌生物科技有限公司），Ki-67、CD31、CD41、CD144 及 CD45一抗（購自美國Sigma公司），細(xì)胞培養(yǎng)耗材（購自無錫耐思生物科技有限公司），Tanswell小室（購自美國Corning公司），胸腺嘧啶核苷酸類似物-EdU（5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷）細(xì)胞增殖檢測試劑盒（E-dU試劑盒）（購自廣州銳博生物科技有限公司）。

1.2 微粒粒徑檢測

1.2.1 動態(tài)光散射實驗將收集的微粒用PBS垂懸至合適的濃度，用Nano-ZS ZEN 3600型動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）儀分析微粒水合粒徑。

1.2.2 微粒形態(tài)表征取10 μl微粒PBS垂懸液滴于碳支持膜銅網(wǎng)上，室溫孵育5 min，濾紙吸干銅網(wǎng)；將銅網(wǎng)置于1%磷鎢酸復(fù)染液中染色，3 min后濾紙吸干液體，自然晾干銅網(wǎng)；將銅網(wǎng)置于Hitachi HT7700型透射電鏡上觀察、拍照，測量微粒粒徑大小。

1.3 細(xì)胞增殖活性檢測

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)口腔癌細(xì)胞系CAL27細(xì)胞（由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供）培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，隔天換液，每3天傳代1次；細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃、95%濕度、5%二氧化碳CO2濃度。

1.3.2 MTT實驗收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度加入96孔板：每孔加入100μl，使細(xì)胞調(diào)密度1 000～10 000個/孔。細(xì)胞分為對照組和實驗組，實驗組細(xì)胞加入終濃度為40 μg/ml的循環(huán)微粒。5%CO2，37℃孵育 0～72 h，每孔加入 10 μl MTT 溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。

1.3.3 EdU實驗細(xì)胞分為對照組和實驗組，實驗組細(xì)胞加入終濃度為40 μg/ml的循環(huán)微粒。用細(xì)胞培養(yǎng)基按1 000∶1的比例稀釋EdU溶液（試劑A），制備適量50μmol/L EdU培養(yǎng)基；每孔加入100 μl 50 μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育2 h，棄培養(yǎng)基。PBS清洗細(xì)胞1、2次，每次5 min。每孔加入50 μl細(xì)胞固定液（即含4%多聚甲醛的PBS）室溫孵育30 min，棄固定液；每孔加入50 μl 2 mg/ml甘氨酸，脫色搖床孵育5min后，棄甘氨酸溶液；每孔加入100 μl PBS，脫色搖床清洗5 min，棄PBS。每孔加入100 μl的Apollo染色反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后，棄染色反應(yīng)液；每孔每次加入100 μl甲醇清洗1、2次，每次 5 min；PBS清洗1次，每次5 min。含有DAPI封片劑封片。

1.4 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測

1.4.1 細(xì)胞劃痕試驗驗將對數(shù)生長期的CAL27細(xì)胞接以5×105個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，以20μl黃色無菌吸頭沿培養(yǎng)孔的正中劃一道劃痕，PBS輕輕沖洗并吸收游離細(xì)胞。實驗組細(xì)胞加入終濃度為40 μg/ml的循環(huán)微粒。

1.4.2 Transwell實驗細(xì)胞分為對照組和實驗組，實驗組細(xì)胞加入終濃度為40 μg/ml的循環(huán)微粒。將鋪有基質(zhì)膠Transwell小室置于24孔板上，在外室加入500 μl含有40 μg/ml的完全培養(yǎng)基，小室內(nèi)加入300 μl無血清培養(yǎng)基垂懸的CAL27細(xì)胞（1×106個/ml）。培養(yǎng)24 h后，從培養(yǎng)箱中取出Transwell小室，PBS清洗，用棉簽擦去上層基質(zhì)膠和細(xì)胞，95%乙醇固定10 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，顯微鏡下觀察并拍照成像。

1.5 裸鼠移植瘤實驗

將對數(shù)生長期的CAL27細(xì)胞以PBS重懸，使細(xì)胞密度為1×107個/ml。將200 μl含有細(xì)胞的PBS懸液注射于裸鼠腹側(cè)皮下（每組各8只），觀察并測量和記錄腫瘤大小。實驗組老鼠，每3天經(jīng)尾靜脈注射1次循環(huán)微粒（50 μg/次），連續(xù)注射次。腫瘤體積計算公式為：（長×寬×寬）/2。觀察期結(jié)束后，處死裸鼠，取下腫瘤標(biāo)本及肺組織，制成石蠟切片進行后續(xù)實驗。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

標(biāo)本取材后切成小塊組織，4%多聚甲醛固定標(biāo)本、流水沖洗后，梯度酒精脫水、石蠟包埋及組織切片（4 μm）。然后二甲苯脫蠟、梯度酒精入水、高壓抗原修復(fù)、羊血清37℃孵育切片20 min，甩去血清，滴加Ki-67一抗（1∶200），4℃孵育過夜。滴加相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗約50 μl完全覆蓋切片，37℃孵育切片20 min。PBS緩沖液漂洗后，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，37℃孵育切片20 min。PBS緩沖液漂洗后，于光學(xué)顯微鏡下顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后流水沖洗15 min后，梯度酒精脫水，切片晾干后行二甲苯透明及中性樹膠封片過夜。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

向細(xì)胞或微粒垂懸液中加入 CD31、CD41、CD144及 CD45單克隆抗體（1∶100），室溫孵育30 min；離心去除多余抗體后以PBS垂懸細(xì)胞或微粒；加入熒光標(biāo)記二抗（1∶200），37℃孵育 30 min，PBS洗滌5 min×2次；以400 μl PBS重懸細(xì)胞或微粒，流式細(xì)胞儀檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用GraphPad Prism 6.0軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較用單因素方差分析，若方差齊，則組間兩兩比較用LSD-t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 循環(huán)微粒的鑒定結(jié)果

差速離心法收集口腔癌患者循環(huán)微粒，垂懸于PBS。透射電鏡下，分離所得的沉淀呈雙層膜結(jié)構(gòu)（見圖1A），大小范圍為100～1 000 nm，其中400～500 nm的雙層膜結(jié)構(gòu)最多（見圖1B）。流式細(xì)胞分析（見圖1C）和動態(tài)光散射結(jié)果（見圖1D）表明，離心分離的沉淀粒徑分布范圍位于100～1 000 nm，符合微粒的粒徑分布，表明本研究分離所得的沉淀為循環(huán)微粒。

2.2 口腔癌患者循環(huán)微粒含量

分別收集正常人和口腔癌患者循環(huán)微粒，PBS垂懸后以流式細(xì)胞儀計數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，口腔癌患者循環(huán)微粒的濃度達(dá)到（7808.33±2905.51）個 /μl，正常人循環(huán)微粒濃度為（2090.2±714.05）個/μl（見圖2A）?？谇话┗颊吲c正常人循環(huán)微粒濃度比較，采用t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.876，P=0.004），口腔癌患者患者微粒濃度高于正常人。循環(huán)微粒主要由血小板來源的微粒，內(nèi)皮細(xì)胞來源的微粒，白細(xì)胞來源的微粒構(gòu)成。隨后進一步統(tǒng)計正常人和口腔癌患者循環(huán)微粒的成分差異。見圖2B所示，口腔癌患者和正常人循環(huán)微粒中各成分所占比例基本保持不變。

2.3 循環(huán)微粒濃度與口腔癌血液高凝狀態(tài)的關(guān)系

圖1 口腔癌患者循環(huán)微粒的分離與鑒定

圖2 口腔癌患者與正常人循環(huán)微粒比較

惡性腫瘤患者血液普遍存在高凝狀態(tài)，而靜脈血栓形成是惡性腫瘤患者的主要死因和并發(fā)癥之一。本研究檢測正常人口腔癌患者的纖維蛋白值（fibrinogen，F(xiàn)IB）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）和部分凝血酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，口腔癌患者FIB（4.00±1.19）g/L、PT（8.71±2.49）s 和 APTT（19.27±2.86）s與正常人 FIB（2.94±1.43）g/L、PT（10.57±2.50）s和APTT（25.27±4.46）s比較，采用 t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FIB：t=2.297，P=0.028；PT：t=2.239，P=0.033；APTT：t=4.475，P=0.001），口腔癌患者 FIB 高于正常人，口腔癌患者PT和APTT低于正常人（見圖3A）。將口腔癌患者循環(huán)微粒濃度和口腔癌患者FIB、PT和APTT進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，循環(huán)微粒濃度與 FIB 呈正相關(guān)（P＜0.0001），與 PT（P＜0.0001）和APTT（P＜0.0038）呈負(fù)相關(guān)（見圖 3B），證明循環(huán)微?？赡芘c口腔癌血液高凝狀態(tài)有關(guān)。

2.4 口腔癌患者微粒對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

MTT實驗證實，口腔癌循環(huán)微粒促進CAL27細(xì)胞增殖，且具有濃度依賴性（見圖4A）。EdU實驗證實口腔癌患者來源的循環(huán)微粒明顯提高口腔癌細(xì)胞的增殖活性（見圖4B，增殖細(xì)胞標(biāo)記為綠色）。

2.5 口腔癌患者微粒促進腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲

隨后分別用劃痕實驗和Transwell小室實驗檢測口腔癌患者循環(huán)微粒對口腔癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。見圖5所示，刮除細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞均向劃痕區(qū)域遷移；循環(huán)微粒濃處理組[10μg/ml，（275.21±124.12）個；20μg/ml，（352.25±164.27）個；80 μg/ml，（467.54±175.65）個]與對照組遷移至劃痕區(qū)細(xì)胞的數(shù)目（175.78±89.35）個比較，采用t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（10μg/ml，t=3.24，P=0.031；20 μg/ml，t=2.68，P=0.000；80 μg/ml，t=4.24，P=0.000），循環(huán)微粒處理組遷移至劃痕區(qū)細(xì)胞的數(shù)目多于對照組。且隨著循環(huán)微粒濃度的升高，遷移至劃痕區(qū)細(xì)胞的數(shù)目逐漸提高，證明口腔癌循環(huán)微?？商岣呖谇话┘?xì)胞遷移能力。

Transwell小室實驗結(jié)果證實，循環(huán)微粒濃處理組[10 μg/ml，（19.84±4.36）個；20 μg/ml，（25.58±5.54）個；80 μg/ml，（32.24±652）個]與對照組突破基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目（15.21±3.34）個比較，采用t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（10 μg/ml，t=3.27，P=0.032；40 μg/ml，t=3.54，P=0.000；80 μg/ml，t=2.28，P=0.000），循環(huán)微粒處理組突破基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目多于對照組（見圖6）。且隨著循環(huán)微粒濃度的升高，突破基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)目逐漸增加，表明口腔癌循環(huán)微?？商岣呖谇话┘?xì)胞侵襲能力。

圖3 口腔癌患者循環(huán)微粒濃度與口腔癌血液高凝狀態(tài)的關(guān)系

圖4 口腔癌循環(huán)微粒促進口腔癌細(xì)胞增殖

2.6 口腔癌患者微粒對腫瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響

循環(huán)微粒處理組（1 282.85±427.36）mm3與對照組裸鼠背部腫瘤體積（333.03±160.9）mm3比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.172，P=0.000），循環(huán)微粒處理組裸鼠體積大于對照組（見圖7A、B）。觀察期結(jié)束后，安樂死所有動物，收獲腫瘤標(biāo)本。循環(huán)微粒處理組與對照組裸鼠背部腫瘤質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.372，P=0.000），循環(huán)微粒處理組裸鼠質(zhì)量（0.51±0.17）g大于對照組（0.29±0.06）g（見圖 7C）。將腫瘤組織制成組織切片，免疫組織化學(xué)檢測后發(fā)現(xiàn)，循環(huán)微粒處理后的腫瘤組織內(nèi)Ki-67（增殖細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)水平高于對照組（見圖7D）。

圖5 口腔癌循環(huán)微粒促進口腔癌細(xì)胞遷移

圖6 口腔癌循環(huán)微粒促進口腔癌細(xì)胞侵襲

圖7 口腔癌循環(huán)微粒對體內(nèi)成瘤能力的影響及ki-67表達(dá)水平

3 討論

根據(jù)中國國家癌癥中心發(fā)布的《2015年中國癌癥統(tǒng)計》顯示，僅2015年中國就有429.2萬新發(fā)腫瘤病例和281.4萬癌癥死亡病例，相當(dāng)于平均每天有1.2萬人罹患腫瘤、7 500人死于癌癥[10]。該研究報告還指出，在中國，癌癥的發(fā)病率和死亡率還在不斷攀升，癌癥已經(jīng)成為疾病死因之首，是非常重要的公共健康問題。研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制對于尋找更好的治療方法具有重要的現(xiàn)實意義?？谇话┦侨祟惓Ｒ姷哪[瘤之一，居世界常見癌癥第6位[11-12]。目前，口腔癌患者5年生存率為50%～60%，口腔癌的治療仍然存在極大的挑戰(zhàn)[13-16]。許多患者就診時已處于晚期，導(dǎo)致治療效果較差，因此發(fā)展更可靠的早期診斷方法對于預(yù)防口腔癌具有重要意義[17]。

細(xì)胞源性微?？梢詮募?xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基中分離，也可以從正常人和患者體液中分離。幾乎所有的真核細(xì)胞都能產(chǎn)生微粒，而每種細(xì)胞產(chǎn)生的微粒也不盡相同，因為微粒的形成與母細(xì)胞受到的刺激密切相關(guān)[18-19]。根據(jù)微粒母細(xì)胞的類別，微?？煞譃閮?nèi)皮細(xì)胞源性微粒、血小板源性微粒、單核細(xì)胞源性微粒、紅細(xì)胞源性微粒及腫瘤細(xì)胞源性微粒等。體外培養(yǎng)的細(xì)胞可以產(chǎn)生微粒，而正常人和患有不同疾病的患者體液（包括血液、尿液、腹水和腦脊液等）中也存在大量的微粒。研究證實，多種體液中均含有較高濃度的微粒，例如正常人循環(huán)血中微粒的濃度較低，而在多種病理情況下微粒的含量還將升高，提示循環(huán)微粒在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，口腔癌患者循環(huán)微粒的含量比正常人升高，且循環(huán)微粒的濃度與口腔癌患者血液高凝狀態(tài)密切相關(guān)。更重要的是，筆者發(fā)現(xiàn)口腔癌患者來源的循環(huán)微粒促進口腔癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和體內(nèi)成瘤。該結(jié)果證明，循環(huán)微?？赡茉诳谇话┑陌l(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究有助于更好的認(rèn)識口腔癌的發(fā)病機制，以尋找更好的治療方法。此外，口腔癌患者血液中升高的循環(huán)微粒還可作為口腔癌診斷的依據(jù)。

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Role of CMPs in development of oral squamous cell carcinoma

Hua-jun Zhu,Jing Tang,Zi-li Ge
(The First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou,Jiangsu 215006,China)

R782

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.010

1005-8982（2017）21-0054-07

2017-04-27

葛自力，E-mail：gezl@163.com；Tel:13451600531