• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    髓鋅指基因1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

    2017-10-11 07:59:34杜旭召楊豪鄧素玲史棟梁孟慶良
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    杜旭召,楊豪,鄧素玲,史棟梁,孟慶良

    (河南省中醫(yī)院 骨傷科,河南 鄭州 450002)

    髓鋅指基因1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

    杜旭召,楊豪,鄧素玲,史棟梁,孟慶良

    (河南省中醫(yī)院 骨傷科,河南 鄭州 450002)

    目的研究葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和髓鋅指基因1(MZF-1)在骨肉瘤中的作用及其可能的作用機(jī)制。方法實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)MZF-1和G6PD在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá);MTT法檢測(cè)過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響;熒光素酶報(bào)告基因分析法驗(yàn)證MZF-1與G6PD啟動(dòng)子區(qū)的相互作用關(guān)系。結(jié)果在骨肉瘤細(xì)胞中,MZF-1的表達(dá)下降,G6PD表達(dá)上升。過(guò)表達(dá)MZF-1可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并且將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果表明,MZF-1可靶向結(jié)合到G6PD的啟動(dòng)子區(qū)域并負(fù)向調(diào)控G6PD的表達(dá)。結(jié)論MZF-1可通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)G6PD的表達(dá),在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌的作用,為骨肉瘤治療提供新的思路。

    髓鋅指基因1;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶;骨肉瘤;增殖;凋亡;細(xì)胞周期

    Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of myeloid zinc finger gene 1 (MZF-1)and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)on progression of osteosarcoma and the underlying mechanisms.MethodsThe expression levels ofMZF-1and G6PD were determined by real-time PCR.MTT was utilized to examine the cellular proliferation.Apoptosis rate and cell cycle were measured by flow cytometry.The molecular interaction betweenMZF-1and G6PD was manifested by dual-luciferase reporter assay.ResultsMZF-1was down-regulated and G6PD was up-regulated in osteosarcoma cells.Over-expression ofMZF-1inhibited osteosarcoma cell proliferation,increased cellular apoptosis,and induced cell cycle arrest on G0/G1phase.Dual-luciferase reporter assay showed thatMZF-1bonded to the promoter region of G6PD and negatively regulated the transcription of G6PD.ConclusionsMZF-1exerts as a tumor suppressor by negatively regulating the expression of G6PD during the progression of osteosarcoma.

    Keywords:myeloid zinc fingergene 1;glucose-6-phosphate dehydrogenase;osteosarcoma;cell proliferation;apoptosis;cell cycle

    骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤之一,起源于間葉組織,常發(fā)生于兒童及青少年[1-2],以高惡性、早轉(zhuǎn)移、預(yù)后差及生存率低等為特點(diǎn)[3-4]。骨肉瘤最主要的治療方式為外科切除結(jié)合放化療,但其預(yù)后很差,轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者長(zhǎng)期生存率<20%[5-6]。因此,研究新型的、高效低毒的抗人骨肉瘤藥成為骨肉瘤治療研究的重點(diǎn)。

    髓鋅指基因 1(myeloid zinc finger gene 1,MZF-1)屬于鋅指蛋白Kruppel轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,含有13個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu),該鋅指結(jié)構(gòu)可與相應(yīng)靶基因啟動(dòng)子區(qū)域相結(jié)合,從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[7]。研究報(bào)道,MZF-1是一個(gè)雙功能的轉(zhuǎn)錄因子,其可以通過(guò)激活或者抑制靶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞的分化、遷移和增殖。近年來(lái),MZF-1在多種腫瘤中的作用已被闡明,如MZF-1通過(guò)與p55PIK啟動(dòng)子上的“TGGGGA”元件結(jié)合,轉(zhuǎn)錄激活p55PIK,促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[8];抑制MZF-1表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[9];而也有研究報(bào)道,MZF-1通過(guò)促使鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白誘導(dǎo)的鐵外排抑制前列腺腫瘤的生長(zhǎng)[10]。然而,MZF-1在骨肉瘤中的作用及其作用機(jī)制尚未見報(bào)道。

    葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)是1個(gè)典型的管家基因,是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶,廣泛存在于生物體的組織和細(xì)胞中。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),G6PD與癌癥的發(fā)生有密切的關(guān)系,如黑色素瘤[11-12]、膀胱癌[13]、食管鱗癌等[14],廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等過(guò)程,但其在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。盧玲琳等利用生物信息學(xué)法方法研究發(fā)現(xiàn),人G6PD基因啟動(dòng)子區(qū)域存在MZF-1的結(jié)合位點(diǎn)[15],因此,本文旨在研究MZF-1是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)G6PD的表達(dá)進(jìn)而抑制骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及其具體作用機(jī)制的探討。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料及試劑

    正常人成骨細(xì)胞系hFOB1.19和骨肉瘤細(xì)胞系MF-63、Saos2、HOS(購(gòu)自美國(guó) ATCC 公司),dulbecco's modified eagle media:nutrient mixture F-12(DMEM-F12)、洛斯維公園紀(jì)念研究所1640(roswell park memorial institute 1640,RPMI 1640)培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素及鏈霉素等(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司),Trizol、放射免疫沉淀(Radio Immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液(購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司),Prime ScriptTMRT-PCR Kit及 SYBR Premix EX Taq(購(gòu)自日本TaKaRa株式會(huì)社),Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司),細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司),MZF-1、G6PD、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和 Bcl-2 相關(guān) X 蛋白(Bax)等一抗(購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

    正常人成骨細(xì)胞系hFOB1.19培養(yǎng)于DMEM-F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,1%的青霉素及鏈霉素);骨肉瘤細(xì)胞MF-63、Saos2及HOS均培養(yǎng)在10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中;所有細(xì)胞均培養(yǎng)在37℃,5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中。

    pcDNA3.1-MZF-1過(guò)表達(dá)載體(由廣州俊輝生物科技有限公司構(gòu)建合成)。具體方法為:首先在正常人成骨細(xì)胞系hFOB1.19中擴(kuò)增MZF-1基因,連接至pMD18-T載體測(cè)序鑒定,然后將測(cè)序正確的含有MZF-1目的片段的pMD-18T重組載體進(jìn)行EcoRⅠ及HindⅢ雙酶切并克隆到pcDNA3.1真核表達(dá)載體,挑選測(cè)序正確的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分組:未轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細(xì)胞HOS對(duì)照組(CK)、轉(zhuǎn)染空載組(pcDNA3.1-vector)、轉(zhuǎn)染 pcDNA 3.1-MZF-1的骨肉瘤細(xì)胞組(pcDNA3.1-MZF-1)。每孔以1×103個(gè)細(xì)胞濃度接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或5×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí),按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書將0.7 μg質(zhì)粒DNA和2 μl脂質(zhì)體各用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋于1.5 ml的離心管中,室溫靜置10 min后,將稀釋好的質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合,靜置20 min后加入到不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)板中,37℃培養(yǎng)5 h后,將培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72 h。在熒光顯微鏡下觀察檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

    1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)

    利用 Trizol提取 hFOB1.19、MF-63、Saos2、HOS及轉(zhuǎn)染HOS后各組細(xì)胞總RNA,利用Prime ScriptTM實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)Kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA,最后用SYBR Premix EX Taq進(jìn)行qRT-PCR,目的基因表達(dá)量按照2-△△ct法計(jì)算。見表1。

    1.4 蛋白質(zhì)印跡法

    收集細(xì)胞,加入RIPA裂解液,于冰上放置30 min后,15000 r/min離心10min。將30μg蛋白于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDSPAGE)凝膠中進(jìn)行電泳,然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,加入 5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉。再加入相應(yīng)的一抗于4℃孵育過(guò)夜。最后加入二抗室溫孵育1 h后,利用ECL液顯影,掃描儀中成像。

    表1 引物序列

    1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

    按照1.2中所述的96孔板中轉(zhuǎn)染后,繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72 h,分別向每孔加入 20 μl MTT 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,加入100 μl DMSO溶液,混勻后與酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)吸光度值。

    1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期

    按照1.2中所述的6孔板中轉(zhuǎn)染后,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,用PBS清洗3次,棄掉上清液,用100 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入10μl Annexin V-FITC和5 μl的PI,混勻后室溫避光反應(yīng)15 min,最后于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

    按照1.2中所述的6孔板中轉(zhuǎn)染后,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,用PBS清洗3次,加入0.6 ml PI溶液(含 10mg/L RNase、0.1%Triton-100、50 mg/L PI),4℃避光反應(yīng)15 min后,于流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)含量。

    1.7 熒光素酶實(shí)驗(yàn)

    G6PD轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-G6PD-wt及相應(yīng)的突變載體pGL-G6PD-mut(由江蘇省南京科佰生物科技有限公司構(gòu)建),人骨肉瘤細(xì)胞以1.6×104濃度接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板,24 h后按照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書將200 ng的重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-G6PD-wt、pGLG6PD-mut與2ng的海腎熒光素酶報(bào)告載體pRL-TK共轉(zhuǎn)染到每孔細(xì)胞中,4 h后更換新鮮培養(yǎng)基,每組各重復(fù)3個(gè)孔。24 h后檢測(cè)螢火蟲和海腎熒光素酶活性,兩者的比值視為相對(duì)熒光素酶活性。分組:①空白對(duì)照組;②空載體PGL3-Basic,內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染組;③PGL3-G6PD、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染組;④MZF-1組成型激活型表達(dá)質(zhì)粒、PGL3-G6PD、PRL-TK共轉(zhuǎn)染組;⑤MZF-1組成型活化型表達(dá)質(zhì)粒、PGL3-G6PD-mutant、PRL-TK 共轉(zhuǎn)染組。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較做單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 骨肉瘤細(xì)胞中MZF-1及G6PD表達(dá)

    經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示:①不同組細(xì)胞中MZF-1、G6PD的表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=68.91和78.05,均P=0.000)。②與正常人成骨細(xì)胞hFOB1.19比較,MZF-1在3種骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)下降,G6PD的表達(dá)上升(見表2)。Western blot結(jié)果同樣表明,MZF-1在3種骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)下降,G6PD的表達(dá)上升。見圖1。

    表2 各組MZF-1和G6PD的表達(dá) (±s)

    表2 各組MZF-1和G6PD的表達(dá) (±s)

    組別 MZF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 G6PD mRNA相對(duì)表達(dá)量hFOB1.19 1±0.08 1±0.12 MF-63 0.45±0.04 2.47±0.13 Saos2 0.52±0.03 2.19±0.13 HOS 0.61±0.04 2.35±0.15

    圖1 各組MZF-1和G6PD的表達(dá)

    2.2 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)HOS細(xì)胞增殖影響

    轉(zhuǎn)染48 h后,轉(zhuǎn)染效率可達(dá)48%(見圖2)。采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示:同組細(xì)胞不同轉(zhuǎn)染時(shí)間后的細(xì)胞增殖情況比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=362.7,P=0.000);pcDNA3.1-MZF-1 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與CK組細(xì)胞增殖比較,在48及72 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=79.94和119.1,均P=0.000);與CK組比較,pcDNA3.1-MZF-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖下降。見表3。

    圖2 pcDNA3.1-MZF-1轉(zhuǎn)染HOS 48 h的轉(zhuǎn)染效率(×100)

    表3 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)HOS細(xì)胞增殖的影響 (±s)

    表3 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)HOS細(xì)胞增殖的影響 (±s)

    組別 24 h 48 h 72 h CK 組 0.35±0.04 0.65±0.03 0.85±0.04 pcDNA3.1-vector組 0.32±0.02 0.61±0.03 0.88±0.04 pcDNA3.1-MZF-1組 0.30±0.02 0.42±0.02 0.51±0.03

    2.3 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)HOS細(xì)胞凋亡的影響

    與CK組比較,過(guò)表達(dá)MZF-1可促進(jìn)HOS細(xì)胞凋亡,凋亡率達(dá)到58.92%,為CK組的2.97倍(見圖3A)。其次,單因素方差分析結(jié)果顯示:①各組間Bax、Caspase-3及Bcl-2的表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=285.4、145.1 及 59.39,均 P=0.000);②與CK組比較,pcDNA3.1-MZF-1轉(zhuǎn)染組中的 Bax、Caspase-3的表達(dá)上升,Bcl-2的表達(dá)下降。見表4和圖3B。

    圖3 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)HOS細(xì)胞凋亡的影響

    2.4 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)HOS細(xì)胞周期的影響

    單因素方差分析結(jié)果顯示:①不同組中的G0/G1、S及G2期DNA含量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=201.5、48.42 及 19.44;P=0.000、0.000 及 0002);②與CK組比較,MZF-1轉(zhuǎn)染組中G0/G1期DNA含量上升,S和G2期DNA含量下降。見圖4。

    圖4 過(guò)表達(dá)MZF-1阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期

    表4 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)Bax、Caspase-3及Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 (±s)

    表4 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)Bax、Caspase-3及Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 (±s)

    組別 Bax Caspase-3 Bcl-2 CK組 1±0.08 1±0.08 1±0.08 pcDNA3.1-vector組 1.05±0.07 1.12±0.09 1.04±0.08 pcDNA3.1-MZF-1組 2.35±0.08 2.68±0.20 0.51±0.02

    2.5 MZF-1對(duì)G6PD轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)作用

    單因素方差分析結(jié)果顯示:①各組間的熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=77.99,P=0.000);②與其他組比較,MZF-1與PGL3-G6PD共轉(zhuǎn)染后,熒光素酶活性下降(見圖5),表明MZF-1可負(fù)向調(diào)節(jié)G6PD的轉(zhuǎn)錄活性。

    2.6 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)G6PD表達(dá)的影響

    Real-time PCR及Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)G6PD表達(dá)的影響,單因素方差分析結(jié)果顯示:①各組間MZF-1及G6PD的mRNA表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=259.3和93.97,均P=0.000);②與CK組比較,pcDNA3.1-MZF-1轉(zhuǎn)染組可促進(jìn)MZF-1的表達(dá),抑制G6PD的表達(dá)。見表5和圖6。

    圖5 MZF-1可靶向調(diào)節(jié)G6PD的轉(zhuǎn)錄活性

    圖6 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)G6PD表達(dá)的影響

    表5 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)MZF-1及G6PD mRNA表達(dá)的影響 (±s)

    表5 過(guò)表達(dá)MZF-1對(duì)MZF-1及G6PD mRNA表達(dá)的影響 (±s)

    組別 MZF-1 G6PD CK組 1±0.088 1±0.091 pcDNA3.1-vector組PcDNA3.1-MZF-1組1.06±0.094 4.23±0.330 1.15±0.073 0.42±0.025

    3 討論

    MZF-1廣泛參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過(guò)程。如MZF-1在一些造血性惡性腫瘤和實(shí)體瘤中具有抑制腫瘤發(fā)展的作用[16];MZF-1通過(guò)促使鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白誘導(dǎo)的鐵外排抑制前列腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10];過(guò)表達(dá)MZF-1可抑制人宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移[17]。本研究結(jié)果表明,MZF-1在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)下降,且過(guò)表達(dá)MZF-1可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡,且將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,表明MZF-1在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌的作用。

    G6PD可催化葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入戊糖磷酸途徑,一方面對(duì)葡萄糖-6-磷酸進(jìn)行分流促進(jìn)糖酵解的進(jìn)行,另一方面提供核糖5-磷酸和NADPH,作為核酸、脂肪酸和膽固醇等物質(zhì)合成的源來(lái),為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供必要的條件[11]。研究報(bào)道,腫瘤細(xì)胞中的磷酸戊糖途徑活性高于正常細(xì)胞,其主要機(jī)制則為腫瘤細(xì)胞內(nèi)G6PD基因表達(dá)的增加。如在人黑色素瘤腫瘤模型小鼠中,G6PD可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[18];G6PD還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1/D2參與到人皮膚黑色素瘤A375細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)換的進(jìn)程[19]。此外,有研究報(bào)道,人G6PD基因啟動(dòng)子區(qū)域存在MZF1的結(jié)合位點(diǎn)[20],但是MZF-1對(duì)G6PD具體調(diào)控機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果證明,G6PD在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)上升,且熒光素酶活性驗(yàn)證MZF-1可靶向結(jié)合到G6PD啟動(dòng)子區(qū)域,并且過(guò)表達(dá)MZF-1可抑制G6PD的表達(dá)。MZF-1的轉(zhuǎn)錄抑制作用已在多種生物學(xué)過(guò)程中被證實(shí),如過(guò)表達(dá)MZF-1可通過(guò)靶向抑制MMP-2表達(dá)來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移[21];MZF-1可通過(guò)抑制CD34和cmyB的表達(dá)抑制胚胎干細(xì)胞的血發(fā)生[22];因此,MZF-1通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制G6PD的表達(dá),進(jìn)而在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌的作用。

    綜上所述,本研究表明MZF-1可通過(guò)抑制G6PD的表達(dá),抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生,并且還可以將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,為骨肉瘤的治療提供新的思路。

    [1]TSUKAHARA T,WADA T.Immunotherapy for osteosarcoma[M].Springer Japan,2016:31-41.

    [2]XU N,LI Z,YU Z,et al.MicroRNA-33b suppresses migration and invasion by targeting c-Myc in osteosarcoma cells[J].PloS One,2014,9(12):e115300-e115300.

    [3]劉躍亮,羅進(jìn)勇,張彥,等.雙氫青蒿素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株143B增殖和凋亡的作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2012,28(12):1719-1723.

    [4]PAN W,WANG H,JIANWEI R,et al.MicroRNA-27a promotes proliferation,migration and invasion by targeting MAP2K4 in human osteosarcoma cells[J].Cellular Physiology& Biochemistry,2014,33(2):402-412.

    [5]胡涂,楊慶誠(chéng),程冬冬.骨肉瘤轉(zhuǎn)移侵襲機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)骨與關(guān)節(jié)雜志,2015(1):41-44.

    [6]NIU G,LI B,SUN L,et al.MicroRNA-153 inhibits osteosarcoma cells proliferation and invasion by targeting TGF-β2[J].PloS One,2015,10(3):e0119225.

    [7]MENG Y A,WANG,LIANG,et al.Myeloid zinc finger I(MZF1)is the most important transcriptional factor for porcine follistatin promoter[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)報(bào):英文版,2015(7):1383-1389.

    [8]DENG Y,WANG J,WANG G,et al.p55PIK transcriptionally activated by MZF1 promotes colorectal cancer cell proliferation[J].Biomed Research International,2013,2013(1):868131.

    [9]HUANG R Y,SU S G,WU D C,et al.BLZF1 expression is of prognostic significance in hepatocellular carcinoma[J].Biochemical&Biophysical Research Communications,2015,467(3):602-609.

    [10]CHEN Y,ZHANG Z,YANG K,et al.Myeloid zinc-finger 1(MZF-1)suppressesprostatetumorgrowth through enforcing ferroportin-conducted iron egress[J].Oncogene,2015,34(29):3839-3847.

    [11]張正,蔡天池,王艷玲,等.G6PD缺陷誘發(fā)人黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡機(jī)制研究[J].中華腫瘤防治雜志,2014,21(14):1054-1058.

    [12]李丹怡,朱月春.沉默G6PD表達(dá)對(duì)人皮膚黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及抗氧化應(yīng)激的影響(摘要)[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,31(5):148.

    [13]STAMOVA B S,APPERSON M,WALKER W L,et al.Identification and validation of suitable endogenous reference genes for gene expression studies in human peripheral blood[J].Bmc Medical Genomics,2009,2(8):49.

    [14]XIN W,LIU H,ZHANG X,et al.G6PD downregulation triggered growth inhibition and induced apoptosis by regulating STAT3 signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma[J].Tumor Biology,2016,37(1):781-789.

    [15]盧玲琳,梁海萍,顏冬菁.人G6PD基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合蛋白的生物信息學(xué)分析[J].生物技術(shù)世界,2015(4):13-14.

    [16]GABOLI M,KOTSI P A,GURRIERI C,et al.Mzf1 controls cell proliferation and tumorigenesis[J].Genes& Development,2001,15(13):1625-1630.

    [17]TSAI S J,HWANG J M,HSIEH S C,et al.Overexpression of myeloid zinc finger 1 suppresses matrix metalloproteinase-2 expression and reduces invasiveness of SiHa human cervical cancer cells[J].Biochemical&Biophysical Research Communications,2012,425(2):462.

    [18]TAO H,ZHANG C,TANG Q,et al.Variant G6PD levels promotetumorcellproliferation orapoptosisvia the STAT3/5 pathway in the human melanoma xenograft mouse model[J].Bmc Cancer,2013,13(1):251-251.

    [19]唐瓊玲,張春華,胡滔,等.G6PD通過(guò)細(xì)胞周期蛋白D1/D2調(diào)控人黑色素瘤細(xì)胞周期的進(jìn)程[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2011,27(10):933-941.

    [20]LU L,LIANG H,YAN D.Bioinformatics analysis of transcription factor binding site in the promoter of human G6PD gene[J].Biotech World,2015(4):1-3.

    [21]TSAI S J,HWANG J M,HSIEH S C,et al.Overexpression of myeloid zinc finger 1 suppresses matrix metalloproteinase-2 expression and reduces invasiveness of SiHa human cervical cancer cells[J].Biochemical&Biophysical Research Communications,2012,425(2):462-467.

    [22]PERROTTI D,MELOTTI P,SKORSKI T,et al.Overexpression of the zinc finger protein MZF1 inhibits hematopoietic development from embryonic stem cells:correlation with negative regulation of CD34 and c-myb promoter activity[J].Molecular&Cellular Biology,1995,15(11):6075-6087.

    Effect ofMZF-1on proliferation and apoptosis osteosarcoma cells

    Xu-zhao Du,Hao Yang,Su-ling Deng,Dong-liang Shi,Qing-liang Meng
    (Department of Orthopedics and Traumatology,Henan Provincial Hospital of TCM,Zhengzhou,Henan 450002,China)

    R730.5

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.008

    1005-8982(2017)21-0043-06

    2017-01-11

    孟慶良,E-mail:haoyanghn@163.com

    猜你喜歡
    檢測(cè)
    QC 檢測(cè)
    “不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式組”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    “有理數(shù)的乘除法”檢測(cè)題
    “有理數(shù)”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    国产野战对白在线观看| 国产男人的电影天堂91| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产黄频视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 97在线人人人人妻| 国产精品99久久99久久久不卡 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品视频人人做人人爽| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲成人手机| 亚洲情色 制服丝袜| 国产片内射在线| av免费观看日本| 亚洲一区二区三区欧美精品| 大香蕉久久网| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费黄色在线免费观看| 又黄又粗又硬又大视频| av一本久久久久| 99久久精品国产亚洲精品| 大话2 男鬼变身卡| 在线观看免费高清a一片| av网站在线播放免费| 啦啦啦在线观看免费高清www| 极品人妻少妇av视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 最近手机中文字幕大全| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品久久久久成人av| 97人妻天天添夜夜摸| 妹子高潮喷水视频| 伊人久久国产一区二区| 欧美在线黄色| 日本黄色日本黄色录像| 国产不卡av网站在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 老司机影院毛片| 亚洲成色77777| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 宅男免费午夜| tube8黄色片| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲成人一二三区av| 亚洲成人一二三区av| 免费看av在线观看网站| 在线观看www视频免费| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲成人手机| 精品一区在线观看国产| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 丝袜人妻中文字幕| 国产av码专区亚洲av| 国产成人精品在线电影| av有码第一页| av视频免费观看在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 999久久久国产精品视频| 久久精品久久久久久久性| 久久久久精品性色| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 91精品国产国语对白视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 中文字幕色久视频| 99热网站在线观看| 人人妻人人澡人人看| 亚洲天堂av无毛| 欧美精品一区二区免费开放| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产av国产精品国产| 最近中文字幕高清免费大全6| 91老司机精品| 天美传媒精品一区二区| 久久97久久精品| 亚洲精品日本国产第一区| 久久精品久久久久久久性| 国产在线一区二区三区精| 国产精品国产av在线观看| 国产成人精品福利久久| 美女高潮到喷水免费观看| 大香蕉久久网| 欧美激情高清一区二区三区 | 日日撸夜夜添| 久久久国产一区二区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产乱来视频区| 亚洲图色成人| tube8黄色片| 美女中出高潮动态图| 免费看不卡的av| 成人免费观看视频高清| 交换朋友夫妻互换小说| 两性夫妻黄色片| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美精品av麻豆av| 伦理电影免费视频| 男男h啪啪无遮挡| 老司机深夜福利视频在线观看 | av.在线天堂| 欧美日韩视频精品一区| 国产精品 欧美亚洲| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产成人精品久久久久久| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲精品久久午夜乱码| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产av码专区亚洲av| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲欧洲日产国产| 黄色毛片三级朝国网站| 最近的中文字幕免费完整| 欧美日韩亚洲高清精品| 午夜福利一区二区在线看| 欧美日韩综合久久久久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久视频综合| 国产视频首页在线观看| 激情五月婷婷亚洲| 成人国产麻豆网| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日本vs欧美在线观看视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 性少妇av在线| 制服人妻中文乱码| 啦啦啦在线免费观看视频4| 天堂8中文在线网| 国产精品 欧美亚洲| 丰满乱子伦码专区| 国产男人的电影天堂91| 免费不卡黄色视频| 一级毛片 在线播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲,一卡二卡三卡| av卡一久久| 男男h啪啪无遮挡| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲五月色婷婷综合| 久久久久久人人人人人| 成年av动漫网址| 国产成人一区二区在线| 91精品三级在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲天堂av无毛| 大码成人一级视频| 久久久久精品国产欧美久久久 | av电影中文网址| 一本大道久久a久久精品| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲三区欧美一区| 老熟女久久久| 欧美在线黄色| 80岁老熟妇乱子伦牲交| kizo精华| 成年人免费黄色播放视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 色94色欧美一区二区| 亚洲av电影在线进入| 香蕉丝袜av| 成人毛片60女人毛片免费| 久久99一区二区三区| 交换朋友夫妻互换小说| 中文天堂在线官网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 久久久久久久精品精品| 中国国产av一级| 校园人妻丝袜中文字幕| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 中文字幕av电影在线播放| 久久97久久精品| 精品第一国产精品| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久精品国产综合久久久| 亚洲国产最新在线播放| av不卡在线播放| 久久久久网色| 悠悠久久av| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产精品久久久人人做人人爽| 久久鲁丝午夜福利片| 18在线观看网站| 日韩大片免费观看网站| 男女边吃奶边做爰视频| av天堂久久9| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 一级毛片我不卡| 国产乱来视频区| 一个人免费看片子| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| kizo精华| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 性高湖久久久久久久久免费观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 我要看黄色一级片免费的| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久久国产欧美日韩av| 午夜福利视频在线观看免费| 欧美97在线视频| 美女午夜性视频免费| 熟女av电影| 人体艺术视频欧美日本| 丝袜人妻中文字幕| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日韩成人av中文字幕在线观看| 色视频在线一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 一区二区三区乱码不卡18| 在线 av 中文字幕| 一本大道久久a久久精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 大香蕉久久网| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲七黄色美女视频| av在线观看视频网站免费| 在线观看免费午夜福利视频| 国产一区二区在线观看av| 一边亲一边摸免费视频| av在线播放精品| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | av国产精品久久久久影院| 美国免费a级毛片| 免费看av在线观看网站| 十八禁高潮呻吟视频| a级片在线免费高清观看视频| 国产高清不卡午夜福利| 丝袜人妻中文字幕| 色综合欧美亚洲国产小说| 99九九在线精品视频| 999久久久国产精品视频| 亚洲人成网站在线观看播放| av网站免费在线观看视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 综合色丁香网| 亚洲精品第二区| 亚洲第一青青草原| 超色免费av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 婷婷成人精品国产| 九草在线视频观看| 99香蕉大伊视频| 精品少妇久久久久久888优播| 婷婷成人精品国产| 欧美人与善性xxx| 日本av免费视频播放| 亚洲伊人久久精品综合| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产av国产精品国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品国产av在线观看| 午夜福利免费观看在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 日韩大片免费观看网站| av天堂久久9| 精品久久久精品久久久| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 男人添女人高潮全过程视频| 波野结衣二区三区在线| 国产极品天堂在线| 一级毛片 在线播放| 少妇人妻久久综合中文| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品蜜桃在线观看| 考比视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲欧洲日产国产| 一级黄片播放器| 欧美激情 高清一区二区三区| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产99久久九九免费精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 男女床上黄色一级片免费看| 天天操日日干夜夜撸| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 91精品国产国语对白视频| 自线自在国产av| 免费观看人在逋| 国产成人啪精品午夜网站| 久热爱精品视频在线9| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲美女视频黄频| 激情视频va一区二区三区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产欧美亚洲国产| 久久97久久精品| 亚洲国产精品999| 人人妻人人澡人人看| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲国产精品999| 日韩伦理黄色片| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| av不卡在线播放| 国产又色又爽无遮挡免| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲熟女精品中文字幕| 99久国产av精品国产电影| 国产成人一区二区在线| 又大又黄又爽视频免费| 丝袜美足系列| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产人伦9x9x在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 人体艺术视频欧美日本| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人欧美| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲免费av在线视频| 亚洲一区中文字幕在线| av在线app专区| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲成人一二三区av| 成人亚洲欧美一区二区av| 成人国产av品久久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产片特级美女逼逼视频| 另类亚洲欧美激情| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 日韩一本色道免费dvd| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲成人一二三区av| 欧美日韩综合久久久久久| 男女高潮啪啪啪动态图| 美女视频免费永久观看网站| 大陆偷拍与自拍| 午夜久久久在线观看| 黄色 视频免费看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久久久久久久免费视频了| 91成人精品电影| 男人操女人黄网站| 人妻人人澡人人爽人人| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 狂野欧美激情性xxxx| 激情视频va一区二区三区| 国产成人精品福利久久| 中国三级夫妇交换| 亚洲欧美激情在线| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美精品一区二区免费开放| 好男人视频免费观看在线| 精品一区二区三卡| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产成人啪精品午夜网站| 18禁动态无遮挡网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 18禁国产床啪视频网站| 操美女的视频在线观看| 欧美日韩精品网址| 捣出白浆h1v1| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 五月天丁香电影| 国产伦理片在线播放av一区| 99热网站在线观看| 国产 精品1| 亚洲国产日韩一区二区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品欧美亚洲77777| 婷婷成人精品国产| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲伊人色综图| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产av国产精品国产| 久热这里只有精品99| www.熟女人妻精品国产| 欧美变态另类bdsm刘玥| 人人澡人人妻人| 亚洲国产日韩一区二区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲综合精品二区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一级a爱视频在线免费观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 一级黄片播放器| 国产精品成人在线| 亚洲国产成人一精品久久久| e午夜精品久久久久久久| 精品亚洲成国产av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品少妇黑人巨大在线播放| 99久久综合免费| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 老司机影院成人| 中文天堂在线官网| 在线观看www视频免费| av免费观看日本| 深夜精品福利| 久久精品久久精品一区二区三区| videosex国产| 欧美人与性动交α欧美软件| 男女免费视频国产| 一级黄片播放器| 亚洲熟女精品中文字幕| 伊人久久国产一区二区| 日韩av免费高清视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 一级毛片电影观看| 国产在线视频一区二区| 咕卡用的链子| 一级片免费观看大全| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品一二三| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久久久精品人妻al黑| 9191精品国产免费久久| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲三区欧美一区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产又爽黄色视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| av电影中文网址| 亚洲av欧美aⅴ国产| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产乱人偷精品视频| 久久久国产一区二区| 熟女av电影| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产有黄有色有爽视频| 久热爱精品视频在线9| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲图色成人| 午夜久久久在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 大片免费播放器 马上看| 大话2 男鬼变身卡| 在线观看www视频免费| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品 国内视频| 久热爱精品视频在线9| 亚洲熟女精品中文字幕| 在线观看人妻少妇| 中文字幕最新亚洲高清| 成人亚洲精品一区在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 色吧在线观看| 国产一卡二卡三卡精品 | 热99久久久久精品小说推荐| 我的亚洲天堂| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 最黄视频免费看| 欧美av亚洲av综合av国产av | 啦啦啦 在线观看视频| 久久热在线av| 亚洲,欧美精品.| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| av一本久久久久| 午夜日韩欧美国产| 亚洲人成77777在线视频| 好男人视频免费观看在线| 午夜福利免费观看在线| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲国产日韩一区二区| 毛片一级片免费看久久久久| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲综合精品二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 无限看片的www在线观看| 女人久久www免费人成看片| 香蕉丝袜av| 91精品伊人久久大香线蕉| 看免费成人av毛片| 免费观看性生交大片5| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲精品aⅴ在线观看| 一本大道久久a久久精品| 成年人免费黄色播放视频| 午夜免费鲁丝| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 美女福利国产在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品一区二区在线观看99| 男男h啪啪无遮挡| 性高湖久久久久久久久免费观看| 高清不卡的av网站| 在线天堂中文资源库| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久久国产欧美日韩av| 中文字幕色久视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 老司机在亚洲福利影院| 大香蕉久久成人网| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产成人精品久久二区二区91 | 精品人妻在线不人妻| 国产一区二区 视频在线| 国产一卡二卡三卡精品 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日本午夜av视频| av女优亚洲男人天堂| 亚洲精品,欧美精品| 一本久久精品| av.在线天堂| 日韩 亚洲 欧美在线| 成人亚洲精品一区在线观看| 丰满少妇做爰视频| 美女大奶头黄色视频| 国产成人免费无遮挡视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 午夜91福利影院| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 啦啦啦在线免费观看视频4| 色94色欧美一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产精品一二三区在线看| 只有这里有精品99| 国产片特级美女逼逼视频| 街头女战士在线观看网站| 国产精品久久久久久精品电影小说| 男女边摸边吃奶| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久久人人人人人| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品一二三区在线看| 午夜老司机福利片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 在线观看免费午夜福利视频| 国产在线一区二区三区精| 国产97色在线日韩免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 丁香六月欧美| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 波多野结衣一区麻豆| 精品人妻一区二区三区麻豆| 最新在线观看一区二区三区 | www.av在线官网国产| 国产1区2区3区精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 五月天丁香电影| 一级片免费观看大全| 另类精品久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 男人添女人高潮全过程视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美最新免费一区二区三区| 成年人午夜在线观看视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 婷婷成人精品国产| 制服诱惑二区| 丝袜在线中文字幕| 欧美日韩福利视频一区二区| 嫩草影视91久久| 精品午夜福利在线看| 青春草视频在线免费观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 秋霞伦理黄片| 日本爱情动作片www.在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 欧美日韩精品网址| 国产黄频视频在线观看| 悠悠久久av| 女人精品久久久久毛片| 精品一品国产午夜福利视频| 久久热在线av| videosex国产| 在现免费观看毛片| 欧美日韩成人在线一区二区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 午夜免费观看性视频| xxxhd国产人妻xxx| 看免费成人av毛片| 久久韩国三级中文字幕| 99精国产麻豆久久婷婷| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 制服丝袜香蕉在线|