喬慧聰　任向波　吳秀麗

摘要：通過對煙草驅(qū)動蛋白家族新成員NtTkr尾部的酵母雙雜交篩選，得到多個與NtTkr互作的候選蛋白。為進一步驗證NtTkr與候選蛋白之間的相互作用，以pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒為模板，PCR擴增煙草NtTKR全長，將其克隆入原核表達載體pMXB10，重組質(zhì)粒pMXB10-NtTkr-3582經(jīng)生物公司測序，結(jié)果正確。將其轉(zhuǎn)化為BL21（DE3），IPTG誘導其表達目的蛋白，經(jīng)幾丁質(zhì)法純化及SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明筆者得到了高純度的目的蛋白。該試驗為進一步運用Pull Down確定NtTkr與候選蛋白之間的體外互作及深入研究該蛋白的其他生物學功能奠定了基礎。

關鍵詞：煙草；新驅(qū)動蛋白；NtTkr；誘導表達；純化

中圖分類號： S572.01文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0024-03

通過cDNA文庫差異篩選方法，成功分離出了一個新基因NtTKR（Nicotiana tabacum kinesin related protein），該基因是驅(qū)動蛋白超家族中的一員。NtTkr與現(xiàn)已知的廣泛表達的多數(shù)植物的驅(qū)動蛋白不同[1-3]，該基因僅在植物的葉和各發(fā)育時期的胚中優(yōu)勢表達。這一特異表達模式說明它可能在胚胎發(fā)生及葉組織分化過程中具有獨特的功能[4-5]。

眾所周知，多數(shù)蛋白質(zhì)需與其他蛋白質(zhì)互作才能發(fā)揮其自身的作用。因此，為了解NtTkr這一新發(fā)現(xiàn)的蛋白的功能，通過對NtTkr尾部的酵母雙雜交篩選，得到多個與NtTkr互作的候選蛋白。

為進一步運用Pull-Down試驗驗證NtTkr與篩選的各候選蛋白之間能否相互作用，以含NtTKR全長的pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒為模板，PCR擴增煙草NtTKR全長，并將其克隆入IMPACT原核表達載體系統(tǒng)新成員pMXB10載體，得到重組質(zhì)粒pMXB10-NtTkr-3582，將其轉(zhuǎn)化為BL21（DE3），再經(jīng)IPTG誘導表達、幾丁質(zhì)法純化及SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示了與預期相符的單一蛋白條帶，說明得到了高純度的純化NtTkr蛋白。該試驗為進一步運用Pull-Down確定NtTkr與候選蛋白之間的體外互作及深入研究該蛋白的其他生物學功能奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒

DH5α、BL21（DE3）菌株、原核表達載體pMXB10及含NtTKR全長的pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒由筆者所在實驗室保存。

1.1.2工具酶及試劑

PCR所用的KOD-plus高保真酶、10×KOD-緩沖液、dNTPs（濃度均為2 mmol/L）、25 mmol/L MgSO4，均購自ToYoBo公司；在TIANGEN公司購買PCR產(chǎn)物純化和DNA凝膠回收試劑盒；于TaKaRa公司購買T4 DNA連接酶、DNA標準分子量Marker和限制性內(nèi)切酶；幾丁質(zhì)親和柱購自NEB公司；于Fermentas公司購買蛋白分子量標準；其余試劑購于生工生物工程（上海）股份有限公司或Sigma公司。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒制備與SDS-PAGE

主要參照Sambrook的方法[6]。采用堿裂解法制備質(zhì)粒，CaCl2法進行轉(zhuǎn)化。SDS-PAGE：各蛋白樣品與等體積2×上樣緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L DTT，4% SDS，20%甘油，0.12%溴酚藍，pH值為6.8）混合，煮沸5～10 min后，13 000 r/min離心5 min，取上清液進行SDS-PAGE。

1.2.2PCR擴增及擴增產(chǎn)物的克隆和鑒定

由北京三博遠志生物工程公司合成引物，引物序列：正向KNs，5′-NNNNNNNCATATGTCAGAGAACAGATTC-3′，反向Kca，5′-NNNNNNNNGCGGCCGCNTATGCGTTCCTGGTAAATGGC-3′，以含NtTKR全長的pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，結(jié)果正確后，用引物兩端引入的NdeⅠ和NotⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物，電泳回收NtTKR片段。

1.2.3原核表達載體構建與鑒定

pMXB10經(jīng)NdeⅠ和 NotⅠ 雙酶切，凝膠回收片段，于16 ℃下用T4 DNA連接酶連接該載體片段與NtTKR片段，16 h后得到連接產(chǎn)物。將該產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α超感細胞，經(jīng)篩選得到成功轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的DH5α，擴大培養(yǎng)該細胞，然后提取質(zhì)粒，酶切鑒定質(zhì)粒，鑒定結(jié)果無誤后，將該重組質(zhì)粒PMXB10-NtTkr-3582送往北京三博遠志生物工程公司進行測序。

1.2.4目的蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測

將測序無誤的PMXB10-NtTkr-3582質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為BL21（DE3）感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化液涂布在LB+50 mg/mL氨芐青霉素（Amp）培養(yǎng)基上進行篩選，然后挑取單克隆至液體LB+Amp培養(yǎng)基中于37 ℃、180 r/min下過夜培養(yǎng)，次日按1 ∶[KG-*3]100稀釋菌液，37 ℃ 下培養(yǎng)4 h左右至其D600 nm為0.8時，分別經(jīng)0、0.06、01、0.6 mmol/L IPTG于37 ℃誘導4 h，取2 mL菌液，于 4 ℃、1 000 r/min 離心1 min，棄上清收集菌體。然后，分別加入 100 μL 去離子水和還原型2×SDS上樣緩沖液懸浮菌體，三者混勻后煮沸10 min，取15 μL樣品進行SDS-PAGE鑒定[6]。

1.2.5目的蛋白的純化

目的蛋白的純化參照李芬等的方法[7-8]，主要步驟如下：（1）細胞粗提物的制備；（2）幾丁質(zhì)柱的平衡；（3）上樣；（4）洗柱；（5）內(nèi)含肽的自我裂解活性的誘導；（6）目的蛋白的洗脫釋放；（7）幾丁質(zhì)樹脂的再生。于 -70 ℃ 保存純化的目的蛋白。endprint

2試驗結(jié)果

2.1煙草NtTkr基因全長的克隆及酶切片段的回收

以pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒為PCR擴增模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到與NtTKR基因全長大小相符的3 582 bp大小的擴增帶（圖1）。NdeⅠ和NotⅠ酶切引入引物兩端的PCR產(chǎn)物，凝膠回收的NtTKR片段用于連接反應。

2.2原核表達載體pMXB10-NtTkr-3582的構建與鑒定

凝膠回收NdeⅠ和NotⅠ雙酶切后的pMXB10載體片段，該片段與“1.2.1”節(jié)同樣雙酶切的NtTKR片段在T4 DNA連接酶作用下進行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化并雙酶切鑒定得到與預期相符的6 675 bp的載體片段和3 582 pb的NtTKR全長（圖2），且測序無突變，這表明筆者已成功獲得正確的原核表達載體pMXB10-NtTkr-3582。

重組質(zhì)粒PMXB10-NtTkr-3582轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，轉(zhuǎn)化子經(jīng)0、0.06、0.1、0.6 mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)4 h后收集菌體，煮沸后經(jīng)12% SDS-PAGE檢測蛋白的表達。結(jié)果表明，上述3個濃度的IPTG都可誘導細胞表達分子量約160 ku的NtTkr與內(nèi)含肽的融合蛋白，其中 0.1 mmol/L IPTG誘導物目的蛋白表達量最高（圖3）。

2.4目的蛋白的純化

由于目的蛋白NtTkr-3582與原核表達載體pMXB10上的內(nèi)含肽形成融合蛋白，而DTT可通過誘導激活內(nèi)含肽的肽鍵裂解活性使目標蛋白從幾丁質(zhì)介質(zhì)上釋放出來，而內(nèi)含肽留在幾丁質(zhì)介質(zhì)上，從而純化目的蛋白。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，表達的NtTkr全長經(jīng)過幾丁質(zhì)柱純化得到分子量約132.5 ku的目的蛋白單一條帶（圖4），與預期蛋白大小相符。

3討論

已知的植物驅(qū)動蛋白多在不同組織中廣泛表達[1-3]，煙草[CM（25]新驅(qū)動蛋白NtTkr卻僅在葉和各發(fā)育時期的胚中優(yōu)勢表達[4-5]。這一組織特異性表達模式說明它可能在胚胎發(fā)生及葉組織分化過程中具有獨特的功能。欲揭示一個未知蛋白的功能，篩選與之互作的蛋白質(zhì)極其重要，因為生物體內(nèi)幾乎所有的生命活動即DNA的復制、基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白的合成或信號的轉(zhuǎn)導等，都離不開蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。通過[CM（25]對煙草幼葉cDNA文庫的酵母雙雜交篩選，得到多個與NtTkr互作的候選蛋白。由于酵母雙雜交的局限性，假陽性的存在不可避免[9-11]，候選蛋白是否真的能夠與目的蛋白發(fā)生作用必須通過Pull-Down及CoIP或免疫共定位進一步驗證[12-14]。所以，本試驗以pGBKT7-NtTkr質(zhì)粒為模板，PCR擴增煙草NtTKR全長，并將其克隆入原核表達載體pMXB10，轉(zhuǎn)入BL21（DE3），誘導其成功表達，為Pull-Down驗證該蛋白與候選蛋白互作奠定基礎。

pMXB10是經(jīng)過優(yōu)化的IMPACT原核表達載體系統(tǒng)的新成員，攜帶有大腸桿菌mal E基因，含有1個小的蛋白剪切元件，即來自釀酒酵母（Saccharomyces scerevisiae）VMA1基因的內(nèi)含肽（Sce VMA內(nèi)含肽，50 ku）[15-16]。內(nèi)含肽標簽中含有幾丁質(zhì)結(jié)合域，可以與幾丁質(zhì)珠結(jié)合，從而使融合有內(nèi)含肽與幾丁質(zhì)標簽的目的蛋白得到純化。目前，已有蛋白質(zhì)工程的許多重要領域應用了這種新型的蛋白融合表達及純化系統(tǒng)[7，17]，有諸多優(yōu)點，可非常方便地純化目的蛋白并獲得較高純度用于抗體制備的目的抗原[7-8]，因此本試驗按照經(jīng)濟實用的原則，選用該系統(tǒng)的PMXB10用于NtTkr的表達和純化，以期獲得足夠的NtTkr蛋白用于體外確定其與候選蛋白是否存在真正的相互作用。

成功構建重組原核表達載體PMXB10-NtTkr-3582后，將其轉(zhuǎn)化并誘導其表達。因為目的蛋白的可溶性、穩(wěn)定性和表達量因蛋白而異，所以誘導表達條件須依實際情況進行調(diào)整。影響蛋白表達量的因素有培養(yǎng)時間、溫度及合適的IPTG工作濃度。為使蛋白達到較大的表達量，須找到合適的IPTG工作濃度。因此，在相同溫度和誘導時間條件下，設置4個IPTG濃度，蛋白電泳檢測結(jié)果表明，IPTG為0.1 mmol/L時的表達量比0.06 mmol/L時要大，但卻和0.6 mmol/L差別不大，表明IPTG工作濃度應為0.1 mmol/L。因為當IPTG工作濃度達到0.1 mmol/L時，目的蛋白的表達量不會隨著IPTG濃度的升高而升高，而濃度低于0.1 mmol/L，表達量卻會受到影響。

在37 ℃下，以最適濃度的IPTG大量誘導細胞，4 h后收集細胞，用DTT釋放目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測，得到了與預期大小相符的NtTkr單一條帶，該高純度的目的蛋白利于以后的Pull-Down試驗的進行。

本試驗成功構建了煙草新驅(qū)動蛋白NtTKR基因全長和PMXB10載體大片段連接的融合表達載體并成功地誘導其高效表達，目的蛋白的成功表達和純化為進一步研究NtTkr與候選蛋白之間的體外互作及深入研究該蛋白的其他生物學功能奠定了堅實的試驗基礎。

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