布地奈德聯(lián)合辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥因子與肺組織病理的影響*

劉曉姝，郭璐

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，四川 成都 610072）

布地奈德聯(lián)合辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥因子與肺組織病理的影響*

劉曉姝，郭璐

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，四川 成都 610072）

目的探討布地奈德聯(lián)合辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠模型炎癥因子與肺組織病理的影響，為藥物干預(yù)方案提供實驗依據(jù)。方法根據(jù)不同的藥物干預(yù)方案將COPD大鼠分為模型組（M組）、布地奈德組（BD組）、辛伐他汀組（SV組）及布地奈德聯(lián)合辛伐他汀組（BD+SV組），比較不同組別COPD大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液（BLAF）中的白細(xì)胞介素 6（IL-6）、白細(xì)胞介素 8（IL-8）、白三烯 B4（LTB4）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平及肺組織病理的改變。結(jié)果血清炎癥因子水平：BD組IL-6、TNF-α，SV組IL-6，（BD+SV）組 IL-6、IL-8及 TNF-α 分別較 M組降低（均P＜0.05）；（BD+SV）組 IL-8水平較 SV 組下降（P＜0.05）。BALF 炎癥因子水平：BD 組 IL-6、IL-8，SV 組 IL-6、TNF-α，（BD+SV）組 IL-6、IL-8、LTB4 及 TNF-α 水平分別較M組降低（均P＜0.05）。（BD+SV）組BALF中IL-8、LTB4及TNF-α水平較BD組降低，IL-8、LTB4水平較SV組下降（均P＜0.05）。BD組、SV組、（BD+SV）組肺組織病理半定量評分較M組降低（均P＜0.05），病理均顯示肺氣腫囊腔變小、支氣管炎癥減輕。結(jié)論使用布地奈德聯(lián)合辛伐他汀可以有效降低COPD大鼠全身和氣道炎癥反應(yīng)，改善肺組織病理。

肺疾??；慢性阻塞性；炎癥；布地奈德；辛伐他汀

Abstract:ObjectiveTo investigate synergistic effect of Budesonide and Simvastatin on cytokines and pulmonary histological injury in rat models of chronic obstructive pulmonary disease (COPD)so as to provide indications for novel pharmacological intervention.MethodsRats were randomly divided into model(M)group,Budesonide (BD)group,Simvastatin (SV)group and Budesonide combined with Simvastatin (BD+SV)group.Levels of interleukin6(IL-6),interleukin8(IL-8),leukotriene B4 (LTB4)and tumor necrosis factor alpha(TNF-α)in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF)were measured.Histological injury was graded in rat lung slices.ResultsInflammatory cytokines in serum:compared with the M group,levels of IL-6 and TNF-α in the BD group,IL-6 in the SV group,and IL-6,IL-8 and TNF-α in the BD+SV group were decreased (P＜0.05).The level of IL-8 was attenuated in the BD+SV group compared with those in the SV group (P＜0.05).Inflammatory cytokines in BALF:the levels of IL-6 and IL-8 in the BD group,IL-6 and TNF-α in the SV group,and IL-6,IL-8,LTB4 and TNF-α in the BD+SV group were reduced compared with those in the M group(P＜0.05).Levels of IL-8,LTB4 and TNF-α in the BD+SV group were decreased in comparison with those in the BD group.Levels of IL-8 and LTB4 could be diminished by BD+SVtreatment when compared with the SV group (P＜0.05).Semi-quantitative scores of pathological changes of lung tissues in the BD group,the SV group and the BD+SV group were lower than those in the M group(P＜0.05),the lung tissues showed reduced cyst cavities and alleviated bronchitis.ConclusionsBudesonide combined with Simvastatin could synergistically relieve systematic and airway inflammation,and attenuate histological injury in the lungs of COPD rat models.

Keywords:chronic obstructive pulmonary disease;inflammation;Budesonide;Simvastatin

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種以氣道和全身炎癥為特征的疾病[1]，死亡率高且不斷增長，預(yù)計到2020年將成為世界第3大死因，因此需積極干預(yù)，以控制癥狀、減少急性加重和降低死亡率。在COPD穩(wěn)定期的治療中，吸入性糖皮質(zhì)激素（inhaled corticosteroid，ICS）能減少氣道和全身炎癥，減少COPD急性加重次數(shù)[2]。他汀類藥物在關(guān)于COPD的觀察性研究中，與減慢肺功能下降、降低COPD急性加重發(fā)生率、死亡率有關(guān)[3-4]；亦有報道他汀可增加ICS的局部抗炎作用[5]，兩者聯(lián)合可改善COPD臨床癥狀[6-7]，但證據(jù)較少。本研究使用布地奈德聯(lián)合辛伐他汀干預(yù)COPD大鼠模型，觀察其血清和支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎癥因子表達(dá)量和肺組織病理的改變，探討ICS聯(lián)合他汀對COPD大鼠炎癥的影響及是否存在協(xié)同作用和聯(lián)合應(yīng)用的可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Wistar大鼠，180～200 g，全為雄性，無特定病原體級（specific pathogen free，SPF）（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），脂多糖（LPS）（購自SIGMA公司，批號L2880-10，10 mg/支），嬌子（時代陽光）牌香煙（購自四川省成都川渝中煙工業(yè)公司，焦油量：12 mg），辛伐他汀片（購自美國默沙東制藥有限公司），吸入用布地奈德混懸液（購自英國阿斯利康制藥有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

自制有機玻璃煙熏箱80 cm×60 cm×50 cm，Hamilton微量進(jìn)樣器，魚躍超聲霧化器402AI（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；Riester LED光纖檢耳鏡（中國Aglaia healthcare公司），生物顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司），Bio-Road公司酶標(biāo)儀（上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型復(fù)制45只SPF級大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)10d后隨機分為模型組（M組）、布地奈德組（BD組）、辛伐他汀組（SV組）及布地奈德聯(lián)合辛伐他汀組（BD+SV）組4組，每組15只。M組處理方案參照文獻(xiàn)[8]，煙熏時間共計 60 d；BD 組、SV 組、（BD+SV）組煙熏、滴注LPS同M組。BD組：試驗第15天開始霧化吸入布地奈德氣霧劑0.5 mg，每次15 min，2次/d；SV組：試驗第15天開始，每日煙熏前，給予辛伐他汀（5 mg/kg）灌胃，1次/d；（BD+SV）組：試驗第15天開始加用辛伐他?。? mg/kg），1次/d灌胃治療，霧化吸入布地奈德氣霧劑0.5 mg，15 min/次，2次/d。飼養(yǎng)過程中觀察行為學(xué)變化淘汰異常大鼠。

1.3.2 血清檢測實驗第60天，稱重所有大鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥固定于操作臺，分離腹主動脈，抽取動脈血5 ml，離心分離血清，Elisa法測定血清白細(xì)胞介素 6（interleukin，IL-6）、白細(xì)胞介素 6（interleukin，IL-8）、白三烯 B4（Leukotriene B4，LTB4）和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）含量。

1.3.3 BALF檢測切開暴露胸部，結(jié)扎右主支氣管，于隆突上用套管針穿刺至左肺，以2 ml生理鹽水灌洗，緩慢回抽，每次回收約1.5 ml，反復(fù)灌洗3次，回收率要求達(dá)到75%，混勻灌洗液，離心后取上清液Elisa法測 IL-6、IL-8、LTB4及 TNF-α 濃度。

1.3.4 肺組織觀察取新鮮右肺下葉組織，經(jīng)10%中性福爾馬林固定48 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片4張，HE染色，光鏡下觀察右肺下葉病理改變并進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用單因素方差分析，若方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

各組大鼠血清炎癥因子中LTB4水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.185，P=0.329），IL6、IL-8 及 TNF-α水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.826、7.212及5.329，P=0.001、0.001及0.004）。與M組比較，BD組血清炎癥因子IL-6、TNF-α水平降低，SV組IL-6降低，BD+SV組IL-6、IL-8及TNF-α水平降低（均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與BD組比較，BD+SV組血清炎癥因子IL-6、IL-8、LTB4及TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與SV組比較，BD+SV組血清炎癥因子IL-8水平降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 不同組別COPD大鼠血清炎癥因子水平比較（ng/L，±s）

表1 不同組別COPD大鼠血清炎癥因子水平比較（ng/L，±s）

組別 例數(shù) IL-6 IL-8 LTB4 TNF-α M 組 9 3.8±0.2 167.6±13.0 358.5±23.9 129.4±8.7 BD 組 10 3.4±0.4 164.0±6.5 379.3±29.3 120.4±4.8 SV 組 10 3.4±0.3 175.0±11.5 376.6±25.5 122.3±4.4 BD+SV 組 11 3.2±0.3 154.1±10.0 357.0±10.7 118.5±6.7 F值 6.826 7.212 1.185 5.329 P值 0.001 0.001 0.329 0.004

2.2 各組大鼠BALF中炎癥因子水平比較

各組大鼠BALF炎癥因子水平中，IL-6、IL-8、LTB4及TNF-α水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.249、13.437、7.693 及 8.436，P=0.011、0.000、0.000 及 0.001）。與M組比較，BALF中炎癥因子BD組IL-6、IL-8水平減低，SV組 IL-6、TNF-α 水平降低，BD+SV組IL-6、IL-8、LTB4及 TNF-α 水平降低（均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與BD組比較，BD+SV組IL-8、LTB4、TNF-α 降低（均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與SV組比較，BD+SV組BALF中IL-8、LTB4水平降低（均P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 不同組別COPD大鼠BALF中炎癥因子水平比較（ng/L，±s）

表2 不同組別COPD大鼠BALF中炎癥因子水平比較（ng/L，±s）

組別 例數(shù) IL-6 IL-8 LTB4 TNF-α M 組 9 10.7±1.7 97.1±8.4 196.3±17.6 46.0±3.5 BD 組 10 9.1±0.8 88.8±5.1 192.6±12.1 43.0±3.2 SV 組 10 9.0±0.4 92.0±4.6 182.7±12.1 41.7±3.8 BD+SV 組 11 9.1±1.2 81.1±5.0 172.1±13.8 38.1±2.8 F值 4.249 13.437 7.693 8.436 P值 0.011 0.000 0.000 0.001

2.3 肺組織光鏡觀察

2.3.1 各組大鼠肺組織病理M組大鼠肺組織可見支氣管纖毛柱狀上皮細(xì)胞部分剝脫，纖毛粘連倒伏，杯狀細(xì)胞增生，黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤，支氣管平滑肌增厚，管腔內(nèi)充滿中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞及粘液分泌物，終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端狹窄，呼吸細(xì)支氣管及肺泡管囊狀擴(kuò)張，有肺氣腫和肺大皰形成。BD組、SV組、BD+SV組大鼠肺組織上皮結(jié)構(gòu)完整，可見部分支氣管纖毛，肺泡結(jié)構(gòu)完整，部分肺泡壁變薄，肺泡腔擴(kuò)大，但較M組肺氣腫囊腔可見變小、各級支氣管炎癥可見減輕。見附圖。

2.3.2 各組大鼠肺組織病理半定量評分比較各組大鼠肺組織病理半定量評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.382，P=0.010）。與M組比較，BD組、SV組及BD+SV組肺組織病理半定量評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；BD組、SV組及BD+SV組3組間兩兩比較肺組織病理半定量評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

附圖 不同組別大鼠肺組織病理比較 （HE×100）

表3 不同組別大鼠肺組織病理半定量評分比較 （±s）

表3 不同組別大鼠肺組織病理半定量評分比較 （±s）

組別 例數(shù) 肺組織病理半定量評分M組 9 2.0±0.7 BD組 10 1.2±0.4 SV組 10 1.4±0.5 BD+SV組 11 1.2±0.4 F值 4.382 P值 0.01

3 討論

感染、氧化應(yīng)激和蛋白酶/抗蛋白酶的失衡等因素引起IL-6、IL-8、LTB4及TNF-α等多種炎癥介質(zhì)的釋放，刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞活化、聚集，造成COPD患者氣道、肺實質(zhì)和血管持續(xù)炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致COPD急性加重的發(fā)生和肺功能降低。因此，下調(diào)COPD炎癥反應(yīng)在COPD的治療中是一項重要環(huán)節(jié)。COPD的藥物干預(yù)措施中，布地奈德具有抗炎抗過敏作用，通過阻斷花生四烯酸代謝和減少白三烯與前列腺合成解除支氣管平滑肌痙攣，減緩呼吸道癥狀的進(jìn)展[9-10]；辛伐他汀為羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，降脂保護(hù)血管功效外還具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用，近年來較多證據(jù)支持其能降低COPD急性加重次數(shù)和死亡率[11-13]。布地奈德聯(lián)合辛伐他汀能否對COPD炎癥反應(yīng)起到協(xié)同干預(yù)作用，目前尚無相關(guān)探討。

在參與COPD的炎性介質(zhì)中，IL-6是具有多種生物功能的炎癥細(xì)胞因子，其參與氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程[14]，導(dǎo)致COPD患者氣道粘液高分泌和氣道重塑；IL-8是主要的炎癥細(xì)胞趨化因子，亦可引起炎癥細(xì)胞的活化和氧自由基的釋放，損傷肺泡上皮細(xì)胞和微血管，其水平高低與COPD的臨床結(jié)局呈正相關(guān)性[15]；LTB4是選擇性中性粒細(xì)胞趨化劑，可導(dǎo)致支氣管壁黏膜炎癥細(xì)胞浸潤增多而進(jìn)一步擴(kuò)大局部炎癥反應(yīng)[16]；TNF-α是炎癥進(jìn)程、免疫應(yīng)答以及宿主防御系統(tǒng)的關(guān)鍵介質(zhì)，并參與肺氣腫的形成和上皮細(xì)胞損傷[17]。研究結(jié)果顯示，相比BD組或SV組僅存在少數(shù)或個別血清炎癥因子水平的降低，BD+SV組血清中IL-6、IL-8和TNF-α水平均出現(xiàn)降低，尤其觀察到IL-8下降的水平較SV組更低，說明布地奈德聯(lián)合辛伐他汀能有效抑制COPD大鼠由IL-6、IL-8及TNF-α介導(dǎo)的全身炎癥反應(yīng)，且對COPD發(fā)病機制起關(guān)鍵作用的IL-8下調(diào)幅度較使用辛伐他汀組更大，分析布地奈德聯(lián)合辛伐他汀不僅發(fā)揮各自抗炎、抗氧化作用外還有協(xié)同效應(yīng)。已有研究顯示，辛伐他汀通過增加IL-10的表達(dá)增強ICS的抗炎效應(yīng)[5]，并能減少ICS使用后的急診事件[18]；而ICS亦可增加COPD患者使用他汀類藥物的益處，兩者聯(lián)合有利于改善COPD患者預(yù)后。

布地奈德聯(lián)合辛伐他汀在下調(diào)氣道局部炎癥水平方面更具優(yōu)勢，BD+SV組大鼠出現(xiàn)BALF中，IL-6、IL-8、LTB4及TNF-α的水平全面降低，其中，IL-8、LTB4及TNF-α水平較BD組，IL-8、LTB4水平較SV組下降，提示布地奈德聯(lián)合辛伐他汀較兩藥分別單用在下調(diào)氣道局部炎癥方面更突出、效應(yīng)更廣泛，進(jìn)一步證實兩種藥物抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用外還有協(xié)同效應(yīng)。病理觀察到BD組、SV組、BD+SV組肺氣腫囊腔變小、支氣管炎癥減輕，肺組織病理半定量評分降低，說明3種治療方案干預(yù)COPD大鼠后肺組織炎癥均得到一定程度的改善，但3組間肺組織病理半定量評分無差異，分析與病理改變滯后于炎癥反應(yīng)以及實驗觀察周期較短有關(guān)。

綜上所述，布地奈德聯(lián)合辛伐他汀既可降低COPD大鼠全身炎癥反應(yīng)水平，又可廣泛的下調(diào)COPD大鼠氣道局部炎癥，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同抗炎作用，進(jìn)而推測ICS聯(lián)合他汀可從抑制炎癥介質(zhì)角度使COPD患者受益，可考慮作為COPD患者穩(wěn)定期的干預(yù)措施。該研究不足之處，觀察周期短，未能觀察到病死率、肺功能的改善，需要大規(guī)模、多中心、隨機雙盲的臨床實驗以進(jìn)一步證實。

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Synergistic effect of Budesonide and Simvastatin on cytokines and lung histological injury in rat models of COPD*

Xiao-Shu Liu,Lu Guo
(Department of Respiratory Medicine,Sichuan Provincial People's Hospital,Sichuan Academy of Medical Sciences,Chengdu,Sichuan 610072,China)

R563.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.002

1005-8982（2017）21-0007-05

2017-03-20

四川省科技廳基礎(chǔ)研究計劃項目（No：2013JY0177）

郭璐，E-mail：18981838226@163.com；Tel：18981838226